Abstract
Studier har antydet at kjernefysisk reseptor corepressor 1 (NCOR1) kan spille en viktig rolle i kreft hos mennesker. Men de detaljerte molekylære mekanismer som fungerer det
in vivo
å påvirke kreft progresjon er ikke klart. Denne studien belyst
in vivo
handlinger NCOR1 i kreftutvikling ved hjelp av en musemodell (
Thrb
PV /PV
mus) som spontant utvikler skjoldbruskkjertelkreft.
Thrb
PV /PV
mus havn en dominant negativ thyroid hormon reseptor β (TRβ) mutant (betegnet som PV). Vi vedtok tap-av-funksjon tilnærming ved å krysse
Thrb
PV
mus med mus som globalt uttrykker en NCOR1 mutant protein (NCOR1ΔID) der reseptor interaksjon domener har blitt modifisert slik at den ikke kan samhandle med TRβ, eller PV, i mus. Bemerkelsesverdig, uttrykk for NCOR1ΔID protein redusert skjoldbrusktumorvekst, markert forsinket tumorprogresjon, og forlenget overlevelse av
Thrb
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
mus. Tumor celleproliferasjon ble hemmet av økt uttrykk av cyclin-avhengig kinase inhibitor en (p21
waf1 /cip1;
Cdkn1A
) og apoptose ble aktivert ved forhøyet uttrykk for pro-apoptotisk BCL-Associated X (
Bax
). Videre analyser viste at p53 ble rekruttert til p53-bindingssetet på den proksimale arrangøren av
Cdkn1A Hotell og
Bax
genet som en co-repressor kompleks med PV /NCOR1 /histon deacetylas- 3 (HDAC-3), som fører til undertrykkelse av
Cdkn1A
samt
Bax
genet i thyroids av
Thrb
PV /PV
mus. I thyroids av
Thrb
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
mus, p53 /PV-komplekset ikke kunne rekruttere NCOR1ΔID og HDAC-3, som fører til de-undertrykkelse av både gener for å hemme kreft progresjon. De foreliggende studiene gitt direkte bevis
in vivo Hotell som NCOR1 kunne fungere som et onkogen via transkripsjonsregulering i en musemodell av skjoldbruskkjertelkreft
Citation. Fozzatti L, Park JW, Zhao L, Willingham MC, Cheng Sy (2013) Oncogene Handlinger av Nuclear Receptor Corepressor (NCOR1) i en musemodell av skjoldbruskkjertelen. PLoS ONE 8 (6): e67954. doi: 10,1371 /journal.pone.0067954
Redaktør: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, USA
mottatt: 28. mars 2013, Godkjent: 23 mai 2013; Publisert: 26 juni 2013
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Finansiering:. Den nåværende forskningen ble støttet av egenutført Research Program ved Senter for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
thyroid hormonreseptorer (TRS) er kritiske i formidling av genomiske handlinger av skjoldbruskkjertel hormon (T3) i vekst, utvikling, differensiering, og opprettholde metabolsk homeostase. To TR gener, α og β, som ligger på to forskjellige kromosomer, kode tre store T3 binding TR isoformer (α1, β1, og p2). Studier ved hjelp av genmodifiserte mus viste at
in vivo
, TR isoformer har felles funksjoner, men kan også utøve isoform avhengige handlinger i målet vev [1], [2]. Transkripsjonen aktivitet av TR reguleres på flere nivåer. I tillegg til regulering av T3 og typer av DNA bindende elementer i arrangører av målgener, transkripsjonen aktivitet av TR er finjustert av en rekke atom coactivators og corepressors [3], [4]. I fravær av T3, rekrutterer unliganded TR atom reseptor corepressor 1 (NCOR1) og kjernefysisk reseptor corepressor 2 /lyddemping mekler for retinoid og thyroid hormonreseptorer (NCOR2 /SMRT) for transkripsjonen undertrykkelse. Binding av T3 fører til en konformasjonsendring i TR som frigjør NCOR1 /NCOR2 kompleks og åpner for rekruttering av en multiprotein coactivator kompleks for transkripsjonen aktivering [5].
