Abstract
Hypoksi, Efrin-A1 og endotelial nitrogenoksid syntase (eNOS ) har vist seg å spille kritiske roller i tumorangiogenese. Men hvordan Efrin-A1 er regulert av hypoksi og om Efrin-A1 samarbeider med eNOS i modulering av angiogenese fortsatt tas opp i detaljer. Her viste vi at både Efrin-A1 i plateepitelkarsinom celler (SCC-9) og spesielt løselig Efrin-A1 i supernatantene var oppregulert etter hypoksisk tilstand. En økt nitrogenoksid (NO) produksjon i humane umbilikalvene endotelceller (HUVECs) ble observert i Efrin-A1-indusert angiogenese, som ble reversert etter ko-kultur med eNOS spesifikk inhibitor, N-nitro-L-arginin-metylester-hydroklorid (L -NAVN). Western blot analyse bekreftet at både fosforylering av Akt
Ser473 og eNOS
Ser1177 ble oppregulert i Efrin-A1-stimulert HUVECs, med total eNOS uttrykk uendret. Den spesifikke hemmer av phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K), LY294002 signifikant nedregulert Efrin-A1-indusert ekspresjon av fosforylert Akt
Ser473 samt fosforylering av eNOS
Ser1177. Resultatene viste en mulig ny mekanisme der Efrin-A1 er regulert i svulsten mikromiljøet og fremmer angiogenese gjennom en koordinert cross-talk med PI3K /Akt-avhengig eNOS aktivering som kan forholde seg til normal vaskulær utvikling og tumor neovascularization.
Citation: Song Y, Zhao XP, Song K, Shang ZJ (2013) Efrin-A1 er oppregulert ved Hypoksi i kreftceller og fremmer Angiogenese av HUVECs gjennom en koordinert Cross-Talk med eNOS. PLoS ONE 8 (9): e74464. doi: 10,1371 /journal.pone.0074464
Redaktør: Jung Weon Lee, Seoul National University, Sør-Korea
mottatt: 18 januar 2013; Godkjent: 03.08.2013; Publisert: 09.09.2013
Copyright: © 2013 Song et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Natural Science Foundation National of China (nr 81172570 og nr 30872893). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
En rekke pro-angiogene og anti-angiogene faktorer deltar i kontroll av angiogenese som spiller viktige roller i tumorvekst og metastase [1] – [3]. Efrin-A1 og dets primære reseptor, EphA2, ikke bare til uttrykk i flere kreftformer, men også spille en viktig rolle i normal angiogenese og tumor neovascularization [4]. Over-ekspresjon av Efrin-A1 i tumorceller kan fremme den angiogene prosess, mens slå ned fra Efrin-A1 i tumorceller i betydelig grad bidrar til reduksjon av tumor-indusert endotel-cellemigrering in vitro, og mikrovaskulær tetthet in vivo [5]. Vår tidligere studie viste at over-uttrykte EphA2 kan bidra til tumor angiogenese og ha prognostisk verdi på tungen karsinom [6]. Det er tilstrekkelig eksperimentelle bevis som antyder at aktiveringen av EphA2 på endotelceller (ECS) er nødvendig for Efrin-A1 for å utøve sin angiogene effekter in vitro og in vivo [7]. Imidlertid regulerings faktorer og mekanismer som Efrin-A1 /EphA2 fremmer tumor angiogenese ble ikke godt klarlagt.
Det har blitt rapportert at flere vekstfaktorer og cytokiner kan indusere ekspresjon av Efrin ligander, slik som tumor-nekrose faktor-α (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β), et al [8]. Hypoksi er en av de mest vanlige og viktige funksjoner i tumor mikromiljøet, og bidrar til induksjon av forskjellige angiogene faktorer [9]. Nylig har HIF-1α, en hypoksi-induserbare transkripsjonsfaktor, blitt funnet å oppregulerer ephrins og Ef reseptorer i musehud [10]. I hode og nakke kreft, ble økt Efrin-A1 uttrykk forbundet med pO
2 i svulstens mikromiljø [11]. Selv om Efrin-A1 spiller en avgjørende rolle i tumorangiogenese og synes å være involvert i respons til hypoksi, har de fleste av tidligere studier i hovedsak fokusert på Efrin-A1 som et membranbundet protein. Så vidt vi vet, er det relativt lite direkte bevis om hypoksi kan indusere kreft celler til å produsere Efrin-A1, spesielt løselig form, eller ikke.
