Abstract
Autophagy er en kritisk cellulære prosessen som kreves for å opprettholde celle homeostase i helse og sykdomstilstander, men de molekylære mekanismer og effekten av autofagi på kreft er ikke fullt ut forstått. Her har vi funnet at Sox2, en nøkkel transkripsjonsfaktor i reguleringen av «stemness» av embryonale stamceller og indusert-pluripotente stamceller, sterkt indusert autophagic fenomener, inkludert intracellulær vakuolen dannelse og lysosomal aktivering i tykktarmskreftceller. Aktiverings skjedd gjennom Sox2-mediert
ATG10
genekspresjon og resulterte i inhibering av celleproliferasjon og forankrings-uavhengig kolonivekst
ex vivo
og tumorvekst
in vivo.
videre fant vi at Sox2-indusert-autofagi forbedret mobilnettet senescence med opp regulerende tumor dempere eller senescence faktorer, inkludert p16
INK4a, p21 og fosforylert p53 (Ser15). Spesielt, knockdown av
ATG10
i
Sox2
-expressing tykktarm kreft celler restaurerte kreft celle egenskaper. Til sammen våre resultater viser at regulering av autofagi mediert av Sox2 er en mekanisme drevet roman strategi for å behandle menneskelige tykktarm kreft
Citation. Cho YY, Kim DJ, Lee HS, Jeong CH, Cho EJ, Kim MO, et al. (2013) Autophagy og Cellular Senescence formidlet av Sox2 Dempe Ondartethet av kreftceller. PLoS ONE 8 (2): e57172. doi: 10,1371 /journal.pone.0057172
Redaktør: Qiang Wang, Cedars-Sinai Medical Center, USA
mottatt: 02.10.2012; Godkjent: 18 januar 2013; Publisert: 25 februar 2013
Copyright: © 2013 Cho et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av Hormel Foundation og National Institutes of Health gir CA111536, CA120388, CA077646, R37CA081064 og ES016548, og fra Forskningsfondet, M-2011-B0002-00025 av The Catholic University of Korea. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreftcellene, men ikke normale celler, erverve immortalization ved å rømme mobil senescence [1]. I forhold til normale celler, kreftceller krever vanligvis mer næring til å produsere proteiner og enzymer for deres raskere spredning, noe som resulterer i ernæringsmessig avhengighet av kreftceller [2]. Overlevelse er støttet av næringsstoffer som oppnås gjennom blodtilførsel og ved selv fordøyelse av intracellulære organeller i en prosess referert til som autofagi [3].
Autophagy er et konservert katabolsk prosess i eukaryoter som degraderer langlivede proteiner, organeller og bulk cytoplasma [4] inn i lysosomale system for å opprettholde homeostase i løpet av sult og normal vekstkontroll [3]. Autophagy fremmer celle overlevelse ved sletting cellene skadede organeller, giftige metabolitter, og intracellulære patogener og ved å skape de intracellulære byggesteinene som kreves for å opprettholde vitale funksjoner under næringsbegrenset forhold [5]. Men autofagi kan også omfatte en viktig strategi for å behandle kreft fordi autofagi kan også fremme celledød gjennom overdreven selv fordøyelse og nedbrytning av essensielle cellulære bestanddeler [5]. Autophagy er forskjellig fra apoptose, en prosess som mangler autophagosomes og autolysosomes i døende celler [6]. Spesielt, blokkering av autofagi ved å slå ut beclin induserer tumorutvikling [7] og indusere autofagi ved behandling med naturlige forbindelser som resveratrol, undertrykker kreft celleproliferasjon og malignitet [2]. Autophagy er angivelig nært beslektet med mobilnettet senescence og hemming av autofagi forsinkelser mobilnettet senescence i mitotiske humane diploide celler [8]. Disse observasjonene indikerer at autofagi kan indusere senescens i kreftceller på grunn av hemming autophagy forbedrer tumorigene egenskaper av MCF-7-celler [9]. Imidlertid detaljerte mekanismene har ikke vært tydelig klarlagt.