Det viktige regulerende rolle NCOR1 i receptor handlinger er tydelig i dens avvikende interaksjon med reseptorer underliggende humane sykdommer, slik som resistens overfor skjoldbrusk hormon (RTH) [6], [7] og lipodystrophic alvorlig insulinresistens [8]. RTH er forårsaket av mutasjoner i
THRB
genet [9], [10]. Mutasjoner av peroksisomproliferatoraktiverende aktivert reseptor γ (
PPARy)
føre til lipodystrophic alvorlig insulinresistens [8]. I tillegg avvikende samspillet NCOR1 /SMRT med smeltet genprodukter av retinsyre reseptor alfa genet (
RARα)
eller med promyelocytic leukemi genet (
PML
) (PML-RAR- α) eller med den promyelocytisk leukemi sink-finger-genet (
PLZF
) (PLZF-RAR-α) resulterer i blokkering av myeloid differensiering [11]. Involvering av NCOR1 i andre menneskelige kreftformer som brystkreft og kreft i urinblæren ble demonstrert av et nært samarbeid med NCOR1 unormal uttrykk med kreftutvikling [12], [13], [14], [15]. Nyere studier av Kreft Genome Atlas (TCGA) Research Network avdekket også homozygot genet sletting av NCOR1 hos noen pasienter med tykktarm og endetarm adenokarsinom [16], prostata adenokarsinom [17], ovarialcancer [18] eller leveren leverkreft (upublisert-Provisional i TCGA data base). Videre nonsense mutasjoner og skjøte varianter av
NCOR1
ble også funnet hos pasienter med brystkreft [19]. Selv om disse assosiasjonsstudier hevet muligheten for at NCOR1 kan handle for å påvirke kreft progresjon, direkte bevis for sine roller i kreftutvikling
in vivo
mangler fortsatt.
Tilgjengeligheten av en musemodell som spontant utvikler metastatisk follikulær skjoldbruskkjertelkreft (FTC) gitt oss et kraftig verktøy for å vurdere hvilken rolle NCOR1 i kreftutvikling og progresjon.
Thrb
PV /PV
mus havner en Knockin dominant negativ mutasjon, kjent som PV, i
Thrb
genet locus [20]. PV-mutasjon ble identifisert i en pasient som lider av motstand mot thyroid hormon [21]. Som
Thrb
PV /PV
mus alder, deres thyroids gjennomgå patologiske endringer fra hyperplasia til kapsel og vaskulær invasjon, anaplasia, og eventuell spredning til lungene [22]. Den patologisk progresjon, rute, og hyppigheten av metastaser i
Thrb
PV /PV
mus er lik som i menneskelig FTC. Omfattende molekylære analyser av endrede signalveier viser at, som finnes i menneskelig FTC,
Thrb
PV /PV
mus utviser avvikende signalveier som inkluderer konstitutiv aktivering av fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K) /Akt [ ,,,0],23], [24] og integrin-Src-MAPK signalering [25] og avvikende oppbygging av den oncogene hypofysetumor transgenet protein (PTTG) [26], [27] og P-catenin [28]. Dermed blir
Thrb
PV /PV
musemodell trofast sammenfatter de molekylære avvik som finnes i menneskelig skjoldbruskkjertelen, og er faktisk en preklinisk musemodell for FTC.
I de nåværende studier, vi vedtok tap-av-funksjon tilnærming ved å krysse
Thrb
PV
med mus som globalt uttrykker en NCOR1 mutant protein (NCOR1ΔID). I denne NCOR1ΔID mutant protein, to mest aminoterminale reseptor interaksjon domener betegnes RID 3 og RID2, mangler. Dette mutant kan ikke forbinder med TR, som RID3 er absolutt nødvendig for NCOR1-TR interaksjon [29], [30], [31]. Konsekvent, viste vi også at NCOR1ΔID mutant protein ikke kan samhandle med TRβPV
in vivo product: [32]. Den manglende interaksjon mellom TRβPV med NCOR1ΔID resulterer i forbedring av symptomer på resistens mot hormonet tyroksin i
Thrb
PVNcor1
ΔID /ΔID
mus, indikerer at NCOR1 regulerer den dominerende negative virkningen av TRβ mutanter
in vivo product: [32].