De mekanismene bak Efrin angiogenese er ikke fullt ut forstått ennå. Frem til nå, bare et par signalveier, for eksempel MAP /ERK og PI3K [12], [13], er blitt funnet å være påvirket av Efrin-A1. Dessuten ble fremming så vel som inhibering av den samme signalveien ved Efrin-A1 observert i forskjellige celler eller krefttyper. Det er velkjent at eNOS og ikke spille en avgjørende rolle i endothelial migrasjon og angiogenese [14]. Tilstrekkelig bevis viste at eNOS er uttrykt overveiende i tumor vaskulære endotelceller, og dets produksjon NO virker som direkte effektor-molekylet i forskjellige angiogene faktorer-indusert tumor angiogenese [15], [16]. Derfor er det ikke overrasket over å anta at eNOS /NO kan også formidle Efrin-A1-indusert tumor angiogenese. Dessverre er ingen direkte informasjon tilgjengelig på tvers av koblingen mellom Efrin-A1 og eNOS under modulering av angiogenese i endotelceller så langt.
Den aktuelle studien undersøkte mekanismene bak Efrin-A1 modulering av angiogenese gjennom å undersøke effekten av hypoksi på Efrin-A1 ekspresjon og sekresjon i tumorceller og en mulig sammenheng mellom Efrin-A1 med eNOS /NO i tumor angiogenese. Våre data bekreftet at både Efrin-A1 ekspresjon og oppløselig Efrin-A1 sekresjon i tumorceller ble øket etter hypoksi stimulering. Den Efrin-A1-indusert angiogenese ble akkompagnert med eNOS fosforylering og NO produksjon, som ble blokkert av L-NAME. Videre studier har vist at aktivering av PI3K /Akt signalveien er nødvendig for krysstale mellom Efrin-A1 og eNOS i å fremme angiogenese. Våre resultater antydet at oppregulert Efrin-A1 i tumor hypoksisk mikromiljøet kan fremme angiogenese via PI3K /Akt /eNOS sti.
Materialer og metoder
Material
Rekombinant human Efrin -A1-Fc chimera og rekombinant humant IgG1 Fc ble kjøpt fra R Lonza, Walkersville, MD) supplementert med 2% føtalt bovint serum (FBS) og med EGM-2 vekstfaktor blanding (Lonza). HUVECs brukt i denne undersøkelsen var begrenset i passasjen 4 til passasjen 6. Alle celler ble dyrket ved 37 ° C i en atmosfære inneholdende 5% CO
2. Våre studier ble godkjent av komiteer Etikk i skole og sykehus i Odontologi (Wuhan University, referansenummer 055/2011).
Cell Migration analysen
Cell migrasjon ble undersøkt ved hjelp av grunnen såret analysen . Konfluent HUVECs i 24-brønns plate ble sultet over natten i 0,1% BSA EBM-2 til et sår ble laget ved å bruke en 200 ul pipettespiss. Etter skylling med PBS tre ganger for å fjerne de løsnede celler og cellerester, vekstfaktor-fritt medium med Efrin-A1-Fc (1 pg /ml) alene eller sammen med L-NAME (100 uM) eller LY294002 (10 uM) var tilsatt til hver brønn. Vekstfaktor-fritt medium med eller uten rekombinant lgG1 Fc (1 pg /ml) ble tatt som kontroll. Bilder på samme posisjon langs bunnen av såret ble tatt ved 0 timer, 24 timer. Prosentandelen av sårlukking ved hvert tidspunkt ble beregnet ved den følgende formel: [1- (strøm sårområdet /initial sårområdet)] x 100
In vitro Tube Formation Assay
Sub. -confluent HUVECs ble resuspendert i vekstfaktorer fritt EBM-2 inneholdende Efrin-A1-Fc (1 pg /ml) alene eller sammen med L-NAME (100 uM) eller LY294002 (10 uM), og sådd på pre-størknet BD Matrigel (BD Bioscience) i 96-brønns plate (3 x 10
4 celler /brønn). Platene ble så inkubert ved 37 ° C, 5% CO
2 i 6 timer. Bilder ble tatt fra hver gruppe. Alle avdelings interessante tube strukturer i hver brønn ble regnet for å kvantifisere graden av røret formasjon. Vekstfaktor-fritt medium med eller uten rekombinant lgG1 Fc (1 pg /ml) ble tatt som kontroll. Prosentandelen av rør-dannelse ble beregnet ved å ta den rekombinante Fc IgG1 kontrollgruppen som 100% tube formasjon. Forsøkene ble gjentatt minst tre ganger under lignende betingelser.
