Abstract
Blærekreft representerer en betydelig menneskelig tumorbyrde, med om lag 7,7% og 2,4% av alle krefttilfeller hos menn og kvinner, henholdsvis. Mens menn har en høyere risiko for å utvikle blærekreft, kvinner har en tendens til å presentere på et senere stadium av sykdommen og med mer aggressive svulster. Tidligere studier har antydet en kampanje rolle androgen signalering i styrke blærekreft utvikling. For å vurdere rollen til androgener i blæren tumorigenesis direkte, har vi utviklet en ny transgen musestamme,
R26hAR
loxP /+
:
Upk3a
GCE /+
, der den menneskelige
AR
transgenet er betinget uttrykt i blæren urothelium. Forbløffende nok både mannlige og kvinnelige
R26hAR
loxP /+
:
Upk3a
GCE /+
mus viser en høyere forekomst av urothelial karsinom (UCC) enn alder og kjønn matchet kontroll littermates som reaksjon på den kreftfremkallende, N-butyl-N- (4-hydroksybutyl) nitrosamin (BBN). Vi påvise ekspresjon av det humane
AR
transgen i CK5-positive og p63-positive celler i basal blære urothelium. Ytterligere analyser av UCC vev fra
R26hAR
loxP /+
:
Upk3a
GCE /+
mus viste at flertallet av tumor celler er av urothelial basal celle opprinnelse. Positiv farging av transgen AR-protein ble observert i de fleste tumorceller i de transgene mus, noe som gir en sammenheng mellom AR transgen ekspresjon og onkogen transformasjon. Vi observerte en økning i Ki67 positive celler i UCC lesjoner av transgene AR mus. Manipulere endogene androgen nivåer ved kastrering og androgen tilskudd direkte berørt blære svulst utvikling hos mannlige og kvinnelige
R26hAR
loxP /+
:
Upk3a
GCE /+
mus, henholdsvis. Tatt sammen, våre data demonstrerer for første gang at betinget aktivering av transgen AR-ekspresjon i blæren urothelium forbedrer carciongen-indusert blæretumordannelse hos mus. Denne nye AR transgen muselinje ligner visse trekk ved menneskelig blærekreft, og kan brukes til å studere blære tumorigenesis og for legemiddelutvikling
Citation. Johnson DT, Hooker E, Luong R, Yu EJ, Han Y, Gonzalgo ML, et al. (2016) betinget uttrykk av androgen Receptor Øker Følsomhet av blærekreft hos mus. PLoS ONE 11 (2): e0148851. doi: 10,1371 /journal.pone.0148851
Redaktør: Irina U. Agoulnik, Florida International University, USA
mottatt: 18 november 2015; Godkjent: 25 januar 2016; Publisert: 10 februar 2016
Copyright: © 2016 Johnson et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:.. Dette arbeidet ble støttet av National Institute of Health gir R01CA070297, R01CA151623, R01CA166894, R21CA190021, og R01DK104941
Konkurrerende interesser: forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
blærekreft representerer en betydelig menneskelig tumorbyrde, med mer enn 70.000 nye tilfeller av blærekreft diagnostisert i landet årlig, noe som resulterer i ca. 16.000 dødsfall [1]. Det står for ca 7,7% og 2,4% av alle krefttilfeller hos menn og kvinner, henholdsvis [1]. Men dødeligheten av mannlige og kvinnelige pasienter er ca 20,4% og 25,4%, henholdsvis [2]. Ovennevnte tyder på at menn har en høyere risiko for blærekreft, mens kvinner har en tendens til å ha mer aggressive svulster. Foreløpig de molekylære mekanismene bak disse kjønnsforskjellene i blæren tumorigenesis er uklare.
