Abstract
Tumor hypoksi med deregulert uttrykk for hypoksi induserende faktor (HIF) og dens biologiske konsekvens fører til dårlig prognose for pasienter diagnostisert med solide tumorer, noe som resulterer i høyere dødelighet, noe som tyder på at forståelsen av den molekylære forholdet hypoksi med andre cellulære funksjoner i tumor aggressivitet vil være uvurderlig for å utvikle nyere målrettet terapi for solide svulster. Emerging bevis også foreslå at hypoksi og HIF signalveier bidrar til oppkjøpet av epitel-til-mesenchymale overgang (EMT), vedlikehold av kreft stamceller (CSC) funksjoner, og også opprettholder den onde sirkelen av betennelse, som alle bidrar til stråling og kjemoterapi motstand. Imidlertid er de detaljerte mekanismer som hypoksi /HIF drive disse hendelsene ikke fullt ut forstått. Her har vi vist at hypoksi fører til øket ekspresjon av VEGF, IL-6, og CSC markørgener som Nanog, Oct4 og EZH2, og også økt ekspresjon av MIR-21, et onkogen miRNA, i prostata cancer (PCA) -celler (PC-3 og LNCaP). Behandlingen av PCA celler med CDF, en roman Curcumin-avledet syntetisk analog viste tidligere anti-tumor aktivitet
in vivo
, hemmet produksjoner av VEGF og IL-6, og nedregulert uttrykk for Nanog, Oct4 , EZH2 mRNA, samt MIR-21 i henhold til hypoksiske tilstand. Videre CDF behandling av PCA celler førte til redusert cellemigrasjon etter hypoksisk tilstand. Tatt sammen tyder disse resultater på at anti-tumoreffekten til CDF er delvis formidles ved deregulering av tumor hypoksiske veier, og således CDF kan bli nyttige for cancerterapi
relasjon:. Bao B, Ahmad A, Kong D, Ali S, Azmi AS, Li Y, et al. (2012) Hypoksi Induced Aggressivitet av prostata kreft celler er knyttet til deregulert Uttrykk av VEGF, IL-6 og mirnas Det blir dempet av CDF. PLoS ONE 7 (8): e43726. doi: 10,1371 /journal.pone.0043726
Redaktør: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, USA
mottatt: 13. juni 2012; Godkjent: 23 juli 2012; Publisert: 27 august 2012
Copyright: © Bao et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne takker Puschelberg og Guido Foundations for deres generøse økonomiske bidrag. Gi støtte fra National Cancer Institute, National Institutes of Health gir 5R01CA131151, 5R01CA132794 og 1R01CA154321 (FHS), og det amerikanske forsvarsdepartementet Exploration-hypotesen Development Award PC101482 (BB). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostate Cancer (PCA) er den vanligste diagnosen kreft hos menn, og det er den nest største årsaken til kreft dødsfall i USA [1]. De fleste PCA pasienter er mulig å behandle, men pasientene dør vanligvis på grunn av resistens og metastatisk sykdom. Det er således et akutt behov for utvikling av nye strategier ved hvilken medikamentresistens og metastatisk sykdom kan bli kontrollert med nye midler som kan forbedre behandlingsresultat. Hypoksi er en av de fundamentale biologiske fenomener som er intrikat forbundet med utvikling og aggressivitet av en rekke forskjellige faste tumorer, inkludert PCa. Hypoksi-induserbar faktorer (HIF) fungerer som en mester transkripsjonsfaktor som regulerer hypoksi responsive gener og har vært kjent for å spille viktige roller i tumorinvasjon, chemo-stråling motstand, og økt celledeling, overlevelse, angiogenese og metastase [2]; [3]. Derfor svulst hypoksi med deregulert uttrykk for HIF og dens biologiske konsekvens fører til dårlig prognose for pasienter diagnostisert med solide tumorer, noe som resulterer i høyere dødelighet, noe som tyder på at forståelsen av den molekylære forhold til hypoksi med andre cellulære funksjoner i tumor aggressivitet vil være uvurderlig for å utvikle nyere målrettet terapi for solide svulster.