NO Konsentrasjon Detection Assay
Total NO-konsentrasjonen i kulturmediet ble påvist ved å måle konsentrasjonen av nitrat og nitritt ved modifisert Griess-reaksjonsmetode. Total Nitrogenoksid Assay Kit (Beyotime, Kina) ble brukt. De optiske tetthet ved 540 nm bølgelengde ble registrert ved hjelp av en mikroplateleser (Thermo MutliscanMK3; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) og konsentrasjonen av NO ble beregnet i henhold til standardkurven
Block analysen.
Blokker analysen ble utført for å evaluere funksjon av eNOS i Efrin-A1-indusert HUVECs angiogenese og Efrin-A1 effekt på P-eNOS
Ser1177 gjennom PI3K-Akt veien. L-NAME (100 uM) eller LY294002 (50 uM) ble tilsatt i kulturmediet for å blokkere eller eNOS PI3K. HUVECs av kontrollgruppene ble dyrket i vekstfaktor-fritt medium med eller uten rekombinant lgG1 Fc (1 pg /ml).
Immunofluorescens-analyse
HUVECs som vokser på dekkglass ble inkubert i 2% FBS EBM-2 inneholdende 1 pg /ml Efrin-A1-Fc for 0 timer, 8 timer og 24 timer. Objektglassene ble vasket med PBS og fiksert i 4% paraformaldehyd kaldt i 10 min. Etter behandling med 5% BSA-PBS ved 37 ° C i 30 minutter, ble celler inkubert med primært kanin-antistoff mot polyclone eNOS (fortynning 1:600) eller EphA2 (fortynning 1:400) ved 4 ° C over natten. Cellene ble deretter vasket med PBS tre ganger i 15 minutter og utsatt for Alexa Fluor 488-konjugert geit-anti-kanin-IgG (fortynning 1:300) i 1 time ved 37 ° C. Kjernene ble farget i 2 minutter i Hoechst (fortynning 1:10000) (Sigma, USA), etterfulgt av ytterligere tre vaskinger i PBS i 15 min. Alle Dekk var dekket med lysbilder og montert på fluorescens mikroskop (Leica DM4000B, Tyskland) for deteksjon. Negative kontroller ble behandlet på samme prosedyre men ved å utelate det primære antistoff.
Cell Proliferation Assay
HUVECs i 96-brønns plate (1 x 10
3 i 100 ul /brønn) ble utsatt for Efrin-A1-Fc (1 pg /ml) i 0 timer, 24 timer og 48 timer. Den celleproliferasjon Hastigheten ble målt ved hjelp av en celletelling leder-8 (Dojindo, Tokyo, Japan) ved å tilsette 10 ul WST-8 i hver brønn ved indikerte tider. Absorbans ved 450 nm bølgelengde ble registrert ved hjelp av en mikroplateleser (Thermo MutliscanMK3; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).
Polymerase Chain Reaction
Total RNA ble ekstrahert fra prøvegrupper . cDNA ble syntetisert med RevertAid ™ Premium First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, Glen Burnie, MD, USA). Real-time PCR ble utført ved hjelp av Maxima ™ SYBR Grønn qPCR Master Mix kit (Fermentas, Glen Burnie, MD, USA) og spektrofluorimetriske termisk iCycler1 (Bio-Rad, Hercules, CA). For Enos primer sekvenser er 5′-GTGGCTGTCTGCATGGACCT-3 «(fremover) og 5′-CCACGATGGTGACTTTGGCT-3» (bakover), produktstørrelse 121 bp. Human glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) ble tatt som en intern kontroll. MRNA-ekspresjon nivå i hver gruppe ble beregnet ved den komparative ΔΔCt.