Androgen signalering spiller en kampanje rolle i prostatakreft vekst, og dermed er androgen ablasjon terapi en effektiv behandling for pasienter med tidligere ubehandlet prostatakreft [3 ]. Emerging bevis har også innblandet en viktig rolle androgen signalisering i blæren tumorigenesis [4-7]. Ekspresjon av androgenreseptoren (AR) er påvist i både murine og humane blære urothelium og submucosa [7, 8]. Tidligere studier har antydet at androgen signale kan direkte eller indirekte forbedre blærekreft utvikling [7]. Redusert blære svulst forekomst har blitt observert i en Ar knockout musemodell (ARKO) [5, 7]. Det synes imidlertid at det er ingen signifikant korrelasjon mellom tumor karakterer og AR ekspresjonsnivåer i kliniske pasientprøver [8, 9]
A karsinogen-induserte musemodellsystem er blitt hyppig brukt for å undersøke utviklingen av urothelial celle karsinom (UCC). Mus utsatt for N-butyl-N- (4-hydroksybutyl) nitrosamin (BBN) utvikle et spekter av patologier, blære, inkludert muskel-invasive karsinomer, ikke-invasivt karsinom, squamous cell carcinoma, og hyperplasi [10, 11]. Det er interessant i denne musemodellen, en klar kjønnsdimorfisme i blæren karsinogenese er blitt observert [7, 10]. Forekomsten av blærekreft i hannmus var omtrent to ganger større enn i hunnmus [7]. Videre verken mann eller kvinne ARKO musene utviklet blære carcinoma etter 12-ukers eksponering for BBN [7]. I likhet med den full-body Ar knockout mus, hannmus med betinget sletting av Ar i blæren urothelium av uroplakin II (UPII) promoter drevet Cre var mindre utsatt for BBN-indusert blære carcinoma utvikling [5]. I tillegg redusert blære urothelium cellulær proliferasjon ble observert både i hele kroppen og uroteliale spesifikke Ar knockout mus [5, 7]. Disse studiene implisere en salgsfremmende rolle for androgen signalering i onkogene transformasjon av blæren urothelium.
Uroplakin 3a (UPK3a) tilhører uroplakin familie, en gruppe av integrerte membranproteiner [12]. Ekspresjon av proteiner, omfattende UPK Upk3a, er blitt observert på den luminale overflaten til urothelium [13, 14]. Upk3a null mus viste fenotyper av primær vesikoureteral refluks (Vur) og hydronefrose [12].
Upk3a
GFP /CRE /ERT2 /+
(Upk3a
GCE /+
)
gene mus uttrykke en eGFPCreERT2 (Enhanced grønt fluorescerende protein og Cre-ERT2) fusjonsprotein under kontroll av muse
uroplakin 3a product: (
Upk3a
) promoter. I denne musestamme, har tamoxifen-indusert Cre recombinase aktivitet er oppdaget i blæren urothelium av neonatal hemizygotes [15].
For å vurdere biologiske rolle androgen signalisering i blæren tumorigenesis direkte, vi nylig genererte en betinget AR transgen muselinje,
R26hAR
loxP
, der et menneske
AR
transgen ble spesielt rettet inn i ROSA26 locus,
R26hAR
loxP /+ product: [16, 17].
AR
transgenet i denne musen modellen kan konstitutivt uttrykt i en vev bestemt måte gjennom aktivering av
Cre
recombinase [18]. Vi intercrossed
R26hAR
loxP /+ Hotell og
Upk3a
GCE /+
mus for å målrette induserbar uttrykk for
AR
transgenet til blæren urothelium. Både mannlige og kvinnelige
R26hAR
loxP /+
:
Upk3a
GCE /+
mus viste økt mottakelighet for BBN- indusert urothelial cellekreft (UCC) utvikling etter betinget uttrykk for
AR
transgenet. Uttrykk for både cytokeratin 5 (CK5) og p63, cellulære markører for basal celler i blæren urothelium, er oppdaget i tumorceller av UCC lesjoner. Manipulere endogene androgen nivåer ved kastrering og androgen tilskudd direkte berørt blære svulst utvikling hos mannlige og kvinnelige
R26hAR
loxP /+
:
Upk3a
GCE /+
mus, henholdsvis. Til sammen våre data viser for første gang at betinget aktivering av transgen AR uttrykk i blæren urothelium forbedrer carcinogen-indusert blære tumordannelse hos mus.
