Abstract
Prostatakreft (PCA) er for tiden den hyppigst diagnostisert kreft i de vestlige landene. Det er mer utbredt blant eldre menn med 75% av hendelsen tilfeller over 65 år gammel. Etter radikal prostatektomi, ca 30% av menn utvikler klinisk tilbakefall med forhøyet serumprostataspesifikt antigen nivåer. Derfor er det viktig å løse de molekylære mekanismer som ligger under PCa progresjon for å utvikle nye diagnostiske /terapeutiske tilnærminger. I denne studien er det forsøkte å sammenligne mikroRNA (miRNA) profilen til tilbakevendende og ikke-tilbakevendende prostata tumorvev å utforske mulige involvering av miRNAs ved PCA progresjon. Total RNA fra 41 tilbakevendende og 41 engangsprøver PCA vev ble brukt for å undersøke miRNA signatur i PCA prøver. Først av alt, ble 20 tilbakevendende og 20 ikke-tilbakevendende PCA prøver profilert bruker miRNA microarray chips. Av de forskjellig uttrykt mirnas, ble MIR-1, MIR-133b og MIR-145 * valgt for ytterligere validering med QRT-PCR i et annet sett med 21 gjennomgående og 21 engangs PCA prøver. Data ble statistisk analysert ved hjelp av tosidig t-test, Pearson korrelasjon test, mottaker opererer karakteristisk analyse. Våre resultater viser at Mir-1 og mir-133b har blitt betydelig nedregulert i tilbakevendende PCa eksemplarer i forhold til engangs PCA prøver og har nok strøm til å skille tilbakevendende prøver fra engangs de på egenhånd. Her rapporterer vi at den relative uttrykk for MIR-1 og mir-133b har blitt betydelig redusert i tilbakevendende PCa eksemplarer i forhold til engangs PCA prøver, som kan tjene som nye biomarkører for prediksjon av PCa progresjon.
Citation: Karatas AV, Guzel E, Suer jeg, Ekici ID, Caskurlu T, Creighton CJ, et al. (2014) MIR-1 og MIR-133b Er forskjellig uttrykt i pasienter med residiverende prostatakreft. PLoS ONE 9 (6): e98675. doi: 10,1371 /journal.pone.0098675
Redaktør: Xin Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kina
mottatt: 13 mars 2014; Godkjent: 30 april 2014; Publisert: 26 juni 2014
Copyright: © 2014 Karatas et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Array data har blitt deponert i Gene Expression Omnibus (GEO) under tiltredelse antall GSE55323
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av den vitenskapelige og teknologiske Forskningsrådet Tyrkia (TUBITAK) (tilskudd nummer 108S051), samt som delvis av USAs National Institute of Health (CJC og MI, stipend P30 CA125123). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. CJC er en PLoS ONE Editorial Board medlem og dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE redaksjonelle retningslinjer og kriterier.
Innledning
Prostatakreft (PCA) er for tiden den mest diagnostisert kreft og den nest største årsaken til kreft dødsfall blant menn over en alder av 50 år i vestlige land [1]. PCA har en tilbøyelighet til å være mye mer utbredt i eldre menn med 75% av hendelsen tilfeller over 65 år gammel [2]. Radikal prostatektomi, radikal strålebehandling og hormonbehandling terapi blir fortrinnsvis anvendt teknikker for tidlig stadium klinisk lokalisert svulster å kurere sykdommen, men disse teknikkene ikke nødvendigvis gir økt overlevelse [3] og nesten 30% av menn utvikler klinisk tilbakefall med økt prostata-spesifikt antigen (PSA) nivåer i serum [4]. På den annen side, for avansert og metastatiske tumorer, kjemoterapi, som er den eneste mulighet, for det meste ikke gir positiv klinisk utfall [5]. Derfor er det av stor betydning å forstå de molekylære mekanismene bak prostata kreft progresjon for å utvikle nye diagnostiske og terapeutiske tilnærminger.