Hypoksi Eksperiment
SCC-9-celler ble utsatt for hypoksiske betingelser (1% O
2) eller normoksisk betingelser ( 21% O
2) for 0 timer 6 timer, 12 timer, 24 timer og 48 timer. Celler ble høstet og lysert i SDS prøvebuffer for Western blot-analyse. Supernatanter ble samlet opp og sentrifugert ved 3000 x g i 10 min for å fjerne avfall. Lik mengde supernatant ble lastet for å oppdage løselig form av Efrin-A1 med Western blot analyse [18].
Cell Avrunding analysen
Supernatantene (24 h) ovenfor ble tatt som kondisjonert medium (CM) og konsentrert 6 × før celle avrunding eksperiment ved hjelp 10 kDa MWCO Amicon Ultra sentrifugalfilter enheter (Millipore). U-251 GBM-celler ble behandlet med CM eller 1 pg /ml rekombinant humant Efrin-A1-Fc. Invertert mikroskop ble anvendt for å observere celle avrunding ved 15 minutter, 30 minutter og 2 timer etter behandling.
Western Blot analyse
HUVECs i 90% konfluens ble behandlet med Efrin-A1-Fc ( 1 pg /ml) i 2% FBS EBM-2 for angitte tidspunkter. Protein ble høstet i lyseringsbuffer inneholdende protease inhibitor cocktail og fosfatase-inhibitor cocktail (Roche, Tyskland). Lik mengde av protein (30 ug) ble lastet og separert på 8% SDS-PAGE. Og deretter, proteiner ble overført til polyvinylidendifluorid-membran (Millipore Co., Billerica, MA, USA) ved 200 mA i 2 timer (100 mA, 1H for Efrin-A1) ved 4 ° C, blokkert i TBS inneholdende 5% BSA (vekt /volum) og 0,1% Tween-20 i 1 time, og inkuberes med egnede primære antistoffer ved 4 ° C over natten. Fortynningen av antistoffer var som følger: Efrin-A1 (1:500) Enos (1:600), P-eNOS
Ser1177 (1:1000) Akt (1:1000), P-Akt
Ser473 (1:1000) og β-aktin (1:2000). Etter fem vaskinger 5 min, ble blokkene inkubert med pepperrot peroksyd-konjugert sekundært antistoff (fortynning 1:10,000) (Jackson Immunoresearch Laboratories) i 1 time ved romtemperatur. Endelig ble bånd undersøkt ved hjelp av ECL pluss vestlige blotting gjenkjenning reagenser (Beyotime, Kina). Western blot-analyse ble gjentatt minst tre ganger under lignende betingelser.
Statistical Analysis
Alle data ble presentert som gjennomsnitt ± SEM. Én-veis analyse av varians (ANOVA) ble anvendt for å sammenligne forskjellen mellom prøvegrupper.
P
verdier mindre enn 0,05 ble betraktet som signifikant forskjellig.
Resultater
Efrin-A1 Forbedret Angiogenese in vitro
EphA2 reseptor uttrykker seg positivt i våre dyrkede HUVECs (Figur S1A-C). Den ikke-pre-klynge humant rekombinant Efrin-A1-Fc ble brukt for å fastslå effekten av Efrin-A1 på spredning, migrasjon og rør formasjon i HUVECs. Våre resultater viste at Efrin-A1-Fc kunne gi en betydelig økning HUVECs migrasjon (fig S2A, B) og rør dannelse på matrigel (figur S3A-D), uten at det innvirker på celleformering (figur S4). Disse resultatene var i samsvar med tidligere rapporter [19], noe som bekrefter Efrin-A1 modulering av angiogenese.
Efrin-A1 Induksjon av angiogenese medieres av eNOS Aktivering og ingen produksjons
Selv om eNOS /NO har vært ansett som en viktig effektor i tumor angiogenese, har ingen tidligere studier adressert om eNOS /NO mekle Efrin-A1-indusert angiogenese. NO deteksjonsanalyse viste en dramatisk økning i NO-produksjon i supernatanten av kultur HUVECs etter inkubasjon med 1 ug /ml Efrin-A1-Fc i 24 timer (figur 1). Det var en signifikant statistisk forskjell i NO-produksjon mellom kontrollgruppen (10,4 ± 3,4 uM) og Efrin-A1-Fc-stimulering gruppe (42,1 ± 4,1 uM). Når NO-produksjon ble hemmet med L-NAME (100 uM), ble viklet lukkehastighet dempes dramatisk (figur 2A) (fig S2A, B), og mindre intakt rør strukturer og forgreningspunktene ble observert i Efrin-A1-stimulert HUVECs (figur 2B) (figur S3A-D), som viser en signifikant reduksjon i cellemigrering og rør dannelse (figur 2C, 2D). Disse resultatene antydet at eNOS /NO kan spille en nøkkelrolle i Efrin-A1-indusert angiogenic prosessen.