Materialer og Metode
Muse Eksperimenter
R26hAR-floxed
mus ble generert som tidligere beskrevet [18]. For å generere den betingede
AR
transgene mus, vi intercrossed
R26hAR
loxP /vekt
mus med
Upk3a
GCE /+
stamme (JAX lager: 015 855). For genotyping, ble musehale tips isolert mellom alder 2-3 uker og inkuberes i lyseringsbuffer (Cat # 102-T, VIAGEN Biotech, LA, California) over natten ved 55 ° C. Prøvene ble kort sentrifugert ned og genomisk DNA ble oppløst i TE-buffer. Tre primere som kan skille villtype fra AR mål-allele ble anvendt for genomisk PCR-amplifikasjon. Den fremre primer, 5′-CTCTGCTGCCTCCTGGCTTCT-3 «, ble anvendt for både villtype og målrettede alleler, og den reverse primer for villtype-allelet var 5′-CGAGGCGGATCACAAGCAATA-3′, og for målrettet allel var 5»-TCAATGGGCGGGGGTCGTT- 3 «. PCR-fragmentene for genotyping ble amplifisert ved 94 ° C i 5 minutter, deretter 94 ° C i 20 sekunder, 64 ° C i 30 sek, og 72 ° C i 25 sek for 30 sykluser, deretter 72 ° C i 2 min. For å vurdere rekombinasjon, ble det fremre primer 5»-TTCGGCTTCTGGCGTGTGAC-3 «og reversprimeren 5′-GCTGTGATGATGCGGTAGTC-3» anvendt i genomisk PCR-reaksjoner. PCR-fragmenter ble amplifisert ved 95 ° C i 5 minutter, deretter 95 ° C i 45 sek, 63 ° C i 50 sek, og 72 ° C i 2 minutter i 40 sykluser, og deretter 72 ° C i 5 min.
For kastrering eksperimenter og testosteron pellets innsetting, både
R26hAR
loxP /+
:
Upk3a
GCE /+
mus og deres kontrollkullsøsken ble bedøvet av IP-injeksjon med ketamin og xylazin. Å kastrere hannmus, ble begge testiklene og bitestiklene fjernet gjennom en scrotal tilnærming. Den distale enden av sædlederen ble ligert med silkesutur som tidligere beskrevet [19]. For pellet innsetting, ble hunnmus bedøvet som beskrevet ovenfor. Den testosteron pellets ble innsatt subkutant i ryggen på nakken. Alle dyreforsøk utført i denne studien ble godkjent av Administrative Panel on Laboratory Animal Care ved Stanford University.
Tamoxifen Injection og BBN Behandling
Både 5 uker gamle
R26hAR
loxP /+
:
Upk3a
GCE /+
mus og deres kontrollkullsøsken ble administrert tamoxifen i maisolje, ca 5 mg /25 g kroppsvekt, ved IP-injeksjon fem ganger i løpet av en periode på tre uker. Etter den siste injeksjon ved 8 ukers alder ble mus gitt ledningsvann inneholdende 0,1% av N-butyl-N- (4-hydroksybutyl) nitrosamin (BBN) ad libitum (TCI America, Portland, OR) i 12 uker, og deretter normal vann i en uke før analyser. Musene ble avlivet og urinblære og andre abnormale vev ble samlet og bevart i 10% nøytral bufret formalin. Musevev ble innstøpt i parafin, snittet og farget med hematoksylin og eosin (H E). Minst tre individuelle lysbilder fra hver mus ble utarbeidet og vurderes for patologiske forandringer.