Det er vel kjent at kreftstamceller (cscs) og epitelial til mesenchymale overgang (EMT) fenotypiske celler er assosiert med terapeutisk motstand og bidrar til aggressiv tumorvekst, invasjon og metastase, og antas å være årsaken til tumorresidiv [4]. Emerging bevis tyder på at hypoksi og HIF sti forbedre fenotyper og funksjoner cscs og EMT [5] – [9], bidra til tumor aggressivitet, som også kan være grunn til deregulering av microRNAs (miRNAs). De mirnas er kjent for å spille kritiske roller i en rekke biologiske prosesser, inkludert celle-differensiering, proliferasjon, celledød, metabolisme og energihomeostase [10]; [11]. Akkumulerende bevis har antydet at mirnas kan ha en viktig rolle i utvikling og progresjon av tumorer. Den endrede ekspresjon av mirnas har blitt forbundet med klinisk prognose av tumor, resistens mot kjemoterapi-strålebehandling, og tumorresidiv [12] – [14]. Et stort antall mirnas har blitt rapportert å være responsive til hypoksi og HIF banen i et bredt spekter av celler og vev, inkludert cancerceller [15] – [18]. Det har blitt rapportert at hypoksi forårsaker redusert ekspresjon av MIR-101, en potensiell anti-onkogen miRNA, og økt ekspresjon av MIR-21 og MIR-210, onkogene mirnas i forskjellige krefttyper, inkludert PCa [13]; [19]. Således kan hypoksi-formidlet deregulering av mirnas spiller viktige roller i tumor aggressivitet mediert gjennom regulering av cellulære signalveier inkludert HIF pathway. Derfor rettet mot disse hypoksi-mediert mirnas bruker nye midler kan gi innovative terapeutisk strategi for forebygging og /eller behandling av PCa.
Her har vi undersøkt effekten av hypoksi på celle migrasjon, invasjon, angiogenese, og uttrykket av VEGF, IL-6, CSC gener, og MIR-21 og MIR-210 i PCA celler etter hypoksisk tilstand. Vi undersøkte også hvilken rolle MIR-21 i reguleringen av uttrykket av VEGF, IL-6, CSC markørgener, og deres tilknytning til dannelsen av prostaspheres i PCA celler i henhold hypoksiske forhold. Videre undersøkte vi effekten av en ny curcumin-avledet syntetisk analog (CDF) som viste antitumoraktivitet med en høyere systemisk og målvevet biotilgjengelighet, på celleoverlevelse, migrasjon, invasjon, angiogenese, dannelse av prostaspheres, og ekspresjon av HIF-1α, VEGF, IL-6, CSC markørgener, og mirnas i PCA celler under hypoksiske forhold. Vi fant at hypoksi ført til økt uttrykk av VEGF, IL-6, og CSC markørgener som Nanog, Oct4 og EZH2, og også økt uttrykk av MIR-21 i humane PCA celler. Behandling av celler med CDF hemmet produksjoner av VEGF og IL-6, og ned-regulert ekspresjon av Nanog, Oct4 og EZH2 mRNA, samt MIR-21 i disse celler under hypoksiske tilstand. CDF også redusert cellemigrasjon fra PCA celler etter hypoksisk tilstand. Fra disse resultatene, konkluderer vi at anti-tumor effekt av CDF er delvis mediert gjennom deregulering av svulst hypoksiske signalveier.
Materialer og metoder
Cell Culture, narkotika og reagenser
menneske~~POS=TRUNC PC-3 og LNCaP-celler ble holdt under standard dyrkingsbetingelser (21% O
2 og 5% CO
2, 37 ° C). Hypoksisk (1% O
2) og 5% CO
2 betingelser ble samlet ved regulering av inngangsstrømningshastighetene av nitrogen og karbondioksid, henholdsvis i kulturen inkubator. Alle cellelinjene ble holdt i 10% FBS-RPMI-1640 medium under standard cellekultur tilstand. CDF ble syntetisert som beskrevet i våre tidligere publikasjoner [20]; [21].
