Abstract
Bakgrunn
Distant prostata kreft er ofte hormon ildfast og viser økt vekst ikke lenger hemmet av androgen deprivasjon terapi . Forstå alle molekylære mekanismer som bidrar til ukontrollert vekst er viktig å få effektive behandlingsstrategier for hormon ildfast prostatakreft (HRPC). Aryl hydrokarbon-reseptor (AhR) påvirker en rekke biologiske prosesser, inkludert cellevekst og differensiering. Flere studier har vist at eksogene Ahr ligander hemmer celledeling, men nyere bevis tyder AhR kan ha iboende funksjoner som fremmer cellulær proliferasjon i fravær av eksogene ligander.
Metoder /Resultater
QRT-PCR og western blot-analyse ble brukt for å bestemme AhR mRNA og protein ekspresjon i hormonsensitive LNCaP-celler, så vel som hormon ildfaste DU145, PC3 og PC3M prostatacancercellelinjer. LNCaP celler uttrykker AhR mRNA og protein på et mye lavere nivå enn de hormon ildfaste cellemodeller. Cellular fraksjonering og immunocytochemistry avslørte atom lokalisering av AhR i etablert hormon ildfaste cellelinjer mens LNCaP cellene er blottet for atom AhR protein. QRT-PCR-analyse for å vurdere basale CYP1B1 nivåer og en xenobiotisk responsive element bindingsanalyse bekreftet ligand uavhengig transkripsjonen aktivitet av AhR i DU145, PC3 og PC3M celler. Basale CYP1B1 nivåene ble redusert ved behandling med spesifikke AhR hemmer, CH223191. En
in vitro
vekstanalyse viste at CH223191 hemmet veksten av DU145, PC3 og PC3M celler i et androgen oppbrukt miljø. Immunhistokjemisk farging av prostata kreft vev avslørte økt kjernefysiske lokalisering av AhR i klasse 2 og klasse 3 kreft sammenlignet med godt differensiert klasse 1 kreftformer.
Konklusjoner
Sammen utgjør disse resultatene viser at AhR er konstitutivt aktiv i avansert prostatakreft cellelinjer som modell hormon ildfast prostatakreft. Kjemisk ablasjon av AhR signalering kan redusere vekst av prostatakreft-celler, en effekt som ikke er oppnådd med androgen-reseptor-inhibitorer eller vekst i androgen fattigmedium
relasjon:. Richmond O, Ghotbaddini M, Allen C, Walker A, Zahir S, Powell JB (2014) aryl hydrokarbon reseptor Er konstitutivt aktiv i avansert prostata kreft celler. PLoS ONE 9 (4): e95058. doi: 10,1371 /journal.pone.0095058
Redaktør: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Østerrike
mottatt: 20 desember 2013; Godkjent: 23 mars 2014; Publisert: 22 april 2014
Copyright: © 2014 Richmond et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Disse studiene ble støttet av National Institutes of Health /National Institute on minoritetshelse og helseforskjeller /Research Center i Minority institusjoner Grant # 8 G12 MD007590. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesse eksisterer
Innledning
i USA, prostatakreft (PCA) er den vanligste diagnosen kreft hos menn og den nest største årsaken til kreft dødsfall for menn [1]. The American Cancer Society anslår at det vil være ca 238 590 menn diagnostisert med PCa og at 29 720 vil dø av PCa relaterte årsaker i 2013 [1]. Ifølge nasjonale overlevelse statistikk, fem års overlevelse for menn diagnostisert med lokal eller regional prostatakreft er 100%. Men menn diagnostisert med fjernmetastaser har en fem års overlevelse på bare 29% [2].
Siden PCa er androgen avhengige, innebærer primærbehandling androgen deprivasjon terapi (ADT) for metastatisk sykdom [3] . De fleste prostatakreft i utgangspunktet svare på ADT som målt ved en reduksjon i serum prostata spesifikt antigen (PSA). Men innen 2 år de fleste pasienter slutter å respondere på behandling og utvikle hormon ildfast prostatakreft (hrpc) [4], [5]. Det finnes ingen kur for hormon ildfast prostatakreft (hrpc), som selv om ADT motstandsdyktig fortsatt androgen reseptor avhengig [6]. Mange mekanismer har vært innblandet i vedvarende androgen reseptor signalisering i HRPC. Disse inkluderer økning i androgen reseptor uttrykk, økte steroidogenesis innen kreftceller, punktmutasjoner som endrer androgen reseptor aktivitet, endringer i balansen mellom co-aktivator /co-repressor proteiner, og endringer i cellesignalveier som crosstalk med androgen reseptor [5 ], [7]. Nylige funn antyder at aryl-hydrokarbon-reseptoren kan delta i krysstale med AR og AR støtte vekst under androgen belastede betingelser. I tillegg har studier vist at AhR har en innvirkning på androgen reseptor transkripsjonen aktivitet. AhR og AhR-atom Translocator (ARNT) samhandle med androgen reseptor [8]. Det er imidlertid bare AhR var i stand til å forbedre androgen reseptor transkripsjonen aktivitet i fravær av en eksogen ligand [9].