Immunohistochemistry, immunfluorescens og Histologiske Analyser
Mus vev ble fiksert i 10% nøytral-bufret formalin og behandlet i parafin for immunhistokjemi. Prøvene ble kuttet i 5-um seksjoner, deparaffinized i xylen, og rehydrert ved anvendelse av en avtagende gradient etanol, etterfulgt av PBS. Antigen gjenfinning ble oppnådd ved koking vevssnitt i 0,01 M citratbuffer (pH 6,0). Vevene ble deretter blokkert med 3% hydrogenperoksid i metanol og protein blokkert i 15 og 30 minutter for henholdsvis å hemme endogen peroksidase-aktivitet og ikke-spesifikk antistoffbinding, henholdsvis. Prøvene ble utsatt for en 1:30 fortynning av anti-humant AR-antistoff (Santa Cruz Biotechnology, sc-7305), 1: 300 fortynning av anti-mus /humant AR (Santa Cruz, sc-816, N-20), 1 : 300 fortynning av anti-p63 antistoff (Santa Cruz, sc-8431), 1: 1000 av anti Ki67 antistoff (Novacastsra, NCL-Ki67), 1: 1000 av CK-5-antistoff (Covance, PRB-160P), 1: 1000 av CK8 antistoff (Covance, MMS-162P), i 1% geiteserum ved 4 ° C over natten. Platene ble deretter inkubert med biotinylert anti-kanin eller anti-mus sekundært antistoff (Vector Laboratories, BA-1000 eller BA-9200) i 1 time og pepperrotperoksydase streptavidin (Vector Laboratories, SA-5004) i 30 minutter ved romtemperatur, og deretter visualisert ved DAB kit (Vector Laboratories, SK-4100). Objektglassene ble deretter motfarget med 5% (w /v) Harris hematoxylin. For histologisk analyse, ble 5-mikrometer seriesnitt behandlet fra xylen til vann gjennom en avtagende etanol gradient, farget med hematoksylin og eosin, og behandles tilbake til xylen gjennom en økende etanol gradient. For immunfluorescens-analyser, ble 5-um seksjoner kokt i 0,01 M citratbuffer (pH 6,0) i 20 minutter etter re-dehydratisering fra xylen til vann, og blokkert med 5% geiteserum. Vevssnitt ble deretter inkubert med 1:30 fortynning av anti-humant AR-antistoff (Santa Cruz Biotechnology, sc-7305), 1: 300 fortynning av anti-mus /humant AR (Santa Cruz, sc-816), eller 1: 100 fortynning av anti-p63 antistoff (Santa Cruz, sc-8343), 1: 1000 av CK-5-antistoff (Covance, PRB-160P), 1: 1000 av CK8 antistoff (Covance, MMS-162P), og enten 1: 200 av anti-GFP (Invitrogen, A11122) eller 1: 150 av anti-GFP (Cell Signaling, 2955) i 1% geiteserum ved 4 ° C over natten. Geit-anti-mus Alexa Fluor 594 (Molecular Probes, A21203), eller geite-anti-kanin Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, A11034) ble inkubert ved 1: 500 fortynning i 1 time ved romtemperatur. Snittene ble montert av Vectashield Monterings medium med DAPI (Vector Laboratories, H-1200). Fremstilling og undersøkelse av mTmG vevsprøver ble utført som tidligere beskrevet [20]. Bilder for alt han og immunhistokjemi eksperimenter i denne studien ble kjøpt på en Leica dissekere mikroskop (modell MZ9
5) med Zeiss Axiovision programvare. Immunofluorescent bildene ble tatt med et Olympus BX-52 mikroskop.
Statistiske analyser
Vi presenterte data som gjennomsnitt ± SD. Vi har gjort sammenligninger mellom grupper ved hjelp av et tosidig Student
t
test. P 0,05 og P 0,01 ble betraktet som signifikant
Resultater
Uttrykk av Upk3a i Mouse Blære urothelium
Upk3a
GCE /+
, transgene mus ble samlet inn ved å sette inn en tamoxifen-induserbar Cre rekombinase (CreERT2) og EGFP-fusjonsgenet under kontroll av muse
Upk3a
promoter. Som rapportert tidligere,
Upk3a
GCE /+
mus vises fenotypisk normal uten noe unormalt [15]. Å identifisere Upk3a uttrykk celler, vi genererte
Rosa26-mT /mg product: (
R26RmT /mg
):
Upk3a
GCE /+
mus ved intercrossing
R26RmT /mg product: [20] og
Upk3a
GCE /+
musestammer (fig 1A). I denne musemodell, tamoxifen (TM) indusert Cre aktivitet kan bytte membran-bundet tdTomato (mT) til membranbundne grønt fluorescerende protein (mGFP) uttrykk gjennom rekombinasjon av floxed reporter loci i målrettede celler. Vi administreres en dose av tamoxifen (TM) eller kjøretøy kontroll til seks uker gammel