Videre, tamoxifen, en antagonist av østrogenreseptoren i brystvev, induserer autophagy i humane MCF-7 brystkreftceller [10] formidlet gjennom sfingolipid metabolitter [11] . Spesielt, Arsenikk, imatinib (Glivec) og rapamycin er forbindelser som induserer autophagic celledød i mange menneskelige kreftcellelinjer [12], [13], [14]. Viktigere er eggstokk, bryst og prostata kreft forbundet med monoallelic tap av beclin1 hos mennesker. Videre er induksjon av autophagy ved beclin overekspresjon undertrykker forankrings-uavhengig koloni vekst av MCF-7-celler [15] og proliferasjon av negativ inhibering av p70S6 kinase [16], [17].
både klassisk og modernisert cellulær omprogrammering er stressende prosesser som aktiverer apoptose og cellealdring, som er de to viktigste hindringene for kreftutvikling og somatisk omprogrammering [18]. De mTOR signalveien aksjer i omprogrammering av somatiske celler, cellular alderdom og autofagi formasjon [18]. For eksempel, godt karakterisert mTOR-hemmere og autofagi aktivatorer, inkludert PP242, rapamycin og resveratrol, spesielt forbedre hastigheten og effektiviteten av iPS celle generasjon [19]. Sox2, en transkripsjonsfaktor som hører til den HMG (High Mobility Group) superfamilien, har en rolle i bestemmelse av celle skjebne, differensiering og proliferasjon [20]. Det er også en viktig regulator av embryonale stamceller (ES-celler) selvfornyelse og omprogrammering av terminalt differensierte celler IPS-celler [21]. Selv om onkogene potensialet for stamcellefaktorer, slik som Sox2, har vært antatt å være basert på «stemness» likhet mellom stamceller og kreftceller, er Sox2 funksjon i kreftceller ikke er klart forstått. Videre har nyere studier vist at Sox2 proteinnivået sterkt korresponderer med mindre differensiert basalcellelignende brystcarsinomer [22], og Sox2 protein er ofte funnet å være nedregulert i mage karsinom [23]. Disse typer studier har forårsaket mer uenighet om normal funksjon og onkogene potensial for stamcelle faktorer. Her gir vi bevis som viser at uttrykket av Sox2 i kreftceller induserer autofagi av kreft celler med opp regulerende
ATG10
genekspresjon og indusere celle senescence, noe som resulterer i redusert malignitet av kreftceller og hemming av tumorvekst
ex vivo Hotell og
in vivo
.
Resultater
Ektopisk uttrykk for
Sox2
induserer autofagi
Nyere studier indikerte at ektopisk ekspresjon av
Sox2
av retroviral infeksjon i MCF-7 brystkreftceller øker både størrelsen og antall kolonier dannet i myk agar [24]. Imidlertid er Sox2 ofte nedregulert i mage kreft og hemmer cellevekst gjennom cellesyklus og apoptose [23]. Derfor rolle Sox2 i kreft er kontroversielt. For å undersøke hvilken rolle Sox2 og andre IPS faktorer i kreft, vi ectopically uttrykt disse faktorene i HCT116 humane tykktarmskreftceller, og fant at Sox2, men ikke Nanog, Lin28 eller Oct4, induserte alvorlig vakuole dannelse i cytoplasma, noe som er en viktig markør av macroautophagy [25] (fig. 1A). Vi fant at over 90% av infiserte celler dannet av forskjellige størrelser vakuoler i sitt cytoplasma og Western blotting og immunocytofluorescence analyseresultatene viste at alle cellene uttrykte ektopisk Sox2-proteinet (fig. 1B). Videre fikk vi bekreftet at alvorlig vacuole dannelse sammenfalt med syrlig lysosomal aktivering i HCT116 tykktarmskreftceller (Fig. 1C). Viktigere, Sox2 overekspresjon indusert LC3 (også kjent som ATG8b) foci formasjonen, som er en viktig biomarkør av autofagi (Fig. 1 D). Resultatene indikerte at Sox2 overekspresjon indusert autofagi.
(
A
) Sammenligning av morfologiske endringer forårsaket av ektopisk uttrykk for iPS faktorer.
(øvre panel)
HCT116-celler ble individuelt transduced med iPS faktorer, blant annet Sox2, Nanog, Lin28 og Oct4. Cellene ble dyrket i 5 dager, og forandringer ble observert under et lysmikroskop (X200).