For tiden, er den eneste kjente AhR ligand-aktiverte medlem av basis-helix-loop-helix ( bHLH) familie av transkripsjonsfaktorer. Den aktiveres ved binding av et bredt spekter av miljøgifter inkludert polyaromatiske og polysykliske hydrokarboner (PAH) [10]. Mens i cytosol er AhR funnet i et kompleks som består av to molekyler av HSP90, co-anstand p23, immunofilin-lignende AhR samspill protein (AIP) og tyrosin kinase c-src [11], [12], [13] , [14]. Dette proteinet Komplekset er konstruert for å opprettholde den inaktive konformasjon og hindre atomtrans.
Ved binding av ligander, aktiveres AhR translocates til kjernen og heterodimerizes med AhR atom Translocator protein (ARNT) [10], [15] . Atom AhR kompleks samhandler med xenobiotiske responselementer (XRE) i genet arrangører av fase I og fase II metaboliserende enzymer for å forbedre transkripsjon [16], [17], [18]. Etter induksjon av Ahr responsive gener, er AhR signale umiddelbart avsluttet ved nedbrytning eller ved binding av en inhibitor-protein [19], [20], [21].
AhR ligandaktivering har blitt rapportert til å antagonisere androgen reseptor signalering. Potent AhR agonist, 2,3,7,8-tetraklor-dibenzo
p
-dioksin (TCDD), hemmet testosteron avhengig transkripsjonen aktivitet og testosteron-regulert prostataspesifikt antigen (PSA) uttrykk på en doseavhengig måte [22]. TCDD hemmer også androgen avhengige spredning av prostata kreft celler [23]. Co-aktivering av AhR og androgen reseptoren med TCDD og dihydrotestosteron (DHT) redusert AR protein nivåer [24]. Denne observasjonen er bidratt til evnen til AhR å fremme proteolyse av AR ved montering av et ubikvitin-ligase kompleks hvori AhR virker som et substrat gjenkjennelses subenheten til å rekruttere AR, og kan forklare den antiandrogene virkninger av en rekke Ahr ligander [25].
til tross for de studier som bekrefter AhR ligand regulering av AR signalering, kan AhR har iboende funksjoner som regulerer veksten av prostatakreft uavhengig av AR status som ikke har blitt fullt ut undersøkt. Strukturelt inneholder AhR både en kjernefysisk lokalisering signal og en kjernefysisk eksport signal som kreves for atom cytoplasma skyt av AhR [26]. Flere rapporter viser konstituerende AhR signale innen ulike krefttyper. I fravær av eksogene ligander, AhR overekspresjon opp-regulert ekspresjon av målgenet CYP1B1 i den tidlige fasen av lunge adenokarsinom [27]. CYP1B1 er også uttrykt i ikke-småcellet lungecancerceller i fravær av en eksogen ligand. CYP1B1 ekspresjon følges av økt AhR ekspresjon og konstitutiv aktivitet av reseptoren [28], [29]. Nedbryting av AhR protein resulterte i den påfølgende reduksjon av CYP1B1 uttrykk, som bekrefter at basal CYP1B1 uttrykket er regulert av konstituerende AhR signalering. Premaligne og maligne melke vev blir rapportert til konstitutivt uttrykte CYP1B1 mRNA. I disse menneskelige og gnager mammary svulster, AhR var også over-uttrykt og konstitutivt aktiv [30].