celleoverlevelse Assay
For å undersøke effekten av CDF på celleoverlevelse i humane PCA-celler under hypoksiske tilstand, ble MTT-analyse utført ved anvendelse av humant PCa (PC-3 og LNCaP) celler. 3000-celler ble sådd ut i hver brønn i 96-brønners plater og inkubert ved standard dyrkningsbetingelser (21% O
2 og 5% CO
2) over natten. Cellene ble deretter behandlet med forskjellige konsentrasjoner av CDF (0,5 uM) og inkubert i 8 timer under hypoksiske tilstand, etterfulgt av 16 timer under normoksiske tilstand hver dag. Etter 3 dager med behandling, ble cellene høstet for standarden MTT-analysen, som beskrevet i våre tidligere publikasjoner [22]; [23]. Hvert forsøk ble utført i fire paralleller, og gjentatt to ganger, uavhengig av hverandre.
klonogene Assay
klonogene analyse ble utført for å undersøke effekten av CDF på cellevekst av PCA cellene under hypoksiske tilstand, som beskrevet tidligere [ ,,,0],22]. I korthet, 5 x 10
4 celler ble sådd ut i en seks-brønns plate og etter 3 dager med eksponering til 0,5 uM av CDF (8 h av hypoksisk tilstand og 16 timer fra normoksisk tilstand hver dag), ble cellene trypsinert og 1000 enkeltlevedyktige celler ble sådd ut i 100 mm petriskåler. Cellene ble deretter inkubert i 10 til 12 dager ved 37 ° C i en 5% CO
2/5% O
2/90% N
2 inkubator. Koloniene ble farget med 2% krystallfiolett, vasket med vann, og telles. Hvert forsøk ble utført i tre paralleller og gjentatt to ganger uavhengig av hverandre.
Invasion analysen
in vitro
invasjon analysen av PCA-celler ble utført under hypoksiske betingelser ved hjelp Costar Transwell 24 -vel-plater med polykarbonatmembran (Corning Incorporated, Corning, NY), som beskrevet tidligere [23]. I korthet, 4 x 10
4 av cancerceller (PC-3 og LNCaP) som utsettes for 3 dagers inkubering under normoksiske og hypoksiske tilstand ble sådd i hver brønn av Matrigel forbelagte Transwell plater. De nederste brønner av systemet ble fylt med komplett medium. Etter 20 timers inkubering, enten i fravær eller nærvær av CDF (0,5 uM), ble den invaderte kreftcellene farget med 4 ug /ml Calcein-AM (Invitrogen) i PBS-løsning ved 37 ° C i 1 time, etter produsentens håndbok. Fotografiene ble tatt med et fluorescerende mikroskop. Hvert forsøk ble utført i tre paralleller og gjentatt to ganger uavhengig av hverandre.
Wound Healing analysen
For å undersøke effekten av CDF på celle migrasjon av PCA cellene under hypoksisk tilstand, gjennomførte vi sårheling assay som tidligere beskrevet [24]. I korthet, når PC-3-celler ble 90-95% konfluent, ble såret generert ved å skrape overflaten av platene med en pipettespiss. Cellene ble deretter inkubert i fravær og nærvær av CDF (0,5 uM) og ble dyrket under hypoksiske tilstand i 4 timer, etterfulgt av 16 timer fra normoksisk forhold, og deretter fotografert med et Nikon Eclipse TS100 mikroskop, som tidligere beskrevet [23] . Hvert forsøk ble utført i tre paralleller og gjentatt to ganger uavhengig av hverandre.
Tube Forming analysen
For å undersøke effekten av CDF på angiogenese
in vitro
i vaskulære endotelceller i henhold hypoksisk tilstand, gjennomførte vi rør formasjon assay, som beskrevet tidligere [25]; [26]. I korthet, 3 x 10
4 kanin vaskulære endotelceller ble sådd ut i hver brønn av Matrigel-pre-belagte 96-brønners plate i 100 ul 10% FBS-DMEM-medium, og utsatt for normoksisk eller hypoksiske betingelser i 4 timer inkubasjon ved 37 ° C, etterfulgt av 16 timer fra normoksisk forhold. Fotografiet ble tatt ved 4 timer og 20 timer, henholdsvis. Hvert eksperiment ble gjentatt to ganger, uavhengig av hverandre.