(Nedre paneler)
HCT116 cellene ble høstet 5 dager etter transduksjon med iPS faktorer og proteiner utvunnet. Protein nivåer av Sox2, Nanog, Lin28 og Oct4 ble analysert ved Western blotting med spesifikke antistoffer som angitt. ß-Aktin ble anvendt som en intern kontroll for å verifisere lik protein lasting. (
B
) HCT116 cellene som danner vakuoler på 5 dager etter transduksjon ble observert under lett mikroskopi, telles og sammenlignet. Sox2 overekspresjon ble analysert ved Western blotting og immunocytofluorescence assay (X200) ved hjelp av spesifikke antistoffer som angitt. ß-Aktin ble anvendt som en intern kontroll for å verifisere lik protein lasting. Cellene ble gjort synlige ved lysmikroskopi (L.M .; X200). (
C
) lysosomal aktivering analyse. HCT116-celler infisert med
uekte
eller
Sox2
ble farget ved tilsetning av lysotracker (50 nM) i kulturmediet i 5 minutter i en 37
° C, 5% CO
2 kuvøse. Cellene ble fiksert med 4% formalin, vasket med PBS og lysosomal-aktivering ble observert under et fluorescens mikroskop (X200). (
D
) Immunofluorescensanalyse analyse av LC3b (dvs. ATG8b). HCT116-celler som stabilt uttrykker
mock
eller
Sox2
ble utsatt for en fluorescens analyse for å påvise LC3b. Cellene ble observert under et fluorescens mikroskop (X200). Kjernene ble farget med DAPI; LM indikerer lysmikroskopi (X200).
Sox2 induserer Autophagy i kreftceller, men ikke i normale celler
For å undersøke om Sox2 overekspresjon kan indusere vacuole dannelse i ulike tykktarmskreftcellelinjer , omformet vi lenti-Sox2 viruspartikler i CCD-18Co normal kolon celler og HCT116, HT29 og WiDr menneskelige kolon kreftceller. Vi fant ut at alle kolon kreftcellelinjer dannet vakuoler i sitt cytoplasma (fig. 2A, piler). Imidlertid, selv om CCD8-18Co normal tykktarmceller viste god ekspresjon av Sox2 etter transduksjon med lenti-Sox2, cellene ble ikke dannet vakuoler eller viser morfologiske endringer (Fig. 2A, B). Videre ytterligere resultater bekreftet at vakuolen dannelse og sure lysosomal aktivering ble observert i HCT116 tykktarmskreftceller, men ikke i CCD-18Co normale tykktarmceller (Fig. 2C). I tillegg gjorde ektopisk uttrykk for Sox2 i normal mus embryonale fibroblaster (MEFs) eller humane primære fibroblaster (NFDH og BJ) ikke føre vacuole dannelse (data ikke vist), som viser at vacuole dannelse indusert av Sox2 overekspresjon i HCT116 cellene er faktisk kreftcelle -spesifikk autofagi.
(
A
) CCD-18Co (CRL-1459) normale tykktarmceller og HCT116, HT29 og WiDr tykktarm kreft celler ble dyrket i medium og omformet med
Sox2
viruspartikler. Cellene ble dyrket med komplett vekstmedium for 5 dager etter transduksjon. Cellene ble observert under et lysmikroskop. Cellular vakuoler er merket med en pilspiss i
Sox2
-expressing tykktarmskreftceller. (
B
) CCD-18Co normal kolon celler ble dyrket, omformet med
mock
eller
Sox2
viruspartikler og dyrket med komplett vekstmedium i 5 dager. Cellene ble deretter fiksert, permeabilisert og hybridisert med en Sox2 spesifikt antistoff og deretter med en Alexa 568-konjugert sekundært antistoff, og visualisert med et fluorescens-mikroskop (X200). Kjerner ble farget med DAPI. Områdene av lysmikroskopi er de områdene matchet med Sox2 og DAPI fluorescens. Den eske området under lavt strømforbruk er forstørret for å sammenligne morfologi mellom HCT116-
mock
og –
Sox2
-expressing celler. (
C
) lysosomale aktivering, en autofagi markør, ble sammenlignet ved å legge lysotracker-Red (50 nM) 5 dager etter transduksjon til CCD-18Co normale tykktarmceller og HCT116 kolorektal kreft celler infisert med
mock
eller
Sox2
. Cellene ble observert under et fluorescens mikroskop. LM indikerer det samme området av lysmikroskopi tilsvarer fluorescens mikroskopi (X200).