R26RmT /mg
:
Upk3a
GCE /+
mus og analysert dem to uker etter injeksjon (fig 1B). Vi observerte spesifikke uttrykk for mGFP uttrykk i blæren urothelium av TM-indusert
R26RmT /mg
:
Upk3a
GCE /+
mus, men ikke i ikke-indusert kontroller (figur 1C-1D «). Det har vært antydet at voksen gnager blære urothelium består av tre separate populasjoner av celler: paraply, middels, og basal celler. Umbrella celler, også kjent som overfladiske celler, linje blære lumen og svært ekspress uroplakins og CK8, men ikke p63 eller CK5 [10]. Mellom celler ligge under paraplyen cellene og uttrykke både uroplakins og p63, men ikke CK5. Basal celler ligge ved siden av lamina propria og omkringliggende muskler og hurtig CK5 og p63 [21-23]. Ved hjelp av co-immunfluorescens analyser, preget vi videre mobil identitet mGFP uttrykk celler i blæren urothelium med CK5, Ck8, og P63 antistoffer (Fig 1E-1G «). Vi observerte ekspresjon av CK5 (figur 1E »), p63 (figur 1 F»), og CK8 (figur 1G «) belagt med mGFP flekker som tyder på at de fleste av cellene i blæren urothelium målrettes ved
Upk3a
GCE /+
mus [21]
(A) Skjematisk demonstrere Cre-mediert merking av Upk3a
GCE /+ -. positive celler med mT /mg reporter system. (B) Tidsplan for tamoxifen (TM) injeksjon for å utløse Cre rekombinasjon av
R26
mTmG /+
:
Upk3a
GCE /+
mus. (C-C «) Lavere og høyere forstørrelse bilder av merket mT, mtd-tomat, (rød) eller mg, mGFP, (grønn) i blæren urothelium av
R26
mTmG /+
:
Upk3a
GCE /+
før TM injeksjon (n = 4). (D-D «) Lavere og høyere forstørrelse bilder av merket mT (rød) eller mGFP (grønn) i blæren urothelium i
R26
mTmG /+
:
Upk3a
GCE /+
følgende TM injeksjon (n = 6). (EG) Immunofluorescent bilder av blæren urothelium av TM injisert
Upk3a
GCE /+
R26
mTmG /+
mus co-farget med antistoff mot GFP (for eksempel «) med p63 (E»-E»), CK5 (F»-F «), eller CK8 (G»-G») (n = 6).
betinget uttrykk av AR Transgene i Mouse Blære urothelium
Selv om den potensielle effekten av Ar har blitt vurdert tidligere ved hjelp av en vev-spesifikk Ar knockout mus modell drevet av UPII-Cre modell [5], AR-mediert onkogen transformasjon i blæren tumorigenesis fortsatt uklart. Referere direkte til salgsfremmende rolle AR i blærekreft initiering og progresjon, vi genererte
R26hAR
loxP /+
:
Upk3a
GCE /+
mus (fig 2A). Som vist i
R26RmT /mg
:
Upk3a
GCE /+
mus, kan uttrykk for transgen AR protein bli indusert i blæren urothelium etter TM administrasjon. Vi administrert TM til
R26hAR
loxP /+
:
Upk3a
GCE /+
og R26hAR
loxP /+
kontroller som starter på 5 ukers alder (figur 2B). Ved hjelp av genomisk PCR tilnærminger, bekreftet vi aktiviteten til
Creer
i blæren vev, noe som resulterer i en 300 bp PCR fragment som tilsvarer sletting av
LSL
kassett gjennom
loxP /Cre
rekombinasjon i blæren vev av
R26hAR
loxP /+
:
Upk3a
GCE /+
mus med TM induksjon , men ikke i de av
R26hAR
loxP /+
mus ved 8 ukers alder (figur 2C). Vi bekreftet transgen AR protein uttrykk gjennom immunhistokjemi med enten et antistoff (441, Santa Cruz, sc-7305) spesifikt for transgen menneskelig AR protein, hår, eller et antistoff (N-20, Santa Cruz, sc-816) mot både menneskelige og mus AR proteiner, m HAR. Ved hjelp av disse to forskjellige antistoffer tillatt oss å skille transgen menneskelig AR fra endogent mus Ar i mus blæren vev. Nuclear AR flekker med m Har antistoff er oppdaget i blæren urothelium av både
R26hAR
loxP /+
:
Upk3a
GCE /+ plakater (figur 2F og 2F «) og
R26hAR
loxP
kontrollmus (figur 2D og 2D «), selv om intensiteten av det tidligere er sterkere enn sistnevnte. Som ventet ble positivt nukleær farging med den menneskelige AR spesifikt antistoff, hår, bare observert i blæren uroteliale vev isolert fra
R26hAR
loxP /+
:
Upk3a
GCE /+
mus (fig 2E og 2E). Disse dataene indikerer at uttrykk for
AR
transgenet i blæren urothelium er et resultat av
loxP /Cre
rekombinasjon gjennom TM-aktivert
Cre
transgen drevet av
Upk3a
promoter.