Ekspresjon av VEGF og IL-6
ELISA ble utført for å undersøke effekten av CDF på hypoksi-indusert ekspresjon av VEGF og IL-6 i PCA-celler. Kulturen media fra PCA cellene under hypoksiske eller normoksisk betingelser for 16 timer ble høstet for måling av VEGF og IL-6 ved hjelp av ELISA analysesett (R [27]. De CD44 eller EpCAM merket prostaspheres ble fotografert under et Nikon ESLIPSE E800 med 100x forstørrelse. Konfokalmikroskopi (Leica TCS SP5) ble gjennomført i MIRL Core-anlegget, Wayne State University School of Medicine. Hvert eksperiment ble gjentatt to ganger uavhengig av hverandre.
Forbigående og stabil Transfeksjon av PCA Celler med cDNA og mirnas
transfections av cDNA og mirnas ble utført ved hjelp ExGen 500 transfeksjon reagens (Fermentas, Tyskland) og DharmaFECT transfeksjon reagens (Dharmacon), henholdsvis følgende produsentenes manualer, som beskrevet tidligere [24]. Den stabil transfeksjon av cDNA ble utført under valg av G418-holdig medium (Sigma) og verifisert ved Western blot-analyse, som beskrevet tidligere [25]. Hvert eksperiment ble gjentatt to ganger, uavhengig av hverandre.
Protein Extraction og Western blot-analyse
Western blot-analyse ble utført for å måle de relative nivåer av HIF-1α protein i PCA-celler under hypoksiske betingelser. Totale cellelysater av cellene eksponert for 16 timers hypoksisk tilstand ble oppnådd ved å lysere cellene i protein lyseringsbuffer inneholdende 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS, 0,5% natrium-deoksycholat, 2 mM natriumfluorid, 2 mM Na
3VO4
2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA og 1 x protease inhibitor cocktail (Roche Diagnostics, Tyskland), og Western blotting ble utført som beskrevet tidligere [24], og signalstyrken ble målt ved hjelp av kjemiluminescens deteksjon system (Pierce Rockford, IL). Hvert eksperiment ble gjentatt to ganger uavhengig av hverandre.
Real-time (RT) revers transkriptase-polymerase kjedereaksjon (PCR) for å måle uttrykk av mRNA og mirnas
For å bestemme mRNA uttrykk, to mikrogram av det totale RNA ekstrahert fra hver prøve ble benyttet for RT-reaksjon i 20 pl reaksjonsvolum ved anvendelse av en revers transkripsjonssystemet (Invitrogen) i overensstemmelse med produsentens instruksjoner. SYBR Grønn Assay kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) ble brukt for sanntids PCR reaksjon, ved hjelp av AB StepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystems), etter produsentens protokoll. Sekvenser av PCR-primere ble beskrevet tidligere [23]. Data ble analysert ved bruk av C
t-metoden og ble normalisert ved GAPDH-ekspresjon i hver prøve. For å bestemme ekspresjon av mirnas i cellene, ble den TaqMan mikroRNA Assay Kit (Applied Biosystems) som anvendes følgende produsentens protokoll. Total RNA ble ekstrahert fra cellene og 5 ng av RNA ble reverstranskribert som beskrevet tidligere [28]. De miRNA primere ble hentet fra AB Systems. Real-time PCR-reaksjoner ble så utført i et totalt volum på 10 pl reaksjonsblanding som tidligere beskrevet [24] under anvendelse av StepOnePlus Real Time PCR System (AB-systemer). Data ble analysert ved hjelp av C
t-metoden og ble normalisert ved RNU48 uttrykk i hver prøve. Hvert forsøk ble utført i tre paralleller og gjentatt to ganger, uavhengig av hverandre.