Sox2 Targets ATG10 å indusere Autophagy
For å utforske mekanismen (e) av Sox2-indusert autofagi, vi først brukte en microarray analyse av totalt 30,968 gener fra cDNA isolert fra celler infisert med
mock
eller
Sox2
å identifisere genet (e) målrettet av Sox2 å indusere autofagi. Resultatene viste 11,245 gener som ble analysert ved hjelp av en grundig analyse av microarray (SAM) program (https://www-stat.stanford.edu/~tibs/SAM). Vi fant ut at 2,153 Sox2-indusert gener kan bli klassifisert som opp-regulert og 1575 genene ble nedregulert i HCT116-celler (fig. 3A og tabell S1). Vi brukte Database for kommentering, visualisering og integrert Discovery (DAVID v6.7; http: //niaid.abcc.ncifcrf.gove) for ytterligere å klassifisere genene i henhold til deres biologiske eller molekylære funksjoner og fant at genuttrykk nivåer forbundet med autofagi , spredning og cellesyklusregulering ble vesentlig endret ved ektopisk uttrykk for
Sox2.
Altered genuttrykk inkludert endringer i 33 DNA-reparasjonsgener, 25 DNA replikering gener, 20 cellevekstrelaterte gener, 26 cellestørrelse relatert gener, 191 transkripsjons-relaterte gener og 17 insulinsignalveien-relaterte gener (fig. 3A og tabell S1, S2 og S3). Viktigere,
Sox2
uttrykk indusert økt uttrykk av
ATG10, ATG3, ATG4a, ATG4D Hotell og
ATG8b
gener med ca 2-4 ganger (fig. 3A). I kontrast,
Sox2
uttrykk ble assosiert med redusert uttrykk for
ATG12, ATG16L2 Hotell og
ATG9B
gener (figur 3A.). Ved å søke en database som inneholder Sox2 konsensus-bindende motiv i promoter-regionen i genomet [26], fant vi at
ATG10 Hotell og
ATG12
arrangører inneholde en antatt Sox2 bindende enighet nucleotide motiv husing 63% identitet (tabell S4). Sammenligning av våre microarray og database søkeresultatene, konkluderte vi med at ATG10 kan være et mål for Sox2 i induksjon av autophagy. Våre sykkelavhengig RT-PCR resultater viste at
ATG10
mRNA nivå fra
Sox2-
transfekterte celler ble økt med om lag 2,5 ganger sammenlignet med
mock plakater (Fig. 3B ). Spesielt, Western blotting resultater (Fig. 3C) og immunocytofluorescence mot ATG10 (Fig. 3D) indikerte at ATG10 og LC3 proteinnivåer ble økt med overekspresjon av Sox2. For å avgjøre om
ATG10
promoter aktiveres ved Sox2, vi konstruert to
luciferase
reporter plasmider som inneholder -1522 til -1 (
pGL3-ATG10-1522
) og – 711 til -1 (
pGL3-ATG10-711
) (figur 3E.) ved å søke og analysere
ATG10
promoter regioner, som inneholder antatte Sox og SRY bindende motivene på -1327 og – 1473 fra transkripsjons-initierings-setet (fig. 3E). Vi fant at det delesjon av antatte Sox2 bindende region undertrykte betydelig luciferase-aktivitet (fig. 3F). Spesielt,
ATG10
promoter aktivitet ble økt med overekspresjon av Sox2 (Fig. 3G), noe som indikerer at Sox2 induserer
AT10
genekspresjon og forårsaker autofagi.
(
A
) Mikromatrise.
Topplate
, HCT116 kolorektal kreft celler som stabilt uttrykker
mock
eller
Sox2
ble utsatt for microarray analyse som beskrevet i «Materialer og metoder». Den gule fargen angir antall gener som ikke viser en signifikant forskjell mellom
mock Hotell og
Sox2
uttrykk. De røde og grønne farger indikerer antall gener opp- eller ned-regulert, henholdsvis i HCT116-celler som stabilt uttrykker
Sox2
sammenlignet med celler som uttrykker
mock
kontroll.