den nåværende studier viser at uttrykket av NCOR1ΔID i skjoldbrusk av
Thrb
PV /PV
mus hemmet tumorvekst, forlenget overlevelse, og forsinket kreft progresjon. Tumorcelle-proliferasjon ble inhibert med den økte ekspresjon av cyklin-avhengig kinase inhibitor 1 (p21 /WAF1;
Cdkn1A
), og apoptose ble indusert ved den aktiverte ekspresjon av Bcl-2-assosiert X-protein (
BAX
). Både
Cdkn1A Hotell og
BAX
gener er direkte nedstrøms målgener av svulsten suppressor, p53. Detaljerte molekylære analyser viste at mangelen på reseptor-interaksjon domene i NCOR1ΔID førte til en manglende evne til p53 /PV-komplekset for å rekruttere NCOR1 /histon-deacetylase-3-repressor-komplekset til promoterene fra disse målgener, noe som resulterer i økt undertrykkelse av disse genene til hemme kreft progresjon. Denne studien gitt direkte bevis
in vivo
å demonstrere at NCOR1 kunne fungere som et onkogen via transkripsjonsregulering i skjoldbruskkjertelen karsinogenese i en musemodell.
Materialer og Metoder
musestammer
den dyrestudie ble utført i henhold til protokollen er godkjent av National Cancer Institute Animal Care og bruk komité. Mus skjuler
Thrb
PV
genet (
Thrb
PV
mus) ble utarbeidet og genotypet som beskrevet tidligere [20].
Thrb
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
mus ble avlet ved først å krysse
Thrb
+ /+ Ncor1
ΔID /+
mus [29] med
Thrb
PV /+
mus og deretter ved å krysse
Thrb
PV /+ Ncor1
ΔID /ΔID
mus med
Thrb
PV /+ Ncor1
ΔID /ΔID
mus [32]. Mus med forskjellige genotyper anvendt i denne undersøkelsen var intercrossed flere generasjoner, og kullsøsken med en lignende genetisk bakgrunn ble anvendt i alle forsøk. Musene ble fulgt til de var døende, og derfor avlives. Thyroids og annet vev ble samlet inn fra
Thrb
PV /PVNcor1
+ /+
mus og
Thrb
PVPVNcor1
ΔID /ΔID
mus for veiing, histologisk analyse, og molekylære og biokjemiske studier.
RNA Isolation og kvantitativ real-time RT-PCR
Total RNA ble ekstrahert fra thyroids av mus ved bruk TRIzol (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. Kvantitativ real-time RT-PCR ble utført med en Quantitect SYBR Grønn RT-PCR (Qiagen, Valencia, CA), i henhold til produsentens instruksjoner og bruke en LightCycler termosykler (Roche Diagnostics). Total-RNA (200 ng) ble anvendt i RT-PCR-bestemmelser som tidligere beskrevet [33]. De spesifikke primere var som følger:
mp21
fremover, 5′-CGCCGCGGTGTCAGAGTC-3 «og omvendt, 5′-GCAGCAGGGCAGAGGAAG-3»;
mBax
fremover, «-CCACCAGCTCTGAACAGATC-3′ og omvendt, 5»-CAGCTTCTTGGTGGACGCAT-3 «;
mp53
fremover, 5′-AGAGACCGCCGTACAGAAGA-3 «og omvendt, 5′-CTGTAGCATGGGCATCCTTT-3».
Western Blot Analysis and Co-immunoprecipitation
Nuclear ekstrakter av thyroids ble fremstilt som tidligere beskrevet [32]. Proteinprøver (25 ug) ble analysert ved hjelp av Western blot som tidligere beskrevet [28]. Anti-fosforylert retinoblastom protein (pRb) (Ser780, # 9307) og PUMA (# 7467) var fra cellesignalisering Technologies (Beverly, MA) (1:500 fortynning), anti-cyclin D1 (sc-450), BAX (sc -7480), Rb (sc-50), p21 (sc-6246) og p27 (sc-1641) antistoffer ble innkjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, California) og brukes på en 1:200 fortynning. Anti-p53 antistoffer (OP03) var fra Calbiochem (1:500 fortynning). Band intensiteter ble kvantifisert ved hjelp av NIH IMAGE programvare (ImageJ 1,34 s, Wayne Rasband, NIH).