luciferasereportergenet Assay
For å undersøke effekten av CDF eller MIR-21 mangel på MIR-21 bindingsaktivitet til 3 « -UTR i PCA celler under hypoksiske tilstand, gjennomførte vi MIR-21-mediert luciferasereportergenet analysen i PC-3-celler ved hjelp av MIR-21-mediert luciferasereportergenet vektor (Signosis, Sunnyvale, CA), i hvilken MIR-21 bindende til dets DNA-bindingssete på luciferase-genet vektoren undertrykker luciferaseaktivitet. Kort sagt ble 10
4 PC-3-celler sådd ut i hver brønn i 96-brønners plater, og inkubert over natten ved standard dyrkingsbetingelser. Cellene ble så transfektert med MIR-21-trykkes luciferasereportergenet vektor (Signosis, Sunnyvale, CA) ved å bruke ExGen 500 transfeksjon reagens (Fermentas, Tyskland) eller ko-transfektert med luciferase vektoren og anti-MIR-21 ved bruk av DharmaFECT transfeksjon reagens (Dharmacon) etter produsentens protokoll, som beskrevet ovenfor. Etter inkubering over natten av transfeksjonen ble transfektanter behandlet med CDF i ytterligere 20 timer under standard dyrkingsbetingelser, og utsatt for fire timer av hypoksisk tilstand. Til slutt ble transfektanter høstet for luciferase aktivitetsanalyse ved hjelp Luciferase Assay System (Promega), etter produsentens manual. Hvert eksperiment ble gjentatt to ganger uavhengig av hverandre.
statistiske metoder
Sammenligninger av behandlingsresultat ble testet for signifikante forskjeller ved den sammenkoblede
t
test. Statistisk signifikans ble antatt ved en
P
verdi på mindre enn 0,05.
Resultater
Effekt av CDF på Cell Survival og Clonogenicity av PCA Cells Under hypoksisk tilstand
dataene fra MTT-analysen tyder på at CDF bemerkelsesverdig inhiberte celleoverlevelse av PC-3 og LNCaP-celler i henhold til hypoksiske betingelser i en doseavhengig måte (figur 1A). CDF behandling også redusert clonogenicity av PC-3 og LNCaP celler etter hypoksisk tilstand (figur 1B). Disse funn antydet at CDF kunne hemme celleoverlevelse og vekst av klonogene PCA cellene under hypoksiske betingelser.
panelene A, B og C representerer data for celleoverlevelse, clonogenicity, og Western blot-analyse, respektivt. Barene i tallene indikerer standardavvik for n = 4.
Effekt av CDF på HIF-1α Protein og Oppsetninger av VEGF og IL-6 i PCA cellene under hypoksisk tilstand
Som vist i figur 1C, redusert CDF behandling det relative nivået av HIF-1α i PC-3 og LNCaP-celler etter hypoksisk tilstand. De celler inkubert i henhold til hypoksisk tilstand ført til økt VEGF-produksjon, i forhold til celler inkubert i henhold til normoksisk tilstand (figur 2). CDF behandling bemerkelsesverdig redusert produksjon av hypoksi-indusert VEGF i PCA-celler (Figur 2). HIF-1α over-uttrykker PC-3 celler viste økt VEGF produksjon under hypoksisk tilstand, i forhold til sine foreldre PC-3 celler. CDF behandling også hemmet den hypoksi-indusert VEGF produksjon i HIF-1α over-uttrykker PC-3-celler. Disse resultater antyder at cellene dyrket under hypoksisk tilstand fører til økt IL-6-produksjon, sammenlignet med de celler inkubert i henhold til normoksisk tilstand (figur 2). CDF behandling bemerkelsesverdig redusert produksjon av hypoksi-indusert IL-6 i PCA-celler (Figur 2). CDF også redusert hypoksi-indusert IL-6-produksjon i HIF-1α over-uttrykker PC-3-celler (Figur 2).
De kondisjonerte medier ble oppsamlet fra celler dyrket under normoksisk og hypoksiske betingelser som beskrevet under metodene seksjon. Målingene av VEGF og IL-6 ble utført ved hjelp av ELISA. Barene i tallene indikerer standardavviket for n = 3.