Bottom tabellen
, oppsummering av autofagi relaterte gener hentet fra microarray analyse. Opp- og nedregule nomineres i log2 verdier. (
B
) Uttrykk for
ATG10
indusert av Sox2. Total RNA (1 ug) fra HCT116-celler infisert med
mock
eller
Sox2
ble revers transkribert og
ATG10
ble forsterket av syklusen avhengig PCR og
ATG10
ekspresjonsnivået ble visualisert ved hjelp av agarosegel-elektroforese på 21
st syklus. ß-Aktin ble anvendt som en intern kontroll for å verifisere lik utnyttelse av cDNA for PCR. (
C
) oppregulering av ATG10 og LC3b proteinnivåer fremkalt av
Sox2
uttrykk. Proteiner ble hentet fra HCT116-celler som stabilt uttrykker
mock
eller
Sox2 Hotell og ATG10 og LC3b proteiner ble visualisert ved Western blotting med spesifikke antistoffer. ß-Aktin ble anvendt som en intern kontroll for å verifisere lik protein lasting. (
D
) Bekreftelse på Sox2-indusert ATG10 proteinnivå. HCT116 kolorektal kreft celler ble infisert med
mock
eller
Sox2 Hotell og kultur 5 dager. Cellene ble fiksert, hybridisert med en ATG10 spesifikt primært antistoff og Alexa 488-konjugert sekundært antistoff. De ATG10 protein nivåer ble observert av fluorescens mikroskopi. L.M. viser det samme område av lys-mikroskopi svarende til fluorescens mikroskopi (X200). (
E
) Byggingen av
ATG10
arrangøren
luciferase
reporter plasmid. Nukleotidsekvensene til menneske
ATG10
promoter-regionen ble lastet ned fra Ensemble (https://uswest.ensemble.org). Den antatte promoter Analysen ble utført med TFSEARCH (v1.3) (https://cbrc.jp/htbin/nph-tfsearch). Den antatte sry og Sox bindende konsensussekvenser er merket i rødt og polymerase III bindingsstedet er eske. (
F
) BAC klone (RP11-111B20) ble kjøpt fra Empire Genomics (Buffalo, New York) og 1528 og 711 bp av
ATG10
promoter-regionen ble forsterket av PCR. PCR-fragmentet ble saman med
pGL3
basisvektoren å konstruere pGL3-AT10-1582 og pGL3-ATG10-711
luciferase
reporter plasmider.
pGL3-ATG10-Luc
reporter plasmider ble bekreftet ved DNA-sekvensering.
ATG10
arrangøren
luciferase
reporter plasmider,
pGL3-AT10-1582 Hotell og
pGL3-ATG10-71-
luc, ble transient transfektert inn HCT116 celler og ildflue luciferase-aktiviteten ble analysert etter 24 timer.
phRL-SV40 Renilla
luciferase reporter plasmid ble ko-transfektert som en intern kontroll for å verifisere lik transfeksjon og normalisering av Firefly luciferase aktivitet (* p 0,001). (
G
)
pGL3-ATG10-1528
luciferase reporter plasmid ble midlertidig co-transfektert med et
mock
eller
Sox2
viral ekspresjonsvektor inn HCT116-celler og den ildflue luciferase-aktiviteten ble analysert etter 24 timer.
phRL-SV40 Renilla
luciferase reporter plasmid ble ko-transfektert som en intern kontroll for å verifisere lik transfeksjon og normalisering av Firefly luciferase aktivitet (* p 0,001).