(A) Skjematisk skildrer Cre /loxP-mediert rekombinasjon, noe som resulterer i sletting av STOP kassetten fra
R26AR transgen
allel. (B) Eksperimentell oppsett for tamoxifen-indusert menneskelig
AR
transgene uttrykk. (C) Genomisk PCR-analyser av rekombinasjon med spesifikke primere for menneske
AR
transgene allel (se figur 2A) med blære urothelium vevsprøver av
R26AR
loxP /+
Upk3a
GCE /+ Kjøpe og
R26AR
loxP /+
mus. AR trangene allelet ble påvist i prøver av både
R26AR
loxP /+
Upk3a
GCE /+ Hotell og
R26AR
loxP /+
mus (svart pil), men TM indusert rekombinasjon på AR transgene allel ble bare observert i
R26AR
loxP /+
Upk3a
GCE /+
mus (hvit pil). (D-F «) Immunhistokjemisk farging av blæren urothelium av TM injisert
R26AR
loxP /+
mus ved hjelp av enten antistoff som er reaktive til både mus og menneske AR protein ( m hår), eller antistoff som er reaktivt å bare menneskelig AR (Har) (n = 9). (F-G «) Immunhistokjemisk farging av blæren urothelium med de to forskjellige AR antistoffer som beskrevet ovenfor ved hjelp av prøver av TM-injisert
R26AR
loxP /+
Upk3a
GCE /+
mus (n = 12). (HK «) Enkanal og fusjonert Immunofluorescent bilder av blæren vev av TM-injisert
R26AR
loxP /+ Hotell og
R26AR
loxP /+
Upk3a
GCE /+
mus farget med antistoffer mot CK5 p63, og den menneskelige AR (i rødt) (n = 6).
ved hjelp immunofluorescent tilnærminger, vi ytterligere bekreftet uttrykk for transgen AR protein i blæren urothelium gjennom TM-indusert
loxP /Cre
rekombinasjon i
R26hAR
loxP /+
:
Upk3a
GCE /+
mus (fig 2J «og 2K»), men ikke i
R26hAR
loxP /+ bare kontroll mus (fig 2 H «og 2I). I tråd med vår observasjon i
R26RmT /mg
:
Upk3a
GCE /+
mus, observerte vi en klar overlapping av transgen AR uttrykk med både CK5 og p63 uttrykk i urotelialceller
R26hAR
loxP /+
:
Upk3a
GCE /+
mus (fig 2J » og 2K «), noe som tyder på at transgene AR uttrykk er til stede i basal og mellomcellepopulasjoner i blæren urothelium [21].