Effekt av CDF på Angiogenese
in vitro
i vaskulære endotelceller Under hypoksisk tilstand
Våre resultater indikerer at hypoksiske betingelser øket røret dannelsen kapasiteten til vaskulære endotelceller i 4 timer og 20 timer av inkubasjon, henholdsvis, sammenlignet med normoksiske tilstand. CDF behandling inhiberte den hypoksi-indusert rør dannelse i vaskulære endotelceller (figur 3A). For å klargjøre hvorvidt CDF-mediert molekyler eller CDF selv bidrar til hemming av røret formasjon, samlet vi ikke CDF-behandlede (kontroll) og CDF behandlet tilstand media fra kreftceller og gjennomført røret dannelsen analysen i henhold normoksiske tilstand. Vi fant at de vaskulære endoteliale celler inkubert med kontroll tilstand media hadde økt rør formasjonen på 4 timer og 20 timer, sammenlignet med de celler inkubert med CDF-ferdigbehandlet tilstand media. Tilsetning av CDF til styre tilstand media vesentlig hemmet røret formasjonen, sammenlignet med cellene inkubert ved kontrolltilstands media og CDF-ferdigbehandlet tilstand media (figur 3B). Disse dataene tyder på at CDF seg selv bidrar til hemming av røret formasjon
panelene A og. B, C cellemigrering ble evaluert ved sårheling assay; invasjon ble evaluert av kammeret invasjon analysen.
Effekt av CDF på celle migrasjon og invasjon
in vitro
i PCA cellene under hypoksisk tilstand
Hypoksi utsatte PC- 3-celler hadde økt kapasitet av sårtilheling, sammenlignet med celler dyrket i henhold til normoxia (figur 3C). CDF behandling hemmet sårtilheling kapasitet på PCA cellene under hypoksisk tilstand (Figur 3C og D). Som vist i figur 3D, over-ekspresjon av HIF-1α økte den til sårheling kapasitet av PC-3-celler som er utsatt for 16 timers hypoksisk tilstand. CDF behandling hemmet sårtilheling kapasitet i både HIF-1a-over-uttrykke PC-3 celler under hypoksisk tilstand (figur 3D). Disse resultatene gitt overbevisende data viser at CDF kunne inhibere hypoksi-indusert cellemigrering av PCA-celler, selv i HIF-1a-over-uttrykke PCA-celler.
in vitro
invasjonen analysen viser at både PC-3 og LNCaP celler eksponert for hypoksisk tilstand hadde økt kapasitet på invasjon, i forhold til disse cellene eksponert for normoksiske tilstand (Figur 3E). CDF behandling hemmet kapasiteten hypoksi-indusert invasjon av PCA celler.
Effekt av CDF på Gene Expression of CSC Markører og miRNA uttrykk i PCA Cells Under hypoksisk tilstand
Dataene fra sanntid RT-PCR-analyse viser at hypoksi-indusert de relative nivåer av Nanog, Oct4 og EZH2 mRNA samt MIR-21 og MIR-210 i PC-3 og LNCaP cellene mens CDF redusert nivåene av Nanog, Oct4 og EZH2 mRNA samt MIR-21 og MIR-210 i PCA cellene under hypoksisk tilstand (figur 4).
real time RT-PCR ble utført som beskrevet under metodedelen. Barene i tallene indikerer standardavvik for n = 3.