For co-immunoprecipitation å vise fysisk interaksjon av p53 med PV, 0,5 mg av totalt skjoldbrusk ekstrakter ble først inkubert over natten med kanin anti-TR (Kode 600-401-A96, Rockland) i Tris-bufret saltvann-0,6% NP-40 med proteasehemmere (Roche) ved 4 ° C. Prøvene ble deretter blandet med 20 ul protein A-agarose (Roche) ved 4 ° C i 2 timer, og kulene ble vasket fem ganger med TBS-0,6% NP-40 inneholdende proteaseinhibitorer. Bundede proteiner ble analysert ved hjelp av Western blot-analyse ved å bruke antistoffer til p53 (OP03, Millipore, Inc.,) ved en fortynning 1:500 og anti-NCOR1 (PHQQ; 2 ug /ml). [32]
Histologisk analyse
Skjoldbruskkjertelen kjertelen~~POS=HEADCOMP, lunge, hjerte og ble dissekert, fiksert i 10% nøytral buffret formalin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), og deretter innstøpt i parafin. Deler av 5-mikrometer tykkelse ble utarbeidet og farget med hematoxylin og eosin (H E). For hvert dyr, ble enkelt tilfeldige seksjoner gjennom skjoldbruskkjertelen, gjennom lungene, og gjennom hjertet undersøkt.
Immunhistokjemi
IHC ble utført som tidligere beskrevet med en viss modifikasjon [25]. Formalin-fikserte paraffin-thyroid snitt ble deparaffinized, rehydratisert, oppvarmet til 98 ° C i 0,05% citrakonsyreanhydrid, pH 7,4 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) i 1 time og deretter blokkert i 1 time i 2% normalt geite serum ved romtemperatur. Etter vasking i fosfat-bufret saltvann, ble objektglass inkubert ved 4 ° C over natten med Ki-67 primære antistoff (1:300 fortynning, Thermo Scientific, Fremont, CA, # RB-9043-P0). Etter vasking, ble objektglass inkubert med geite-anti-kanin-sekundært antistoff i 1 time ved romtemperatur og vasket i fosfat-bufret saltløsning. Objektglass ble deretter inkubert i 3,3′-diaminobenzidene (DAB substrat for peroksydase kit, Vector Laboratories, Burlingame, CA, SK-4100), og etter farging utvikling, de ble motfarget i Gill Hematoxylin, skyllet og montert i Permount (Fisher Scientific , Pittsburgh, PA). Den proliferative indeksen ble beregnet som prosentandelen av Ki-67-positive kjerner til det totale antall kjerner i skjoldbruskkjertelen delen. Telle ble utført ved hjelp av National Institutes of Health (NIH) IMAGE programvare (ImageJ 1,34 s, Wayne Rasband, NIH, Bethesda, MD).
Chromatin Immunpresipitasjon (chip) Analyse
brikken analysen var utføres ved hjelp av kromatin DNA preparert fra skjoldbruskkjertelen svulster (50 mg /analyse) av
Thrb1
PV /PVNcor1
+ /+
mus og
Thrb1
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
mus, som tidligere beskrevet [34]. Den immunopresipitert-DNA i 50 ul TE og kvantitativ PCR ble utført med 7900HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems) ved hjelp QuantiFast SYBR Grønn RT-PCR Kit (204154, QIAGEN). Anrikningen i signalene ble beregnet som immunoutfellingsstudier signaler versus helcelle lysat-innganger. De fold endringer av skjoldbruskkjertelsvulster av
Thrb1
PV /PVNcor1
+ /+
eller
Thrb1
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
ChIP ble normalisert etter negativ kontroll (muse-IgG). Brikken primere som ble brukt var
Cdkn1A
fremover, 5’TTTCTATCAGCCCCAGAGGA-3 «; og omvendt, 5’TCACCCCACAGCTGGTAGTT-3 «og
Bax
fremover, 5’GGGGCGCGCGGATCCATTCC-3′; og omvendt, 5’GCTTCTGATGGACAGGGGGC-3 «.