I tillegg ble mus hepatomceller ikke utsettes for eksogene Ahr ligander vist seg å inneholde transkripsjonelt aktiv AhR. Dessuten ble en betydelig grad av konstituerende AhR aktivitet rapportert i celler isolert fra hode og hals plateepitelkarsinom (HNSCC) pasienter (DiNatale2012). Også forbigående overekspresjon av AhR inn i en AhR null-cellelinjen også induserte ligand uavhengig transkripsjonen aktivitet [29], [31].
prostatavev analysert ved hjelp av immunhistokjemi viste at benign hyperplasi (BPH) epitelceller besitter betydelig redusert AhR ekspresjon sammenlignet med normalt vev. Men AhR uttrykk ofte ble økt i mer dedifferensierte svulst områder [32]. En separat studie også oppdaget at vesentlig høyere AhR ekspresjon og aktivering i tumorceller sammenlignet med benigne kjertel epitelet [33].
LNCaP-cellelinjen, avledet fra en lymfeknutemetastase, er en mye brukt human prostatakreft-cellelinje anvendes for å demonstrere androgen følsomhet. LNCaP celler uttrykker et mutert androgen reseptor og prostata spesifikt androgen [34]. LNCaP-celler ikke er tumorigene i nakne mus [35], [36]. I kontrast, androgen ufølsomme prostatakreftcellelinjer, DU145 og PC3 er svært tumorigent i nakne mus. Selv om de ikke uttrykker androgen reseptoren, de er lydhøre for androgener, men ikke har fortrengt vekst under androgen fratatt vekstforhold [37], [38]. Disse cellelinjene blir ofte brukt som
in vitro
modeller for studier som involverer hormon ildfaste prostatakreft. Den PC3M prostatakreft-cellelinje ble isolert fra nakne mus etter intraspenic injeksjon av PC3-celler og er svært metastatisk [39]. Selv om flere studier har vist effekten av AhR ligandaktivering i prostatakreftcellelinjer, har ingen studier undersøkt hvilken rolle konstituerende AhR signale på prostatakreft cellevekst. Vi har tidligere rapportert at AhR er nødvendig for å opprettholde hormonuavhengig signalisering og vekst av androgenreseptoren i c4-2 prostatakreftceller. Dette bevis viser en direkte rolle for AhR i androgen reseptor avhengig vekst av prostata kreft celler [29]. I denne studien viser vi at AhR er konstitutivt aktiv i avanserte prostata kreft celler og at ablasjon av konstituerende AhR aliserte til hemme androgen uavhengig vekst er ikke avhengig av androgen receptor status.
Materialer og metoder
Kjemisk og reagenser
AhR agonist, 2,3,7,8-tetraklor-dibenzo
p
-dioksin (TCDD) ble kjøpt fra AccuStandard (New Haven, Connecticut). AhR antagonist, (CH223191) ble kjøpt fra Sigma Aldrich. Androgen reseptor antagonist, Casodex (CDX) ble kjøpt fra Sigma Aldrich.
Cell Culture
Adherent monolagkulturer av menneskelige prostata kreft cellelinjer LNCaP, DU145, PC3 og PC3M ble opprettholdt i RPMI 1640 medium supplert med 10% FBS og 100 mmol /l hver av penicillin og streptomycin. Celler ble dyrket ved 37 ° C med 5% CO2 i fuktig atmosfære, og mediet ble erstattet hver tredje dag. Cellene ble splittet (01:03), da de nådde nær samløpet. Deres respons på androgener for vekst og androgen reseptor-aktivitet ble målt periodisk i løpet av undersøkelsen.
RNA ekstraksjon og kvantitative QRT-PCR-analyse
Total RNA ble isolert fra celle monolag dyrket i 100 mm vevskultur retter med RNeasy Mini Kit (Qiagen). 2 ug av det totale RNA ble revers-transkribert ved hjelp av Superscript II-sett (Invitrogen) i henhold til produsentens anbefalinger. CDNA tjente som templat i en 25 pl reaksjonsblanding og ble bearbeidet ved anvendelse av følgende protokoll: en innledende denaturering ved 95 ° C i 3 minutter, etterfulgt av 39 amplifiseringscykluser (95 ° C i 10 s og 55-65 ° C for 30 s), 95 ° C i 10 s, 65 ° C i 5 s og 95 ° C i 50 s. Den 25 pl qPCR Reaksjonsblandingen ble blandet med GoTaq qPCR Master Mix (Promega). Smelt kurve analyser ble utført etter hvert løp for å sikre et enkelt produkt. Relativ genekspresjon ble bestemt ved anvendelse av ΔΔCq beregningsmetoden. Primersekvensene som ble brukt var: L-19: forover (5′-3 «) TCCCAGGTTCAAGCGATTCTCCTT Omvendt (5′-30:) TGCCTGTCACTATTCCTCATGCCA Reverse (5»-3 «) TCTGCTGGTCAGGTCCTTGTTGAT Spesifisiteten av disse primersett ble validert ved å utføre eksperimenter med bestemte shRNAs som er rettet mot AhR i» TTGAGACCAGCCTGACCAACATGA CYP1B1 Forward (5′-3. «. Tran et al [29].