Effekt av CDF eller Anti-MIR-21 på CSC selvfornyelse kapasitet og celleoverflatemarkører CD44 og EpCAM i Human PCA Cells Under hypoksisk tilstand
dataene fra sfære-analysen tyder på at anti-MIR-21 redusert dannelse av prostaspheres av PC-3-celler (figur 5A). Disse data tyder på at MIR-21 kan spille en viktig rolle i reguleringen av den selvfornyelse kapasitet på CSC-lignende PCA-celler. CDF behandling også decesased dannelsen av prostaspheres av PCA celler under hypoksiske forhold (figur 5A). Videre gjennomførte vi konfokal bildemikroskopi for å vurdere uttrykket av CD44 og EpCAM i sfæren dannende celler i PC-3 celler. Resultatene viser at anti-MIR-21 reduserte ekspresjon av CD44 og EpCAM i PC-3 sfæren dannende celler under hypoksiske tilstand, i samsvar med den CDF behandling (figur 5B). Disse dataene tyder på at CDF reduserte dannelsen av prostaspheres og ekspresjon av CD44 og EpCAM delvis mediert ved å målrette ekspresjon av MIR-21.
panelene A og B representerer data for dannelsen av prostaspheres, er ekspresjon av CD44 og EpCAM, og produksjonen av VEGF og IL-6 i CSC-lignende sfæren-dannende celler av PCA-celler, respektivt. Sfæren formasjon Analysen ble gjennomført for å undersøke selvfornyelse kapasitet på cscs av PCA celler som beskrevet under metodedelen. Konfokal mikroskopi ble utført for å måle ekspresjonen av CSC overflatemarkører CD44 og EpCAM i sfære-dannende celler avledet fra PCA-celler som beskrevet i metodedelen. Barene i tallene indikerer standardavvik for n = 3.
Effekt av CDF eller Anti-MIR-21 på VEGF og IL-6 Produksjon i Sphere-forming celler av PC-3 celler under hypoksisk tilstand
Vi har undersøkt effekten av CDF på VEGF og IL-6 produksjoner i sfæren dannende celler i PC-3 celler etter hypoksisk tilstand ved ELISA-analysen. Vi har funnet at PC-3 sfæren-dannende celler produsert en større mengde av VEGF i henhold hypoksisk tilstand, sammenlignet med dens paren PC-3-celler (3172 pg /ml /10
4 PC-3 kule-dannende celler vs 3192 pg /ml /10
6 PC-3 celler, figur 2 og 5C), noe som tyder på at PC-3 sfæren dannende celler kan fremme angiogenese ved opp-regulerer uttrykket av VEGF produksjon. Vi fant også at CDF behandling redusert hypoksi-indusert VEGF produksjon i PC-3 kule dannende celler, i samsvar med resultatene fra PC-3 sfæren dannende celler med betinget hemming av MIR-21. Videre har vi funnet at i likhet med VEGF produksjon, er de kuledannende celler produsert en bemerkelsesverdig høyere mengde av hypoksi-indusert IL-6, sammenlignet med dens parentale celler (129,3 pg /ml /10
4 PC-3 sfære dannende celler vs 457,6 pg /ml /10
6 PC-3 celler, figur 2 og 5C). CDF behandling eller betinget mangel på MIR-21 ved sin inhibitor /siRNA redusert produksjon av hypoksi-indusert IL-6 ved de kule-dannende celler (figur 5C). Vi undersøkte også om ikke CDF behandling eller MIR-21 mangel kan regulere genuttrykket av HIF-1α, VEGF, IL-6, CD44, EpCAM, og EMT markører i PC-3 kule dannende celler under hypoksisk tilstand. Vi fant at betinget undertrykkelse av MIR-21 resulterte i en betydelig reduksjon i de relative mRNA-nivåer av HIF-1α, VEGF, IL-6, CD44, EpCAM, og mesenkymale markører for EMT fenotype slik som ZEB1, vimentin, og Twist, og øket de relative mRNA-nivåer av epitel markør E-cadherin i PC-3 sfæren-dannende celler i henhold til hypoksiske betingelser (data ikke vist). Tilsvarende redusert CDF mRNA nivåer av HIF-1α, VEGF, IL-6, CD44, EpCAM og mesenchymale markører ZEB1, ZEB2, vimentin, og Twist i PC-3 sfæren dannende celler under hypoksisk tilstand. Men CDF også redusert genuttrykket av E-cadherin i PC-3 sfæren dannende celler etter hypoksisk tilstand (data ikke vist).