Statistical Analysis
Alle data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. Forskjeller mellom gruppene ble undersøkt for statistisk signifikans ved hjelp av Student
t
test med bruk av GraphPad Prism 4.0a (GraphPad programvare); p 0,05 regnes som statistisk signifikant
Resultater
NCOR1ΔID Forlenger Survival og Forsinkelser Thyroid kreftutvikling av
Thrb
PV /PV
Mus
. har tidligere vist at
Thrb
PV /PV
mus har høy dødelighet forårsaket av FTC [22]. Vi overvåkes effektene av uttrykket av NCOR1ΔID på skjoldbruskkjertelen kreftutvikling ved først å sammenligne overlevelsen av
Thrb
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
mus med at av
Thrb
PV /PVNcor1
+ /+
mus. Musene ble fulgt til de var døende med tegn på håndgripelig svulster, hurtig vekttap, trakk på positurer, og anstrengt pust. Figur 1A viser at
Thrb
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
mus overlevde betydelig lengre (p 0,01; 50% overlevelse alder: 11,3 år, n = 29) enn
Thrb
PV /PVNcor1
+ /+
mus (50% overlevelse alder: 9,3 måneder, n = 58) i løpet av 15-måneders observasjonsperioden. Figur 1B viser at uttrykket av NCOR1ΔID ført til en betydelig 35% reduksjon i skjoldbruskkjertelen vekt i
Thrb
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
mus (datasett 2 mot 1; p 0,0001 ).
(A) Kaplan-Meier overlevelseskurver for
Thrb
PV /PVNcor1
+ /+ Hotell og
Thrb
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
mus opp 15 måneders alder.
Thrb
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID product: (n = 29) overlevde betydelig lengre enn
Thrb
PV /PVNcor1
+ /+
mus (n = 58) (
p
0,0001). (B) thyroids av
Thrb
PV /PVNcor1
+ /+ Hotell og
Thrb
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
mus i alderen 5 -15 måneder ble dissekert og veiet. Dataene er presentert som forholdene mellom skjoldbruskvekt til kroppsvekt. Forskjellene mellom skjoldbrusk vekter av
Thrb
PV /PVNcor1
+ /+ Hotell og
Thrb
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
mus var signifikant (
p
0,0001), som bestemmes av Student
t
-test analyse
effekten av NCOR1ΔID på patologisk progresjon ble vurdert av histopatologiske analyser som.
Thrb
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
mus alderen. Figur 2A viser representative patologiske trekk ved thyroids og lungene fra 3 til 15 måneder gamle
Thrb
PV /PVNcor1
+ /+ Hotell og
Thrb
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
mus (venstre og høyre kolonner, henholdsvis). I thyroids av
Thrb
PV /PVNcor1
+ /+
mus i en alder av 7 måneder, avansert vaskulær invasjon og samlings anaplasia ble ofte observert (piler i figur 2AA og 2AC, henholdsvis) . Videre lungemetastaser (Figur 2AE, piler) var hyppig i
Thrb
PV /PVNcor1
+ /+
mus. I
Thrb
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
mus, men vaskulær invasjon ble sjelden observert (figur 2AB), men uten påvisbare anaplasia (figur 2Ad) og en markert reduksjon i forekomsten av lungemetastaser (figur 2AF). Disse pathohistological observasjonene er oppsummert i figur 2B. I yngre alder av 3-5 måneder, ble det observert en lavere forekomst av kapsel invasjon (~ 20%) for
Thrb
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
mus enn for
Thrb
PV /PVNcor1
+ /+
mus (figur 2BA), men en lignende hendelse frekvens av kapsel invasjonen ble påvist for både muterte musene i eldre alder ( 7 måneders alder). Ingen vaskulære invasjon, anaplasia eller lungemetastaser ble funnet i
Thrb
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
mus (figur 2BB, c og d) i yngre aldersgrupper av 3-5 måneder. For mus eldre enn 7 måneder, hyppigheten av vaskulær invasjon, anaplasia, og lungemetastaser var 80%, 15% og 60%, henholdsvis for
Thrb
PV /PVNcor1
+ /+
mus (figur 2BB, c og d). Men forekomsten av vaskulær invasjon og lungemetastaser var 14% og 10%, henholdsvis for
Thrb
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
mus, uten forekomst av anaplasia. Samlet utgjør disse resultatene indikerer at uttrykket av NCOR1ΔID forsinket skjoldbrusk kreft progresjon og blokkerte tap av differensiering (anaplasia) i
Thrb
PV /PV
mus.