Sox2- indusert autophagy er formidlet gjennom den nedregulering av den Akt signalveien, men ikke gjennom klasse III PI3-K signale
fasting eller uttømming av vekstfaktorer så som insulin induserer autofagi [27]. Våre microarray Resultatene viste at genekspresjon assosiert med insulinsignalveien ble undertrykket (tabell S3). Derfor undersøkte vi endringer i protein nivåer forbundet med autofagi og insulin signalering ved Western blotting. Vi fant at Klasse III PI3-K (Vps34p) og beclin ble ikke endret, noe som indikerer at den klasse III PI3-K /beclin signalveien ikke er involvert i Sox2-indusert autofagi (Fig. 4A). Ved å undersøke PI3-K-Akt signalveien, fant vi at Akt fosforylering (Ser308) var vesentlig hemmet og de totale proteinnivåer Akt, mTOR og p70S6K ble redusert i
Sox2
-infected celler sammenlignet med
mock
-infected celler (fig. 4B). For å bekrefte signalering relatert til inhiberingen av PI3-K-Akt signalveien, analyserte vi GSK3α /ß og PTEN. Resultatene indikerte at fosforylering av GSK3α /ß på Ser9 /Ser21 ble undertrykt og totale GSK3α /ss proteinnivået ble noe økt i
Sox2
-infected celler sammenlignet med
mock
-infected celler (fig . 4C). Spesielt, har vi funnet at PTEN fosforylering ble også økt (fig. 4C), noe som resulterer i undertrykkelse av PI3-K signalisering av de-fosforylering [28]. Disse resultatene indikerte at Sox2 endrer PI3-K-Akt signalveien gjennom GSK3α /ß og PTEN signalering, selv om det oppstrøms spesifikke kinase ansvarlig for fosforylering av PTEN ikke er kjent i dette tilfellet. Vi behandlet HCT116-celler som uttrykker
Sox2
eller
mock
med insulin eller LY294002, en PI3-K-hemmer. Resultatene indikerte at
Sox2
indusert vacuole formasjonen ble markert hemmet av insulinbehandling (fig. 4D
venstre panel
s, etter E). Imidlertid gjorde de
mock
-infected cellene ikke vise vacuole formasjon om den ikke behandles med insulin i normal cellekultur tilstand (10% FBS) eller undertrykkes vacuole dannelse i sult tilstand (0% FBS) (fig. 4D
venstre og midtre paneler,
E, F). Vi fant også at
mock
-infected celler utstilt økt vacuole formasjon etter behandling med LY294002, mens
Sox2
overekspresjon forårsaket mer vacuole dannelse indusert av LY294002 behandling sammenlignet med
mock product: ( fig. 4D
panel midt
s, etter E, F). Lignende fenomener ble observert etter sult forhold (fig. 4E, F). Samlet utgjør disse resultatene indikerte at nedregulering av PI3-K-Akt sti av PTEN kan samarbeide for å indusere autofagi forbundet med Sox2 uttrykk.
(
A-C
) Protein nivåer av klasse i signalmolekyler inkludert Akt, mTOR og p70S6K og klasse III PI3-K signalmolekyler inkludert Vps34p og beclin ble analysert i HCT116-celler som stabilt uttrykker
mock
eller
Sox2
. De enkelte proteiner ble visualisert ved hjelp av Western blotting ved anvendelse av spesifikke antistoffer. p-aktin ble benyttet som en intern kontroll for å verifisere lik protein lasting. (
D
) Involvering av klasse I PI3-K signalisering i Sox2-indusert autofagi. (
D, venstre paneler
) HCT116-celler som stabilt uttrykker
mock
eller
Sox2
ble behandlet med insulin eller LY294002 underkant av 10% FBS-inneholder forholdene på 2 dager etter smitte. Vakuolen dannelse ble observert ved lysmikroskopi (X200). Eske områdene er individuelt forstørret 2 flere ganger (
lavere paneler for narr og Sox2
) for å bedre visualisere vakuoler.
(D, høyre panel)
Cellene ble transduced med
Sox2
viruspartikler og kultur 2 dager. Cellekulturmediet ble erstattet med McCoys 5a uten FBS tilskudd men inklusive 5 ug /ml insulin eller 5 ug LY294002 og deretter celler ble dyrket i 5 dager. Cellene ble observert under lett mikroskopi (X200). (
E
) Kvantitativ sammenligning av autofagi dannelse indusert av klasse I PI3-K signalering. Den vacuole dannende celler fra D og F ble talt opp og sammenlignet i et numerate grafisk (* p 0,001).