Data viste en signifikant økt NO produksjon i EA1-Fc gruppe. (*,
P
0,05, n = 3)
A:. Cell migrasjon analysen viste at L-NAME og LY294002 hemmet Efrin-A1-stimulert migrasjon av HUVECs ( 200 ×). B: Tube-analysen viste at L-NAME og LY294002 hemmet Efrin-A1-stimulert tube dannelse av HUVECs (200 ×). Pilspisser presenterte HUVECs som strakte seg utilstrekkelig. C: Kvantifisering av A. D: Kvantifisering av B. (*,
P
0,05, n = 3)
For videre studier, eNOS uttrykk og fosforylering status var. undersøkt i Efrin-A1-stimulert HUVECs. Som vist i figur 3A, 3B, 3C, ble ingen signifikante eNOS-ekspresjon endringer detektert av immunfluorescens, real-time PCR og western blot analyse. Imidlertid Efrin-A1-Fc stimulering forårsaket en hurtig tidsavhengig økning i eNOS-fosforylering ved stedet Ser1177 (figur 3D) (figur S5). P-eNOS
Ser1177 begynte å heve seg betydelig i ca 10 min og nådde til maksimal effekt i 30 minutter og nedsatt etterpå (Figur 3E). Disse data antydet at P-eNOS
Ser1177 aktivisering, men ikke øke Enos uttrykk er hovedsakelig ansvarlig for forhøyet NO produksjon i Efrin-A1-indusert angiogenese.
immunfluorescens (A), Real-time PCR ( B) og Western blot-analyse (C) viste at Efrin-A1-Fc hadde ingen effekt på eNOS-ekspresjon av HUVECs (#
P
0,05, n = 3). D: Western blot som viser at P-eNOS
Ser1177 og P-Akt
Ser473 ble oppregulert etter Efrin-A1-Fc stimulering i en tidsavhengig måte. E: Antall analyse av P-eNOS
Ser1177. F: Antall analyse av P-Akt
Ser473. (*,
P
0,05, n = 4).
PI3K /Akt er nødvendig for Efrin-A1-indusert P-eNOS
Ser1177 i HUVECs
som vist i figur 3D, 3F, Efrin-A1-avhengig P-eNOS
Ser1177 ble også ledsaget av en tilsvarende hurtig fosforylering og aktivering av Akt
Ser473, noe som tyder Akt kan fungere som en viktig oppstrøms modulator som bidrar til P-eNOS
Ser1177 i denne prosessen. Mens PI3K er blitt tatt som en direkte kontrollør av Akt [20] – [22], LY294002 (50 uM) ble anvendt i vårt studium for å bekrefte dens effekt på fosforylering av Akt og eNOS. Våre resultater viser at ikke bare P-Akt
Ser473 men også P-eNOS
Ser1177 ble svekket ved behandling med LY294002 (figur 4A-C) (figur S6), avdekke at PI3K er grunnleggende for Akt fosforylering av ephrin- A1 og i sin tur fosforylerer eNOS på stedet Ser1177. Videre, for å bestemme hvorvidt PI3K /akt-aktivering var involvert i Efrin-A1-induserte cellulære funksjoner, ble LY294002 tilsatt til kulturmediet, og dens virkning på ECS ble evaluert ved bunnen av såret analysen og rør formasjon assay. Som vist i figur 2A, 2B, etter eksponering for LY294002, ble det til lukking av sår sank betydelig i sammenligning med EA1-Fc-gruppe (figur 2C); HUVECs på Matrigel strukket utilstrekkelig, ble mindre forgreningspunktene registreres og færre intakte tube strukturer ble observert i EA1-Fc + LY294002 gruppe (Fig. 2D). Disse funnene antydet at Akt fosforylering spille en avgjørende rolle i Efrin-A1 indusert HUVECs angiogene funksjoner. Til sammen kan vi trekke en konklusjon om at Efrin-A1 induserer aktivering av eNOS via PI3K /Akt-avhengige signalveien i sin pro-angiogene funksjoner
A:. Representative vestlige blotter for P-eNOS
Ser1177 og P-Akt
Ser473 fra HUVECs som ble sultet i 0,1% BSA EBM-2 natten over og stimulert med Efrin-A1-Fc (1 pg /ml) i 30 min alene eller sammen forbehandlet med LY294002. B: Antall analyse av P-Akt