(A) Hematoxylin og eosin (H e) farging av skjoldbrusk seksjoner (øvre og midtre rader) og lunge seksjoner (nederste rad) av
Thrb
PV /PVNcor1
+ /+ plakater (a, c og e ) og
Thrb
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID plakater (b, d, og f) mus. Histologiske seksjoner fra vev av
Thrb
PV /PVNcor1
+ /+
mus viste bevis for (a) vaskulær invasjon i skjoldbruskkjertelen (pil), (c) anaplasia i skjoldbruskkjertelen (piler), og (e) metastatiske lesjoner i lunge (piler). Deler av thyroids og lunger fra
Thrb
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
viste blodårene (b) uten vaskulær invasjon (pil), (d) uten anaplasia, og (f) lunge uten metastatiske lesjoner. (B) Sammenligning av aldersavhengig prosent forekomst av kapsel invasjon (a), vaskulær invasjon (b), anaplasia (c), og lungemetastaser (d). Dataene er uttrykt som prosentandelen av forekomsten av det totale mutante mus undersøkt. Symbolet «#» indikerer 0% forekomst.
NCOR1ΔID Reduserer Thyroid Vekst ved å hemme celleproliferasjon i
Thrb
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
Mus
Det faktum at skjoldbrusk vekst ble redusert i
Thrb
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
mus (figur 1B) bedt oss å spørre om thyroid tumor celleproliferasjon ble hemmet. Vi undersøkte derfor protein overflod av kjernefysisk spredning markør, Ki-67, ved immunhistokjemisk analyse. Figur 3A.I-en og -b viser representative eksempler på intensiv atom flekker i thyroids av to
Thrb
PV /PVNcor1
+ /+
mus. I kontrast, færre kjerner ble immuno-farget med Ki-67 spredning markør i thyroids av
Thrb
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
mus (Figur 3A.Ic og d, n = 2 ). Celler med Ki-67 immuno-fargede kjerner ble tellet, og de kvantitative data er vist i figur 3A.II. Den kvantitative analysen viser at antall skjoldbrusk celler med Ki-67 farget kjerner var 50% lavere i
Thrb
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
mus enn i
Thrb
PV /PVNcor1
+ /+
mus, noe som indikerer redusert celleproliferasjon i skjoldbrusk av
Thrb
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
mus.
( AI) to representative mikrofotografier av farget Ki-67 på skjoldbrusk deler av
Thrb
PV /PVNcor1
+ /+ product: (a og b representerer to forskjellige mus) og
Thrb
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
mus (c og d representerer to forskjellige mus). I thyroids av
Thrb
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
mus, færre skjoldbrusk celler ble farget med Ki-67 enn i thyroids av
Thrb
PV /PVNcor1
+ /+
mus (piler). (A.II) Positively atom Ki-67-farget skjoldbrusk celler fra
Thrb
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID Hotell og
Thrb
PV /PVNcor1
+ /+
mus ble talt og uttrykt som prosentandel av totale celler. Prosentandelen av prolifererende celler var betydelig lavere i thyroids av
Thrb
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
enn
Thrb
PV /PVNcor1
+ /+
mus. (BI) Nuclear proteinekstrakter ble fremstilt fra skjoldbruskkjertelen svulster
Thrb
PV /PVNcor1
+ /+
(banene 1 og 2) eller
Thrb
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
(banene 3 og 4) mus. Western blot-analyse av cyclin D1, fosforylert Rb, total Rb, p21 og p27 er som markert, og aktin (felt f) ble anvendt som kontroll lasting. (B.II) Kvantifisering av bandet intensiteter vist i (B.I). Protein Forekomsten av cyclin D1 og fosforylert Rb var lavere i thyroids av
Thrb
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
mus, mens protein overflod av p21 og p27 var høyere i de thyroids av
Thrb
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
mus.
Dette funnet ble også støttet av den biokjemiske analyse der proteinet overflod av en nøkkel cellesyklus regulator , cyclin D1, var markert lavere i thyroids av
Thrb
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
mus (figur 3B.I, panel en, baner 3 4) enn i
Thrb
PV /PVNcor1
+ /+
mus (baner 1 2). Dessuten reduseres cyclin D1 førte til et lavere protein overflod av fosforylert retinoblastom protein (pRb) (figur 3B.I, panel b, sammenlign spor 1 2 med baner 3 4) uten å endre den totale Rb protein nivåer (panel c). Reduksjonen i den fosforylerte Rb hindret progresjonen av cellesyklusen fra G1 til S-fasen. Konsekvent, protein overflod av cyclin-avhengig kinase inhibitor p21 og p27 (figur 3B.I, paneler d og e, henholdsvis) var også lavere i thyroids av
Thrb
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
mus enn i
Thrb
PV /PVNcor1
+ /+
mus (sammenlign spor 3-4 til baner 1-2). De kvantitative data for båndintensitetene er vist i figur 3B.II. Samlet indikerer disse resultater at ekspresjonen av NCOR1ΔID førte til inhibering av tumorcellevekst, delvis, ved å forsinke G1-S cellesyklusprogresjon.