microRNAs (miRNA) er endogent syntetisert, regulatoriske ikke-kodende små RNA består av rundt 20 nukleotider og vurderes som en ny klasse av gen-regulatorer. De undertrykker ekspresjon av sine mål via mRNA degradering eller translatorisk inhibering som et resultat av ufullstendig binding til de 3’untranslated regionene (3’UTR) av mRNA [6]. Mirnas er ment for å regulere ekspresjonen av nesten 60% av humane gener [7]. Omtrent halvparten av de kommenterte menneskelige mirnas ligger i sårbare områder av genomet som tyder på at disse små molekyler kan ha en viktig funksjon i patogenesen av flere sykdommer, inkludert kreft [8], [9]. De er blitt vist å være i stand til å skille mellom differensieringstilstander av flere maligniteter, inkludert bryst, lunge og tykktarm kreft. I tillegg er det undersøkelser, som viser miRNA ekspresjonsanalyse kan skille ondartet fra ikke-ondartet prostata vev [10], [11]. Det er imidlertid et begrenset antall rapporter i litteraturen studert mirnas i prostata kreft progresjon.
miRNA profilering gjennom mikromatriser er en uvurderlig teknikk for å bestemme en miRNA signatur, som nødvendigvis er viktig å finne ut av generell og spesifikke uttrykk endringer mellom forskjellige typer av vev [12], [13]. I denne studien ønsket vi å sammenligne miRNA profilen til tilbakevendende og ikke-tilbakevendende prostata tumorvev for å belyse på en mulig involvering av miRNAs ved PCA progresjon.
Materialer og metoder
Pasienter
RNA ble isolert fra 41 tilbakevendende og 41 ikke-tilbakevendende kreft fra radikale prostatectomies, som inneholdt minst 70% svulstvev, som ble hentet fra Baylor College of Medicine Prostate Cancer program. Gjentagelse ble definert som to påfølgende serum PSA større enn 0,2 ng /ml. Pasientene ble fulgt i inntil PSA tilbakefall eller minst 4 år (for ikke-tilbakevendende tilfeller). Denne studien har blitt godkjent av en intern Institutional Review Board of Baylor College of Medicine. Pasientene ble inkludert i studien ved å gi sitt skriftlige samtykke. Egenskapene til de tilbakevendende og ikke-tilbakevendende pasienter er oppsummert i tabell 1.
Total RNA Isolation
Total RNA fra 41 tilbakevendende og 41 prøver engangs vev ved hjelp Trizol (Invitrogen , San Diego, California) reagens i henhold til produsentens instruksjoner. De renhet og konsentrasjoner av RNA prøver ble bestemt spektrofotometrisk ved hjelp av Nanodrop ND-2000c (Thermo Fisher Scientific, Inc., Wilmington, DE). RNA integritet ble testet ved hjelp av gel elektroforese og Spot Sjekk nukleinsyrekvantifisering Kit (Sigma).
miRNA microarray og dataanalyse
100 ng av total RNA fra 20 tilbakevendende og 20 ikke-tilbakevendende prøvene er merket med Cy3 ved hjelp Agilent miRNA merking kit etter produsentens protokoll. Merket RNA er varme denaturert og hybridisert til Agilent 8 × 15 k miRNA microarray V2 består av 799 prober rettet mot et omfattende utvalg av 723 mennesker og 76 menneskelige virus mirnas med kontroll sonder fra Sanger miRBase (slipper 10,1) ved 55 ° C i 20 timer. Etter hybridisering og post-hybridisering vasker, ble lysbilder skannes umiddelbart i Agilent microarray Scanner med Surescan High Resolution Technology (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Feature Extraction v10.7.3.1 (Agilent Technologies, CA) programvare ble brukt til å trekke ut alle funksjonene på data innhentet fra de skannede bildene og Bioconductor programmet ble brukt til å analysere rådata, som ble normalisert etter quantile normalisering. P-verdiene (ved tosidig t-test) og fold endringer mellom sammenligningsgruppene ble beregnet ved hjelp av logg-transformerte data. Ut av 15714 sonder, ville antall sanne positive må i stor grad overstiger 157 for den forventede False Discovery Rate (FDR) som skal anses som lav (ved hjelp av metoden Storey et al. [14]). De nominelt betydelige sonder oversteg ikke sjanse forventet av multippel testing, som nødvendiggjør ytterligere kontroll av utvalgte miRNAs. Array data har blitt deponert i Gene Expression Omnibus (GEO, tiltredelse antall GSE55323).