Betinget uttrykk av transgene AR i Mouse blære urothelium Forbedrer Mottakelighet for kreftfremkallende-indusert tumordannelse
N-butyl-N- (4-hydroksybutyl) nitrosamine (BBN) er en veletablert kreftfremkallende som har blitt hyppig brukt hos gnagere å indusere kreft i urinblæren [24], som bærer betydelige histopatologiske og molekylære likheter med sykdom hos mennesker [25]. Derfor vurderte vi om transgen AR uttrykk i blæren urothelium endrer mottakelighet for BBN-indusert tumordannelse. Begge
R26hAR
loxP /+
:
Upk3a
GCE /+
og R26hAR
loxP /+
mus ble administrert TM på 5 ukers alder, og ble deretter behandlet med 0,1% BBN i drikkevannet starter ved 8 ukers alder, i 12 uker. Mus ble avlivet en uke etter avsluttet behandling BBN (figur 3A). Brutto og histologiske analyser viste et spekter av patologiske forandringer i blæren urothelium, som inkluderte hyperplasia, carcinoma
in situ
, non-invasiv urothelial cellekreft, og invasiv urothelial cellekreft (Fig 3B-3E). Interessant, åtte av tolv mannlige
R26hAR
loxP /+
:
Upk3a
GCE /+
mus utviklet invasiv urothelial cell carcinoma (67%), som bærer de mest alvorlige tumor fenotyper i forhold til mus av andre genotyper (figur 3F). I kontrast, bare tre av tretten år matchet mannlig
R26hAR
loxP /+
kontrollkullsøsken utviklet invasiv urothelial cellekreft (23%). Videre fem av tretten kvinnelige
R26hAR
loxP /+
:
Upk3a
GCE /+
mus også utviklet invasiv urothelial cellekreft (39%), mens ingen alders matchet kvinnelig
R26hAR
loxP /+
kontrollkullsøsken utviklet enten ikke-invasive eller invasive uroteliale cellekreft (fig 3F). Disse dataene viser at betinget uttrykk for transgen AR i blæren urothelium celler øker mottakelighet for onkogen transformasjon og tumor aggressivitet i både mannlige og kvinnelige
R26hAR
loxP /+
:
Upk3a
GCE /+
mus med BBN induksjon.
(A) Forsøksplanlegging å indusere transgene uttrykk og blære karsinogenese i
R26AR
loxP /+ Hotell og
R26AR
loxP /+
Upk3a
GCE /+
. (BE) Low (BE) og høy (B»-E «) forstørrelse bilder av H E flekker som viser omfanget av patologiske forandringer i
R26AR
loxP /+
Upk3a
GCE /+
mus etter TM injeksjon og BBN behandling beskrevet i (A) (Hyperplasi: n = 30, carcinoma in situ n = 5, ikke-invasiv carcinoma: n = 1, invasiv carcinoma: n 17 =). (F) Analyse av forekomsten av hyperplasi eller uroteliale cellekreft utvikling hos mus med ulike genotyper.
BBN-Induced urothelial cellekreft i
R26hAR
loxP /+
:
Upk3a
GCE /+
Are urothelial Intermediate og Basal Cell Origin
det er vist at BBN indusert utviklingen av blæren urothelial cellekreft hos mus [6, 22]. For ytterligere å definere opprinnelsen til blæren svulster i
R26hAR
loxP /+
:
Upk3a
GCE /+
mus utførte vi immunhistokjemiske analyser for å undersøke en rekke cellulære markører i tumorvev. Som vist i figur 4A-4D «, tumorceller viste positiv farging med det humane AR-antistoff (figur 4A og 4A), noe som tyder på en sammenheng mellom AR transgen ekspresjon og BBN-indusert onkogen transformasjon. Tumorceller viste sterk positiv farging for CK5 (figur 4B og 4B), som er et kjennetegn av patologier som stammer fra den basalceller [22]. Svak farging av CK8 ble også observert i tumorceller (figur 4C og 4C «). De fleste tumorceller ble også reaktivt overfor p63-antistoff (figur 4D og 4D). Ved hjelp av co-immuno-metoder, karakterisert vi videre den cellulære identiteten av tumorceller. Nuclear farging av transgen AR kledde jevnt med cytoplasmamembranen farging av CK5 i tumorceller av
R26hAR
loxP /+
:
Upk3a
GCE /+
mus (fig 4F-4F «). I tillegg er de fleste CK5 positive tumorceller isolert fra både
R26hAR
loxP /+
:
Upk3a
GCE /+ Hotell og
R26hAR
loxP /+
mus var også reaktiv til p63 antistoffer (fig 4G-4H «). Samlet utgjør disse data tyder på at opprinnelsen til BBN-indusert blære urothelial cellekreft er i hovedsak hentet fra basal celler i
R26hAR
loxP /+
:
Upk3a
GCE /+
mus og
R26hAR
loxP /+
kontroller.