Protein Isolering og Western blot analyse
Proteinprøver prøver~~POS=HEADCOMP ble isolert ved hjelp av Thermo Scientific NE-PER Utvinning kit for cellulære fraksjoner eller kommersielt tilgjengelig cellelyse buffer (Cell Signaling ) for totalt protein. protein~~POS=TRUNC prøver~~POS=HEADCOMP ble oppløst ved SDS-PAGE og overført til en PVDF-membran. Immunoblotting ble utført med 1 ug /ml mus AhR monoklonalt antistoff ved 1:1000 fortynning i 5% melk. Blottene ble vasket tre ganger (15 min hver) med TBST. Blottene ble deretter inkubert i 1:2500 fortynning av sekundære antistoff og vasket tre ganger (15 min hver) med TBST, tre ganger (10 min hver) med TBS og en gang med ddH20 (10 min). Bånd ble visualisert med den forbedrede chemiluminescence (ECL) kit som spesifisert av produsenten. Flere eksponeringer for hvert sett av prøver ble fremstilt. Den relative konsentrasjonen av target-proteiner ble bestemt ved datamaskinanalyse og normalisert til en indre standard (topoisomerase, β-tubulin, β-aktin).
immunocytokjemisk farging og fluorescensmikroskopi
Celler dyrket på glass dekkglass i 6-brønns plater ble vasket i kald PBS og festet ved inkubasjon i en 01:01 metanol: aceton-oppløsning ved 4 ° C i 30 minutter og deretter lufttørket. Celler ble skylt og hydrert med Tris-bufret saltvann inneholdende 0,05% Tween 20 (TBST) og overført til en ren 6-brønns plate. Cellene ble inkubert ved romtemperatur i 1 time i 5% melk i TBST oppløsning for å blokkere ikke-spesifikk binding, etterfulgt av inkubering ved romtemperatur i en time med affinitets-rensede kanin anti-AhR polyklonalt antistoff ved 1 ug /ml 1:1000 fortynning i 4% melk i TBST oppløsning. Cellene ble deretter vasket tre ganger (15 min hver) med TBST. Celler ble inkubert med en 1:200 fortynning av fluorescein-isothiocyanat (FITC) -konjugert anti-kanin-antistoffer (Jackson Immunoresearch laboratorier, West Grove, PA) i 4% melk ved romtemperatur i 1 time. Cellene ble deretter vasket tre ganger (15 min hver) med TBST, tre ganger (10 min hver) med TBS og en gang med ddH20 (10 min). Cellene ble deretter montert på lysbilder ved hjelp UltraCruz hardt satt monteringsmedium som inneholder 4’6′-diamidino-to-phenylindole (DAPI).
XRE Binding
4 × 10
4 celler utplatet i en 96-brønners plate. Prostata kreft-celler ble transfektert med XRE reporter, så vel som med positive og negative kontroll reporter plasmider ved hjelp av attractene. Etter 18 timers transfeksjon, ble mediet endret til standard analyse media (DMEM + 0,5% FBS 0,1 mM NEAA). Celler ble dyrket i ytterligere 24 timer under normale cellebetingelser. En dobbel luciferase-analysen ble utført etter 42 timers transfeksjon og promoter aktivitetsverdier er uttrykt i vilkårlige enheter (florescence AFU). Eksperimenter ble utført i tre eksemplarer og standard feil indikeres.
Proliferation Studies
Vekst av celler ble analysert ved hjelp av Promega CellTiter 96 Cell Proliferation analysen. Celler ble resuspendert til en sluttkonsentrasjon på 1,0 x 10
5 /ml i RPMI. 50 ul av cellesuspensjonen (5000 celler) ble tilsatt til hver brønn på 96-brønners plate inneholdende 50 mL av mediet med tilsvarende behandling som resulterer i et totalvolum på 100 ul. Mikroplatene ble inkubert ved 37 ° C i 24-72 timer i en fuktet, 5% CO
2 atmosfære. Per produsentens instruksjoner, etter inkubering ble 20 ul av MTS-løsning tilsatt til hver brønn og inkubert i 4 timer. 100 ul stoppløsning ble tilsatt til hver brønn og inkubert i 1 time. Absorbansen ble avlest ved 570 nm ved hjelp av Synergy H1m multimode -mikroplateleser.