Ser473. C: Antall analyse av P-eNOS
Ser1177. (*,
P
0,05, n = 4) (#
P
0,05, n = 4)
Hypoksi oppregulert. Efrin-A1 Expression og Løselig Efrin-A1 Utskillelse i kreftceller
Kreftceller celler~~POS=HEADCOMP ble dyrket under hypoksi og normoxia forhold. Celler og supernatanter ble høstet for Efrin-A1 analyse ved Western blot. Sammenlignet med celler dyrket i normoxia, ble SCC-9-celler utsatt for hypoksi oppdaget en markert økning i Efrin-A1 ekspresjon i en tidsavhengig måte, med den maksimale effekten som vises ved 24 timer (figur 5A) (fig S7A, B). Enda viktigere, Efrin-A1-proteinet ble også påvist positivt og økt betydelig i supernatantene fra hypoksi-grupper, nivået som var mye høyere sammenlignet med de normoxia gruppene (figur 5B) (fig S7C, D), noe som tyder på at cancercellene kan skiller også løselig form av Efrin-A1 i tumor hypoksisk mikromiljø. Forbløffende, som vist i figur 5A, både normoxia og hypoksi gruppe hadde lignende Efrin-A1 uttrykk tendens i SCC-9 celler. Den Efrin-A1 begynte å øke i omtrent 6 timer, ankom maksimumspunktet i løpet av 12 timer til 24 timer og deretter redusert senere. En mulig negativ feedback mekanisme kan ha vært involvert i denne spesielle prosessen. Efrin-indusert reseptor endocytose har vært studert i en rekke biologiske systemer. Ved vekselvirkning Efrin-A1 ligand og EphA2 reseptor, ligand-receptor-komplekser kan internaliseres begge veier i tumorceller [23], [24]. Dette ligand-reseptor komplekser intern kan videre fungere som en negativ feedback motivasjon i å kontrollere Efrin-A1 uttrykk. Slik at det er mulig at den økende EphA2 aktivering av både membranbundet og oppløselig Efrin-A1 i SCC-9 celler hadde resultert i nedregulering av Efrin-A1. Som for grunnen Efrin-A1 er økt dramatisk mellom tidspunkter 6 timer og 12 timer selv i normoxia gruppe, er det fortsatt behov ytterligere undersøkelser
A:. Western blot viser at hypoksi forhøyet membranbundne Efrin-A1 uttrykk i SCC-9 celler. B: Western blot viser at hypoksi oppregulert løselig Efrin-A1 i supernatantene til SCC-9 celler. SCC-9 celletetthet på 70-80% konfluens ble tatt som 0-t når friskt kulturmedium ble tilsatt. C: Cell avrunding analysen viser at løselig Efrin-A1 i CM kunne aktivere EphA2 i U-251 GBM celler. Efrin-A1 (S), løselig Efrin-A1; N, normoxia kondisjonert medium gruppe; H, hypoksi kondisjonert medium gruppe.
Cell avrunding er et karakteristisk respons på funksjonell Efrin-A1 [18], [25]. U-251 GBM celler naturlig over-express EphA2 og har svært lavt nivå av Efrin-A1 [26]. Evnen av oppløselig Efrin-A1 in CM å indusere celle avrunding av U-251 GBM-celler ble undersøkt. Som vist i figur 5C (figur S8), behandling av U-251 GBM-celler med enten CM eller Efrin-A1-Fc resulterte i en drastisk endring i cellemorfologi, noe som reflekterer ved celle avrunding så tidlig som 15 minutter, ankommer titt virkning i 30 min og avtagende etter 2 timer etter CM og Efrin-A1-Fc-behandling. Selv ble observert morfologiske endringer av U-251 celler i henhold CM stimulering, ytterligere funksjonelle eksperimenter er fortsatt nødvendig for å vise om hypoksi-indusert løselig Efrin-A1 kan indusere EphA2 fosforylering eller tumor angiogenese.
signalkaskade som er involvert i Efrin-A1-indusert angiogenese er preget skjematisk i Figur 6.