enten apoptose bidro også til redusert thyroid tumorvekst vist i figur 1B ble også vurdert ved å undersøke viktige regulatorer av apoptose. Proteinet overflod av BCL-2-forbundet X protein (BAX), som fremmer apoptose, var høyere i thyroids av
Thrb
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
mus enn i
Thrb
PV /PVNcor1
+ /+
mus (figur 4AA, sammenlign spor 3 og 4 med 1 2). PUMA, som er en BH3 (BCL-2 homologi domene 3) -bare protein som induserer apoptose gjennom mitokondriene vei, var også høyere i thyroids av
Thrb
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
mus enn i
Thrb
PV /PVNcor1
+ /+
mus (figur 4AB, sammenlign spor 3 og 4 med 1 2). De kvantitative bandet intensiteter er vist i figur 4BA, noe som indikerer en 2-ganger økning i BAX og PUMA proteinnivå. Videre vil den økte spaltes caspase 3 (figur 4A, panel b, sporene 3 og 4) og den reduserte total poly ADP-ribose polymerase (PARP), men øket spaltet PARP (panel c, øvre bånd og nedre band, henholdsvis i baner 3 4) i
Thrb
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
mus sammenlignet med
Thrb
PV /PVNcor1
+ /+
mus var indikasjon på forhøyet apoptotiske aktivitet i skjoldbruskkjertelen kreftceller av
Thrb
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
mus (se også kvantitative data i figur 4BB). Disse resultatene tyder på at i tillegg til å forsinke G1-S cellecyklusprogresjonen, økt apoptose aktivitet i thyroids av
Thrb
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
mus har også bidratt til å senke skjoldbrusk vekst.
(A) Atomproteinekstrakter ble fremstilt fra skjoldbruskkjertelen svulster
Thrb
PV /PVNcor1
+ /+
(banene 1 og 2) eller
Thrb
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
(banene 3 og 4) mus. Vist er Western blot analyser av BAX (panel a), Puma (panel b), spaltet caspase 3 (felt c), PARP og spaltet PARP (felt d), og aktin lasting kontroll (felt e). (B) Kvantitering av båndintensitetene som er vist i (A). * P 0,05 Protein overflod av BAX og PUMA (panel a), kløyvde caspase 3 og kløyvde PARP (panel b) var signifikant høyere og total PARP (panel b) var lavere i thyroids av
Thrb
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
mus.