(AD) lav (AD) og høy (A»-D «) forstørrelse bilder av immunhistokjemisk farging med antistoffet mot den humane AR, Har (A-A») og CK5 (B-B «), CK8 (C-C»), eller p63 (D- D «) i blæren svulster fra
R26AR
loxP /+
Upk3a
GCE /+
mus (n = 3 ). (EF «) Immunofluorescent analyser av blæren tumorvev isolert fra
R26AR
loxP /+ Hotell og
R26AR
loxP /+
Upk3a
GCE /+
mus. Enkelt kanal og fusjonerte bilder som viser CK5 (grønn) og menneskelig AR (rød) samlokalisering i blæren svulster i mus vev (n = 3). (GH «) Lignende analyser som beskrevet ovenfor ble utført ved hjelp av antistoff mot CK5 (grønn) eller p63 (rød) i blæren svulster fra
R26AR
loxP /+ Hotell og
R26AR
loxP /+
Upk3a
GCE /+
mus (n = 4). (IL) Immunhistokjemisk analyser av blæren tumorvev isolert fra mannlig eller kvinnelig
R26AR
loxP /+ Hotell og
R26AR
loxP /+
Upk3a
GCE /+
mus ved hjelp av et antistoff mot spredning markør, Ki67 (n = 3). (M) Kvantifisering av Ki67-positive celler oppdages i karsinomer fra begge genotyper i mannlige og kvinnelige mus (n = 3).
Transgene AR Expression Fremmer Tumor Cell Proliferation i blæren av
R26hAR
loxP /+
:
Upk3a
GCE /+
Mus
En salgsfremmende rolle AR i celleproliferasjon har tidligere blitt demonstrert i prostata [26-28]. Vi undersøkte den potensielle effekten av transgene AR uttrykk for å fremme celleformering i blærer av BBN behandlet
R26hAR
loxP /+
:
Upk3a
GCE /+
mus. Vi utførte immunhistokjemi å farge blæren vev lysbilder med Ki67 antistoff fra både mannlige og kvinnelige R
26hAR
loxP /+
:
Upk3a
GCE /+ Hotell og R
26hAR
loxP /+
mus (fig 4I-4L). Ki67 farging ble kvantifisert ved å telle totalt 1000 blære urotelialceller fra fem kraftige felt i hver prøve. Tre mus i hvert kjønn og genotype ble analysert, representative data er vist (fig 4I-4L). Den proliferative indeksen i den mannlige
R26hAR
loxP /+
:
Upk3a
GCE /+
gruppen var omtrent en- ganger høyere enn hos mannlige
R26hAR
loxP /+
kontroll mus, og kvinnelige
R26hAR
loxP /+ Hotell og
R26hAR
loxP /+
:
Upk3a
GCE /+
mus (fig 4M). Disse resultatene implisere en salgsfremmende rolle transgen
AR
uttrykk i mobilnettet spredning av BBN-indusert blære uroteliale svulster.
Androgener spille en dominerende rolle i økt følsomhet for BBN Induced urothelial Carcinoma Utvikling i
R26hAR
loxP /+
:
Upk3a
GCE /+
Mus
I denne studien har vi observert den høyeste forekomsten av BBN-indusert invasive uroteliale cellekreft i mannlig
R26hAR
loxP /+
:
Upk3a
GCE /+
mus sammenlignet med andre sex og genotype mus. I tillegg kreftceller fra
R26hAR
loxP /+
:
Upk3a
GCE /+
mus syntes å være mer proliferativ enn de fra andre grupper av mus. AR er medlem av steroid hormon reseptor super [29], og dens aktivitet er regulert gjennom androgener generelt. For ytterligere å karakterisere rollen til androgen aksen i
R26hAR
loxP /+
:
Upk3a
GCE /+
mus vi manipulert androgen nivåer av enten kastreres hannmus eller supplere hunnmus med androgen pellets. Vi så vurdert BBN-indusert blære tumorgenese i den ovenfor angitte mus (figur 5A). Forbløffende nok kastrert hann
R26hAR
loxP /+
kontroll mus bare utviklet blære urothelial hyperplasia (figur 5B). Men to av fem (40%) kastrert
R26hAR
loxP /+
:
Upk3a
GCE /+
musene uroteliale karsinom. Som vi tidligere har observert, intakt mannlig
R26hAR
loxP /+
:
Upk3a
GCE /+
mus viste den høyeste