Effekt av CDF på uttrykk for miRNAs i PC-3 Sphere dannende celler Under hypoksisk tilstand
Vi har undersøkt effekten av CDF på Let-7, MIR-21, MIR-101, og MIR-210 i PC-3 sfæren dannende celler etter hypoksisk tilstand. Resultatene viste at CDF økte relative miRNA nivåer av la-7c, d, og MIR-101 og redusert det relative nivået av MIR-210 i PC-3 sfæren dannende celler etter hypoksisk tilstand (Figur 6A). Disse dataene antyder at CDF kan deregulere uttrykket av hypoksi-forbundet mirnas i CSC-lignende celler av PCA celler.
paneler A og B representerer data av mirnas i CSC-lignende sfæren dannende celler avledet fra menneskelige PCA celler og luciferase aktiviteter i PCA celler, henholdsvis. Transfeksjon av MIR-21-mediert luciferase reportergen vektor og anti-MIR-21 ble utført i PC-3-celler, som beskrevet i detalj under Methods delen. Luciferase aktivitet ble målt ved hjelp av Promega luciferase assay system kit, etter produsentens manual. Barene i tallene indikerer standardavvik for n = 3.
Effekt av CDF behandling eller MIR-21 mangel på MIR-21 bindingsaktivitet til 3′-UTR i PCA cellene under hypoksisk tilstand som Vurderes av luciferase assay
Vi har undersøkt effekten av CDF behandling eller MIR-21 mangel på MIR-21 bindingsaktivitet til 3′-UTR i PCA celler etter hypoksisk tilstand ved hjelp av MIR-21-mediert luciferasereportergenet analysen. Som vist på figur 6B, har vi funnet at hypoksi redusert luciferase-aktiviteten i PC-3-celler transfektert med MIR-21-mediert luciferase vektor, sammenlignet med de samme celler under normoksiske tilstand, noe som tyder på at hypoksi økte MIR-21 bindingsaktivitet, fører til nedgang i luciferase-aktivitet. Anti-MIR-21 økte luciferaseaktiviteten i PC-3 celler under hypoksiske tilstand, sammenlignet med de samme celler uten behandling, hvilket antyder at anti-MIR-21 redusert MIR-21 DNA-binding, som fører til en økning i luciferaseaktivitet i PC-3 celler under hypoksisk tilstand. Tilsvarende CDF behandling viste økt luciferase-aktivitet i PC-3-celler etter hypoksisk tilstand på en doseavhengig måte, noe som tyder på at CDF kunne hemme MIR-21 DNA-bindings i PC-3-celler.
diskusjon
En rekke epidemiologiske og kliniske studier har vist at hypoksi og hypoksi-indusert signalbaner som er assosiert med dårlig prognose av pasienter diagnostisert med faste tumorer inkludert prostata cancer (PCA). Emerging bevis tyder også på at hypoksi øker celle migrasjon, invasjon, og angiogenese, som fører til kreft aggressive fenotyper. Her bekreftes det at hypoksi induserer celle migrasjon, invasjon, og angiogenese, og økt produksjon av VEGF i PCA celler. Vi observerte også at hypoksi induserer dannelsen av prostaspheres i PCA celler, i samsvar med økt uttrykk av CSC markører gener som Nanog, Oct4, EZH2, CD44, og EpCAM i PCA celler. Det har vist seg at hypoksi spiller en sentral rolle i reguleringen av CSC egenskaper gjennom HIF proteiner, og HIF nedstrøms målgener slik Oct4 og Notch-en [6]; [7]. Disse funnene tyder på at hypoksi kan spille en nøkkelrolle i reguleringen av CSC egenskaper, noe som fører til tumor aggressiv fenotype.
Emerging bevis tyder på at mirnas spiller avgjørende roller i utvikling og progresjon av svulster gjennom regulering av mRNA degradering eller proteintranslasjon mediert ved deres binding til den 3 «ikke-translaterte region (3»-UTR) av målgener. Det er blitt dokumentert at MIR-21 er ansett som en pro-onkogen molekyl, som fremmer tumorigenesis. [24]. [31]. [21].