cDNA syntese og kvantitativ real-time PCR
For å validere differensial uttrykk for MIR-1, speil 133b og MIR-145 *, RNA prøver fra et annet sett med 21 gjennomgående og 21 engangs pasienter ble undersøkt. For miRNA QRT-PCR-eksperimenter, like mengder av total RNA (30 ng) av hver prøve ble anvendt for første tråd DNA (cDNA) syntese ved anvendelse av miRNA spesifikke primere som er kjøpt fra Applied Biosystems og «TaqMan mikroRNA revers transkripsjon Kit» i henhold til produsentens protokoll (Applied Biosystems, Foster City, California). TaqMan HSA-Mir-1 (Analyse ID: 002222), -133b (Analyse ID: 002247) og -145 * (Analyse ID: 002149). Forsterkersett ble oppnådd fra Applied Biosystems (Foster City, CA)
miRNA ekspresjon analyse ved kvantitativ RT-PCR ble utført ved anvendelse av en Roche LightCycler480-II i sanntid thermal cycler (Roche, Sveits). TaqMan Universal Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) ble anvendt, og mikroRNA spesifikke prober ble innkjøpt fra Applied Biosystems (Danmark). MiRNA uttrykket data ble normalisert til RNU43. Hvert eksperiment ble utført i duplikat. Den relative kvantifiseringen Analysen ble utført av delta-delta-Ct metode som beskrevet tidligere [15].
Statistical Analysis
Statistisk analyse ble utført ved hjelp av tosidig t-test. En p-verdi 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Pearson korrelasjon test ble brukt til å vise korrelasjonen av MIR-1 og MIR-133b uttrykk i PCA prøver. Receiver Operating karakteristiske (ROC) kurver ble plottet ved hjelp av SPSS 15.0 for å se kraften av PSA og validerte mirnas å skille de tilbakevendende PCA prøver fra engangsprøver. For ROC analyse ble logistisk regresjon gjennomført og de predikerte sannsynlighetene ble beregnet for hver enkelt miRNA eller Mir-1 og MIR-133b sammen. Deretter, er området under kurven beregnet med 95% konfidensintervall. Arealet under kurven er akseptert signifikant forskjellig fra 0,5 når p-verdien er større enn 0,5 betyr at logistisk regresjon klassifiserer konsernet betydelig bedre enn ved en tilfeldighet.
Resultater
Totalt 41 tilbakevendende og 41 ikke-tilbakevendende svulster fra radikale prostatectomies, som ble hentet fra Baylor College of Medicine Prostate Cancer program, ble inkludert i denne studien å utføre miRNA profilering (tabell 1). Gjennomsnittsalderen på tidspunktet for operasjonen av PCA pasienter med tilbakefall var 62,8 ± 6, mens de uten tilbakefall hadde en gjennomsnittsalder på 61,7 ± 7,2 (ikke signifikant, p = 0,54, Mann Whitney). Mer enn 80% av pasientene i begge gruppene var ikke-spanske kaukasiere. Gjennomsnittlig måneder fra drift til en
st tilbakefall eller siste normal evaluering for tilbakevendende og ikke-tilbakevendende PCA pasientene var 22,63 ± 3,89 og 76,59 ± 2,87, henholdsvis. PSA nivåer varierer fra 4,2 til 100 og 3,1 til 40,3 hos pasienter med tilbakefall og ikke-gjentakelse, henholdsvis. Som forventet, betyr pre-operative PSA-nivå på tilbakevendende pasienter som var nesten det dobbelte av ikke-tilbakevendende pasienter (22 lignet med 11,3 ng /ml). I tilbakevendende pasientene var bare 3 prøver Gleason 6 (3 av 41), mens for engangs pasienter 14 av 41 prøver var Gleason 5 eller 6. Tilsvarende 15 av 40 radikale prostatectomies fra tilbakevendende pasienter for hvilke data som var tilgjengelig viste sædvæske invasjon men bare fire av 41 ikke-tilbakevendende kreft hadde denne funksjonen. Dermed mens de demografiske trekk ved de to gruppene er svært like, de tilbakevendende kreft er mye mer høyt aggressive basert på kliniske og patologiske funksjoner.
For å sammenligne miRNA profiler av tilbakevendende og ikke-tilbakevendende PCA prøver, vi gjennomført ut microarray analyse ved hjelp av 20 prøver fra hver gruppe. Microarray analyse av 20 gående og 20 engangsprøver viste at 93 sonder er forskjellig uttrykt med en p-verdi mindre enn 0,01. Av de 93 nominelt betydelige prober som er rapportert, er det 84 ruting til humane mirnas, som er oppgitt i tabell S1.
A hete kart representasjon av differensielt uttrykte mirnas er vist i figur 1A. Blant de betydelig deregulerte mirnas, mir-1, mir-133B, og mir-145 * (figur 1B) ble valgt for videre QRT-PCR bekreftelse på et annet sett med tilbakevendende og ikke-tilbakevendende PCA prøver.