Diskusjoner
Den aktuelle studien avdekket en mekanisme der Efrin-A1 modulerer angiogenese og en drivende faktor for Efrin-A1 opp -regulering. Efrin-A1-indusert angiogenese medfører økt NO-produksjon som er etterfølgende til et PI3K /Akt-avhengig aktivering av P-eNOS
Ser1177 i endotelceller. Hypoksi kan aktivt indusere forbedring av både membranbundne og løselige Efrin-A1 i tumorceller. Disse resultatene gir det første bevis på at PI3K /Akt /eNOS signalkaskade kan representere en felles vei for hypoksi-induserbar Efrin-A1-avhengige angiogenese i vaskulær utvikling og tumorprogresjon.
Samler bevis bekreftet at effektiv angiogenese krever bioaktive NO syntetisert ved eNOS som er hovedsakelig uttrykt i vaskulære endotelceller. Det har blitt rapportert at NO er en viktig formidler av VEGF-indusert angiogenese, som kan blokkeres av L-NAME [27]. På samme måte kan Statiner oppregulerer eNOS-ekspresjon, og fremme NO-avhengige angiogenese ved å redusere caveolin-en overflod [28]. For første gang, fant vi at INGEN produksjonen er også viktig for angiogenese i respons til den pro-angiogene molekyl Efrin-A1. Efrin-A1-Fc-indusert cellemigrasjon og kapillær forsamlingen ble svekket når egenkapitalbevis ble behandlet med L-NAME. Forbløffende nok vår videre studier viste at forhøyet NO syntese i Efrin-A1-indusert egenkapitalbevis ble i hovedsak tilskrives eNOS fosforylering på Ser1177 rester, men ikke forbedring av eNOS uttrykk. Det er vel kjent at fosforylering er en av de viktigste etterovergangs regulatoriske mekanismer som ligger til grunn eNOS-aktivering [20], [29]. Som støtte bevis av våre funn, er mange typer stimuli som fremmer eNOS aktivisering også observert å forårsake fosforylering på ulike områder, for eksempel Thr495, Ser633 og Ser1177 [30]. Våre funn gir det første bevis på at Efrin-A1 har en koordinert cross-talk med eNOS /NO fremme angiogenese.
Selv om korrelasjonen av økt eNOS aktivitet med Efrin-A1-stimulert angiogenese ble funnet i denne studien, signalveien involvert i Efrin-A1-indusert økning av eNOS aktivitet fortsatt trenger videre etterforskning. Det har blitt rapportert at skjærspenning-indusert NO-produksjon synes å være styrt av Akt-avhengig fosforylering av eNOS i dyrkede ECS [31]. I tillegg har proteinkinase Akt blitt vist å fungere som en EC overlevelsesfaktor og for å fremme røret dannelse in vitro [32]. Tidligere studier har også antydet at PI3K /Akt sti formidle angiogenese indusert av flere angiogene stimuli, slik som VEGF [33], forskolin [34], vektløshet [35], og så videre. For å undersøke funksjonelle involvering av PI3K /Akt sti i Efrin-A1-eNOS krysstale, effekten av LY294002 på Efrin-A1-induserte signale hendelser ble bestemt. Etter stimulering med Efrin-A1-Fc i 30 minutter, fosforyleringen av både Akt og eNOS ble hevet betydelig. Denne høyden var på grunn av fosforylering av Akt
Ser473 og eNOS
Ser1177, som demonstrert av western blot analyse. Eksponering for LY294002 forhindret Efrin-A1-indusert ekspresjon av P-Akt
Ser473 og P-eNOS
Ser1177 tilsynelatende, noe som indikerer at PI3K /Akt -avhengig signalveien deltatt i styre Efrin-A1-mediert aktivering av eNOS.