Sox2-indusert Autophagy undertrykker spredning og Anchorage uavhengig Colony Vekst ved å fremkalle Cellular Senescence i HCT116 celler
Suppresjon av PI3-K-aktivitet ved PTEN har en viktig rolle i celleproliferasjon og kreftutvikling i tykktarmen [29], [30], [31]. PI3-K hemming av PTEN eller Wortmannin har en invers effekt sammenlignet med tumor nekrose faktor-α på balansen mellom P50 og P65 subenheter av nukleær faktor
k
B [31]. GM3, et gangliosid, behandling øker dramatisk cyklin-avhengig kinase (CDK) inhibitor (CKI) p21
WAF1 uttrykk gjennom akkumulering av p53-protein ved PTEN-mediert inhibering av PI3-K-Akt-MDM2 overlevelse signalering i HCT116 tykktarmskreftceller [29]. I human kolorektal kreft, har en negativ sammenheng mellom PTEN protein nivåer og Akt fosforylering observert [30]. Våre resultater viste at nedregulering av PI3-K-Akt signalisering gjennom PTEN kan være involvert i Sox2-indusert autofagi (fig. 4). Vår celleproliferasjon og cellesyklus analyser indikerte at
Sox2
infeksjon i HCT116 cellene trykt spredning ved å fremkalle opphopning av celler i G0 /G1 og sub-G1 og reduksjon av S cellesyklus faser sammenlignet med
mock
-infected celler (fig. 5A). Dempningen av celleproliferasjon ble forbundet med ca 90% hemming av kreft vekst forankrings-uavhengig i soft agar, et kjennetegn på kreftcelleegenskaper [32] (fig. 5B). For å utforske signale ansvarlig for indusering av tapet av cancercelle egenskaper som undertrykkelse av proliferasjon og myk agar vekst, undersøkte vi forskjellige tumor suppressorer med en kjent rolle i regulering av cellesyklusen. Det ble observert en økning i p53 fosforylering (Ser15) og en økning i den totale protein nivåene av p16
INK4a og p21 (fig. 5C), som er godt kjent for å være sterkt involvert i cellulær senescens [33]. Vi deretter undersøkt senescence ved hjelp av en SA-ß-galaktosidase assay og funnet at ektopisk uttrykk for
Sox2
forbedret ß-galaktosidase aktivitet og proteinnivå (Fig. 5D,
venstre og midtre paneler
) og trykt Ki-67 proteinnivå, et celleproliferasjon markør (fig. 5D,
høyre panel
). Spesielt, over 90% av celler som inneholder vakuoler farget ß-gal positive (fig. 5D,
graf
), Samlet utgjør disse resultatene indikerte at Sox2-indusert autofagi fører til tap av tumor egenskaper i HCT116 kolorektal kreftceller .
(
A
)
Venstre panel
, effekten av
Sox2
uttrykk på celleproliferasjon. HCT116-celler (2 x 10
3) som stabilt uttrykker
uekte
eller
Sox2
ble sådd ut i 96-brønners plater og proliferasjon ble analysert ved MTS-analysen ved 24 timers intervaller opp til 96 timer (*, p 0,001).
Middle og høyre panel
, effekten av
Sox2
uttrykk på cellesyklus distribusjon. HCT116-celler (4 × 10
5) stabilt uttrykker
mock
eller
Sox2
var seeded, kultivert og deretter cellesyklus distribusjon (
midtre panelet
) og sub- G1 opphopning (
høyre panel
) ble analysert ved FACS (*, p 0,001). (
B
) Effekt av
Sox2
uttrykk på forankringsuavhengig kolonivekst. HCT116-celler (8 x 10
3) som stabilt uttrykker
uekte
eller
Sox2
ble utsatt for en myk agar-kolonivekstanalyse i 5-7 dager. De cellekolonier ble scoret ved hjelp av et mikroskop og bilde-Pro PLUS (v.6) dataprogram (* p 0,001). (
C
) Protein profilering knyttet til cellesyklusregulering. Proteiner ble ekstrahert fra HCT116-celler som stabilt uttrykker
uekte
eller
Sox2
og underkastet Western blotting for å detektere nivået av forskjellige proteiner som er kjent for å være involvert i cellesyklusregulering. ß-Aktin ble anvendt som en intern kontroll for å verifisere lik protein lasting. (
D
) Cellular senescence analysen.
Venstre panel
, HCT116-celler som stabilt uttrykker
mock
eller
Sox2
ble analysert for alderdom ved hjelp av en begynnende alderdom ß-galaktosidase farging kit. Cellene ble observert under et lysmikroskop (X200).