(A) Varme kartet representasjon av betydelig deregulerte miRNAs i tilbakevendende PCa eksemplarer vs engangs PCA prøver. (B) Heat-kart representasjon av MIR-1, MIR-133b og MIR-145 * i tilbakevendende PCa eksemplarer vs engangs PCA prøver.
De QRT-PCR resultater viste at uttrykket nivå av MIR-1 ble betydelig redusert i tilbakevendende PCA eksemplarer enn for engangs PCA vevsprøver (figur 2A, p = 0,036). Nedregulering av mir-133b i tilbakevendende PCa (figur 2B, p = 0,012) ble også bekreftet. På den annen side, selv om det er en liten nedgang i ekspresjonsnivået av MIR-145 * i stadig tilbakevendende prøver sammenlignet med ikke-tilbakevendende seg, var forskjellen ikke statistisk signifikant (figur 2C, p 0,05). For å vurdere sammenhengen av MIR-1 og MIR-133b uttrykk i både tilbakevendende og ikke-tilbakevendende PCA eksemplarer, benyttet vi Pearson korrelasjonsanalyse, som viste at Mir-1 uttrykk var sterkt korrelert med MIR-133b uttrykk i PCA vevsprøver (Figur 3, korrelasjonskoeffisient (R) = 0,780).
Relativ uttrykk nivåer av (A) MIR-1, (B) MIR-133b, og (C) MIR-145 * i 20 vendende PCa eksemplarer sammenlignet med 20 engangs PCA prøver. RNU43 ble brukt for normalisering av miRNA uttrykk analyser.
For å teste kraften i Ptil, MIR-1 og MIR-133b for å skille tilbakevendende PCa prøver fra engangsprøver, mottaker drifts kurver (ROC) ble plottet, som viste at PSA, MIR-1 og MIR-133b hadde arealet under kurven (AUC) verdiene av 0.950, 0,661 og 0,692, henholdsvis, noe som viser deres tilstrekkelig å ha makt til å skille gjentatte prøver fra engangs seg på egenhånd. Dessuten, når MIR-1 og MIR-133b ble evaluert sammen har de representert bedre effekt (AUC; 0,719). Enn tilfellet hvor mirnas ble analysert individuelt (figur 4)
Kurver for individuelle mirnas og deres samarbeids makt å diskriminere to sett med pasienter består av 20 gående og 20 engangs PCA prøver.
Diskusjoner
PCa er en svært heterogen sykdom, som dagens prognostiske indikatorer stort sett klarer å bestemme utfallet og nesten 30% av PCA pasienter opplever tilbakefall etter en vellykket radikal prostatektomi eller adjuvant terapi [16], [17]. For tiden er primær tumor stadium, serum PSA-nivå, og biopsi Gleason grad anvendes ved klinisk evaluering for å forutsi den patologiske stadium av tumoren og behandlingseffektivitet, men ingen eller til og med en kombinasjon av disse indikatorene er tilstrekkelig til på en pålitelig måte forutse resultat for pasienter [3], [4]. En konsensuskriterier på definisjonen av biokjemisk tilbakefall basert på PSA nivåer, ikke har blitt godt etablert, som hindrer etablering av en standard prognostisk modell hos menn behandlet med radikal prostatektomi [18]. Dessuten, kan påvisning av PSA i sera hos pasienter etter PCA radikal prostatektomi være på grunn av tilstedeværelsen av gjenværende godartet prostatavevet, noe som misguides utøvere for å komme opp med en falsk positiv diagnose [19]. Videre pasienter med lignende serum PSA-nivå, Gleason score og patologisk stadium har vist seg å ha forskjellige kliniske resultater på grunn av heterogeniteten til subtyper på molekylært nivå [20], [21].