Hypoksi er en av de viktigste egenskaper i tumor mikromiljøet, og modulerer varianter av angiogene faktorer så som vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) [36]. Efrin-A1 er også kjent som en angiogen faktor, og spiller sentral rolle i neovaskularisering i forskjellige cancere [4]. Tidligere studier har funnet at Efrin-A1-genet kan induseres av tumor nekrose faktor-α (TNF-α) på endoteliale celler [37]. Nylig, Uemura et al. identifisert Efrin-A1 som en mulig kandidat hypoksi-induserbar genet ved microarray analyse av vevsprøver fra metastatisk kolorektalcancer [38]. Også, uttrykket av Efrin-A1 og relaterte gener ble markert redusert i HIF-2α knockdown (kd /kd) endotelceller, noe som tyder rolle hypoksi i Efrin-A1 regulering [39]. I denne studien har vi gitt direkte bevis for at eksponering for hypoksi resulterte i forhøyet Efrin-A1 uttrykk i kreftceller ved western blot analyse. Efrin-A1 ble først identifisert som et GPI-forankret protein som krever membranbinding eller clustering /oligomerisering for sin aktivering av EphA2 [40]. Derfor våre resultater antydet at oppregulering av membran-bundet Efrin-A1 indusert ved hypoksi kan fremme tumorangiogenese gjennom interaksjon med sin reseptor EphA2 på endotelceller i tumoren mikromiljø. I tillegg har vi dokumentert i denne studien som hypoksi oppregulert en oppløselig form av Efrin-A1 frigjøring fra kreftceller inn i ekstracellulære omgivelser. I tråd med våre funn, har Efrin-A1 også blitt påvist i serum hos pasienter med leverkreft [41]. Nylig har flere studier vist at oppløselige monomere Efrin-A1 er en funksjonell ligand til EphA2, og det oppløselige Efrin-A1 frigjøres fra HeLa og SK-BR3-celler er nødvendig for cellevekst og transformasjon [4]. I likhet med disse studiene, ble det observert morfologiske forandringer fra U-251-celler i henhold CM stimulering. Imidlertid er videre studier er nødvendig for å bekrefte om hypoksi-indusert løselig Efrin-A1 kan funksjonelt samvirke med EphA2 å initiere angiogenese.
I sammendraget, de mest betydningsfulle og nye funn som presenteres i denne studien omfatter at 1) Efrin -A1 samarbeider med eNOS fremme angiogenese i HUVECs; at 2) krysstale mellom Efrin-A1 og eNOS formidles av PI3K /Akt-avhengig veien; og at 3) hypoksi opp-regulerer både membran-bundet og utskilt Efrin-A1 protein i kreftceller. Som bare noen få studier har fokusert på de Efrin-A1-utløst nedstrøms molekylære hendelser, resultatene som presenteres her, identifisere PI3K /Akt-avhengig eNOS
Ser1177 fosforylering som en ny mekanisme underliggende Efrin-A1modulation av angiogenese (figur 6).
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Expression of EphA2 reseptor i de dyrkede HUVECs. Immunfluorescens (A), RT-PCR (B) og Western blot analyse (C) viste positiv EphA2 uttrykk i HUVECs
doi:. 10,1371 /journal.pone.0074464.s001 plakater (TIF)
Figur S2 .
Cell migrasjon analysen viste at L-NAME og LY294002 hemmet Efrin-A1-stimulert migrering av HUVECs (200 ×). Endotelial cellemigrering ble målt i HUVECs som var blitt sultet i vekstfaktor-fri 0,1% BSA EBM-2 natten over og behandlet med Efrin-A1-Fc (1 pg /ml) i 24 timer
doi:. 10,1371 /journal. pone.0074464.s002 product: (TIF)
Figur S3.
Tube-analysen viste at L-NAME og LY294002 hemmet Efrin-A1-stimulert tube dannelse av HUVECs. A, B, C: Representative bilder på 40 ×. D:. Representative bilder på 200 ×
doi: 10,1371 /journal.pone.0074464.s003 plakater (TIF)
Figur S4.
Endotelial celleformering ble målt i HUVECs behandlet med Efrin-A1-Fc (1 pg /ml) i 0 timer, 24 timer og 48 timer. Det var ingen statistisk signifikans mellom EA1-Fc og kontrollgruppe. EA1-Fc, Efrin-A1-Fc. (#
P
0,05, n = 3)
doi: 10,1371 /journal.pone.0074464.s004 plakater (TIF)
Figur S5..
Effekt av Efrin-A1-Fc på fosforylering av eNOS og Akt i HUVECs. A, B, C: Western blot viser at P-eNOS
Ser1177 og P-Akt
Ser473 var oppregulert etter Efrin-A1-Fc stimulering i en tidsavhengig måte
doi:. 10,1371 /journal.pone.0074464.s005 product: (TIF)
Figur S6.