Hemming av tumorvekst ved aktivering av p53-signalveien i thyroids av
Thrb
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
Mus
funnene som protein Forekomsten av p21 og BAX ble endret som vist ovenfor bedt oss om å undersøke om deres uttrykk på mRNA-nivået ble også berørt. Ja, vi fant ut at
Cdkn1A product: (
p21
WAF1
) mRNA nivåene var signifikant høyere i skjoldbruskkjertelen av
Thrb
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
mus enn i
Thrb
PV /PVNcor1
+ /+
mus (figur 5A, bar to vs. bar 1). Tilsvarende
Bax
mRNA nivået var høyere i skjoldbrusk av
Thrb
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
mus enn i
Thrb
PV /PVNcor1
+ /+
mus (figur 5B, bar 4 vs. bar 3). Disse to gener er direkte regulert av p53 [35], [36]. Vi antok derfor at å endre aktiviteten til p53 i thyroids av
Thrb
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
mus ville føre til aktivering av transkripsjon av
Cdkn1A Hotell og
Bax
gener. Vi først undersøkt om uttrykket av p53 mRNA og protein ble endret, og dermed endre aktivitet i skjoldbruskkjertelen av
Thrb
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
mus. Vi har funnet at ekspresjonen av NCOR1ΔID hadde ingen effekt på ekspresjonen av p53 på mRNA-nivå (stenger 5 og 6, Figur 5A). I tillegg fant vi at protein overflod av p53 var tilsvarende lav i skjoldbrusk av
Thrb
PV /PVNcor1
+ /+ Hotell og
Thrb
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
mus (figur 5B, øvre panel, kolonnene 3 og 4, henholdsvis). Derfor, jo høyere
Cdkn1A Hotell og
Bax
mRNA nivåer var ikke på grunn av aktivering av p53 transkripsjon aktivitet ved forhøyet p53 protein uttrykk. Fordi det er tidligere blitt vist at vill type TR-fysisk kontakt med p53 og negativt regulerer transkripsjonen aktivitet av p53 [37], [38], vi neste utforsket muligheten for at aktiviteten av p53 kan bli endret via interaksjon med PV i thyroids av mutante mus. Co-immunpresipitasjonsanalyse viste at PV var assosiert med p53 i skjoldbrusk av
Thrb
PV /PVNcor1
+ /+
mus (figur 5B, øvre panel, spor 1). PV var også på samme måte forbundet med p53 i skjoldbrusk av
Thrb
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
mus (figur 5B, øvre panel, kolonne 2). Viktigere, co-immunoprecipitation viste videre at PV var også assosiert med NCOR1 i skjoldbruksatom ekstrakter av
Thrb
PV /PVNcor1
+ /+
mus (figur 5B, nedre panel, kjørefelt 1) , men ikke samhandle med NCOR1ΔID i skjoldbruksatom ekstrakter av
Thrb
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
mus (spor 2). Kolonnene 3 og 4 viser at en tilsvarende mengde av NCOR1 og NCOR1ΔID, henholdsvis, ble detektert ved direkte Western blot-analyse (figur 5B, nedre panel). Disse data indikerer at PV interaksjon med p53 og NCOR1 i et ternært kompleks (p53 /PV /NCOR1) i skjoldbruskkjertelen av
Thrb
PV /PVNcor1
+ /+ mus
, men dannes bare en p53 /PV kompleks i skjoldbruskkjertelen av
Thrb
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
mus.
(A) Aktivert uttrykk for
Cdkn1A Hotell og
Bax
gener i skjoldbrusk av
Thrb
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
mus. Kvantitativ real-time RT-PCR ble utført som beskrevet i metoder og materialer. Hver thyroid prøve ble kjørt i tre paralleller med totalt antall mus 3-5. Forskjellene i uttrykket er betydelige i uttrykket av
Cdkn1A
(banene 1 og 2) og
Bax
gener (banene 3 og 4) mellom
Thrb
PV /PVNcor1
+ /+ Hotell og
Thrb
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
mus (banene 5 og 6). (B) Co-immunoprecipitation av PV med p53 og NCOR1 i skjoldbruskkjertelen av
Thrb
PV /PVNcor1
+ /+
mus (spor 1), men ikke med NCOR1ΔID i skjoldbruskkjertelen ekstrakter av
Thrb
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
mus (spor 2). Lanes 3 og 4 viser p53 band (øvre panel) og NCOR1 og NCOR1ΔID fra direkte Western blot analyse fra skjoldbruskatom ekstrakter av
Thrb
PV /PVNcor1
+ /+ Hotell og
Thrb
PV /PVNcor1
ΔID /ΔID
mus, henholdsvis. (C og D) Rekruttering av PV og NCOR1 til p53 /DNA-bindingsseter på arrangøren av
Cdkn1A
genet (C) og
Bax
genet (D). ChIP Analysen ble utført ved anvendelse av IgG (stavene 1 og 6) eller anti-p53 (barer 2 og 7) eller anti-PV (barer 3 og 8) eller anti-NCOR1 (barer 4 og 9), eller anti-HDAC-3 ( barer 5 og 10) antistoffer som beskrevet i
Metoder og materialer
. Bindingen ble uttrykt som fold av endringer i henvisninger til den negative kontrollen som mus IgG ble brukt i immunoprecipitation * p. 0,05, og *** p 0,001. NS, ikke signifikant.
Funnene som
Cdkn1A Hotell og
Bax
mRNA var høyere i skjoldbrusk av
Thrb
PV /PVNcor1 <