På grunn av at nye prognostiske biomarkører er sterkt behov for å utvikle mer effektive, optimalisert og individualiserte behandlingsstrategier, flere antatte prognostiske biomarkører ble foreslått i de senere år, noe som er oppnådd begrenset suksess i pasientutvelgelse [22]. For eksempel ble forskjellige gener, som er spesielt detektert i prostatakjertelen, så som humant KLK2, PCA3, prostata-spesifikt membran antigen og prostata stamcelle-antigen foreslått som nyttige prognostiske markører for prognose av patologiske funksjoner i PCA-pasienter [23]. Endrede uttrykk for BCL-2 og Bax ble også assosiert med påfølgende utvikling av biokjemisk tilbakefall [18]. Men blant de genene foreslått som prognostisk biomarkør avhengig av store genekspresjon profilering studier, bare noen få gener kan bli validert i flere studier [24]. Videre ble flere kliniske risiko prediksjonsmodeller utviklet for å forutsi den biokjemiske gjentakelse risiko eller klinisk svikt, selv om disse modellene også unnlatt å pålitelig og nøyaktig anslå kliniske resultatet skyldes heterogenitet av sykdommen [25]. Tatt i betraktning de begrensningene i dagens prognostisk verktøy og modeller, er det viktig å innlemme nye biomarkører til eksisterende modeller for å overvinne disse begrensningene i kliniske beslutningsprosesser.
Derfor er det et viktig mål i dagens prostatakreft forskning å finne ut effektive prognostiske molekylære biomarkører som ville hjelpe nøyaktig identifiserer pasienter med aggressiv og metastatisk sykdom for å veilede terapeutiske beslutninger og bestemme de pasientene som trenger tettere oppfølging og intensiv pleie. I tillegg til identifisering av biomarkører som har potensiell forutsi tilbakefall etter radikal prostatektomi ville være av avgjørende klinisk betydning for å bestemme hvorvidt adjuvant terapi er nødvendig. Slike biomarkører ville være spesielt uvurderlig for pasienter med forskjellige utfall selv om de har lignende kliniske kjennetegn.
Den første implikasjonen av miRNAs i kreft biologi har blitt beskrevet gjennom påvisning av MIR-15 og MIR-16 nedregulering i B-celle kronisk lymfatisk leukemi [26]. Siden da, ble ulike mirnas forbundet med svulst patogenesen gjennom å spille rolle i initiering, progresjon, og metastasering av kreft [27], [28]. I tillegg til å undersøke differensial uttrykk for miRNAs i kreft, er det viktig å utforske miRNA profiler av prøvene for å finne ut en sammenslutning av miRNA uttrykk med klinisk utfall.
Mir-1 og MIR-133b, kodet fra MIR -1 /133a og MIR-206 /133b klynger, ble betegnet som muskelspesifikke mirnas [29] og ble rapportert å være ofte nedregulert i ulike tumortyper [30]. Dessuten har sin ektopisk overekspresjon blitt vist å hemme cellevekst, cellemigrering og indusere apoptose i flere typer kreft [30]. MIR-1 er nylig blitt foreslått som en prognostisk markør i PCa for å forutsi tilbakefall [31]. Dens downregulation kan være involvert i PCa tilbakefall grundige forhøyede nivåer av sine mål. For eksempel, overekspresjon av CXCR4 og SDF-1alpha, som validerte mål for Mir-1 [32], var assosiert med lokale tilbakefall og fjernmetastaser ved PCA [33] og dårlig prognose i stadium II bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom [34], henholdsvis. Oppregulering av NOTCH3, en onkogen MIR-1 mål, er også vist å assosiere med PCa tilbakefall [35]. Som til rollen MIR-133b i tilbakefall, har det vært forbundet med total overlevelse og metastase i tykktarmskreft [36] og foreslått som en prognostisk biomarkør for PCa tilbakefall i en veldig fersk studie [37]. Forhøyede nivåer av validerte MIR-133B mål som CXCR4 [38], FGFR1 [39], FSCN1 [40] har vært forbundet med prognose for ulike kreftformer.
Konklusjoner
De nåværende teknikker gjøre ikke nødvendigvis gir forbedret overlevelse for PCA pasienter og nesten 30% av menn utvikler klinisk tilbakefall med forhøyet serumprostataspesifikt antigen nivåer. Derfor er det av avgjørende betydning å avdekke molekylære mekanismene bak PCa progresjon for å utvikle nye og effektive diagnostiske /terapeutiske verktøy. Her rapporterer vi at Mir-1 og mir-133b har blitt betydelig nedregulert i tilbakevendende PCa eksemplarer i forhold til engangs PCA prøver, som kan tjene som nye biomarkører for prediksjon av PCa progresjon.
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1.
liste over forskjellig uttrykt miRNAs i tilbakevendende kontra ikke-tilbakevendende prostatakreft prøvene
Doi:. 10.1371 /journal.pone.0098675.s001
(XLS)
Takk
Vi takker Yiqun Zhang for teknisk assistanse i microarray analyse.