Middle Hotell og
høyre panel
, proteinnivået av ß-galaktosidase eller Ki-67 ble påvist i HCT116-celler som stabilt uttrykker
mock
eller
Sox2
bruke spesifikke primære antistoffer som angitt og en HRP-konjugert sekundært antistoff. Immunocytokjemisk påvisning ble utført ved hjelp av Sigma FASTTM 3,3′-Diaminobenzidin Terahyfrochloride med Metal Enhancer Tablet Stiller (DAB peroxydasesubstrat). Proteinnivåene ble visualisert ved hjelp av et lysmikroskop (X200).
Graf
, viser en sammenligning av ß-galaktosidase positive cellepopulasjonen i HCT116-celler som stabilt uttrykker
mock
eller
Sox2 plakater (* p 0,001).
knockdown av
ATG10
Gjenoppretter
Sox2
indusert Autophagy, Cellular senescence og Cell Proliferation
Våre tidligere resultater viser at
Sox2
-mediert autofagi er mediert gjennom
ATG10
uttrykk (fig. 3). For å undersøke om knockdown av
ATG10
kan undertrykke autofagi indusert av Sox2 overekspresjon, valgte vi en
PSH-ATG10-1755
knockdown vektor (fig. 6A).
sh-ATG10
viruspartikler ble smittet i
Sox2
-preinfected celler og uttrykk for Sox2 (Fig. 6B,
øverste panelene
) og knockdown av
ATG10 product: (fig. 6B,
bunnplater
) ble bekreftet av en immunfluorescens analysen. Veldig viktig, de cellulære morfologi av autofagi indusert av Sox2, inkludert celle utflating, kjernekraft størrelse og vacuole formasjon, ble helt konvertert til de som ble observert i
mock
-infected HCT116-celler (fig. 6B, L.M.). Videre fikk vi bekreftet at den morfologiske utvinning samsvarer med restaurering av Ki-67, ß-galaktosidase, p16
INK4a og p21 protein nivåer i
mock
-infected HCT116-celler (Fig. 6C). Spesielt, bekreftet vi at knockdown av
ATG10
i HCT116 stabilt uttrykker Sox2 utvinnes celleproliferasjon, som ble hemmet av Sox2 overekspresjon, og veksten var enda raskere enn HCT116-celler som stabilt uttrykker
mock
kontroll (fig. 6D). Resultatene indikerte at ATG10 spiller en viktig rolle i autofagi dannelse indusert av Sox2 uttrykk i HCT116 kolorektal kreftceller.
(
A
) Bekreftelse av knockdown effektiviteten av ATG10. Knockdown av ATG10 å bruke
pLKO-shATG10
.
pLKO-shATG10
knockdown lenti-viruspartikler ble smittet i HCT116-celler som stabilt uttrykker
Sox2 Hotell og celler dyrket i 36 timer. Proteinene ble ekstrahert og knockdown effektivitet ble bestemt ved Western blot ved anvendelse av et spesifikt antistoff ATG10. ß-Aktin ble anvendt som en intern kontroll for å verifisere lik protein lasting. (
B
) Morfologiske endringer indusert av
ATG10
knockdown i HCT116-celler som stabilt uttrykker
Sox2
. HCT116-mock, ble -Sox2 og -Sox2 /sh-ATG10 celler analysert for morfologiske endringer og proteinnivåer Sox2 (rød) og ATG10 (grønn) ble fastslått ved en immunfluorescens analyse ved hjelp av spesifikke antistoffer. Cellene ble observert under et fluorescens eller lysmikroskop (X200). L.M. indikerer lysmikroskopi. (
C
) Restaurering av cellesyklus, celleproliferasjon og senescence markører ved å slå ned
ATG10
i HCT116-celler som stabilt uttrykker
Sox2
. HCT116-mock, ble -Sox2 og -Sox2 /SH-ATG10 celler sådd til et 4-kammer lysbilde, fast og permeabilized. Markører for celleproliferasjon, celle senescence og cellesyklusregulering inkludert Ki-67, ß-galaktosidase, p16
INK4a og p21. Disse markørene ble analysert ved immunocytochemistry med spesifikke antistoffer som indikert ved hjelp av Sigma FASTTM 3,3′-Diaminobenzidin Terahyfrochloride med Metal Enhancer Tablet Stiller (DAB peroxydasesubstrat). Cellene ble observert under et fluorescens eller lysmikroskop (X200). (
D
) Restaurering av spredning ved å banke ned
ATG10
i HCT116-celler som stabilt uttrykker
Sox2
.