immunhistokjemisk farging
Tissue lysbilder ble deparaffinized i xylen og rehydrert i gradert ned-serie av etanol (70, 90 og 100% ) og til slutt ddH20. Antigener ble hentet inn ved hjelp Biocare buffer før inkubering i 0,3% H
2o
2 i 10 minutter ved romtemperatur. Objektglassene ble vasket tre ganger (5 min hver) i PBS. Objektglass ble blokkert ved inkubasjon i normal geiteserum blokkeringsløsning i 1 time ved romtemperatur. Glassene ble inkubert med 1 pg /ml kanin-anti-AhR polyklonalt antistoff (1:100 fortynning) over natten ved 4 ° C. Etter inkubering med primært antistoff, ble objektglass vasket tre ganger (5 min hver) med PBS før en 1 times inkubering med geite-anti-kanin-sekundært antistoff (1:400) fortynning ved romtemperatur. Objektglassene ble vasket tre ganger (5 min hver) i PBS og inkubert 10 minutter med diaminobenzedine per produsentens anbefalinger. Igjen Objektglassene ble vasket tre ganger (5 min hver) med PBS, skylt med DDH
2O og dehydrert i graderte opp-serie av etanol før den ble fjernet i xylen og montert ved hjelp av xylen basert monterings media. Bilder av hver vevsprøve samt tilsvarende hematoxylin og eosin flekker ble tatt til fange ved 400x forstørrelse for påfølgende scoring. Anti-AhR reaktivitet ble scoret på en skala fra 1-3 (1 = lav reaktivitet og 3 = høy reaktivitet) for cytoplasma og kjernen av hver vevsprøve av to uavhengige etterforskere.
Statistical Analysis
Hvert eksperiment ble utført minst 3 ganger, og alle verdiene er uttrykt som gjennomsnitt + SEM. Forskjellene mellom gruppene ble sammenlignet med t-test eller ANOVA hjelp INSTAT programvare (GraphPad Software Inc., San Diego, California). En verdi på P 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
jeg.. AhR er overuttrykt i avansert prostatakreft cellelinjer
DU145, PC3 og PC3M prostata kreft cellelinjer ble brukt som hormon ildfaste prostata kreft cellemodeller. Disse 3 cellelinjer er blitt vist å opprettholde veksten i et androgen fattig miljø [37], [38], [39]. LNCaP er et androgen sensitiv prostatakreft cellemodell der veksten er redusert under androgen utarmet forhold [34]. Ekspresjonen av AhR mRNA i cellelinjene ble kvantifisert ved QRT-PCR. AhR protein ekspresjon av hver linje ble undersøkt ved western blot. Forhånd prostata cancer cellelinjer har en økning i ekspresjonen av AhR mRNA og protein i forhold til androgen sensitive, LNCaP, cellelinje. LNCaP-celler uttrykker både AhR mRNA og protein. Men DU145 og PC3 celle har en 2,5 og 5 ganger økning i AhR mRNA henholdsvis (figur 1B.). Dette samsvarer med den to ganger økning i AhR protein i DU145 og mer enn 2,5 ganger økning i PC3 celler (Fig. 1a). PC3M celler har den største økningen i AhR uttrykk i forhold til LNCaP celler. Det var en 10 ganger økning i PC3M mRNA og 3 ganger økning i AhR protein (Fig. 1).
A. Totalt cellulære proteiner ble isolert fra LNCaP, DU145, PC3 og PC3M prostata kreft cellelinjer. Proteiner ble separert ved hjelp av SDS polyacrylamine gelelektroforese og blottet ved hjelp av et anti-AhR antistoff. Anti-β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. Bilde J ble benyttet for å oppnå desitometric måler fra 3 uavhengige membraner. Hver stolpe representerer gjennomsnittlig ± SEM (n = 3), og ble analysert ved hjelp av student t-test. Statistisk signifikante forskjeller (* p 0,05) sammenlignet med LNCaP kontroll. B. Total RNA ble isolert og kvantitativ RT-PCR ble utført for å bestemme mRNA-ekspresjon av AhR i prostata kreftcellelinjer. mRNA-nivåer ble normalisert ved hjelp av L-19 som tjener som en intern kontroll. Hver stolpe representerer gjennomsnittlig ± SEM (n = 3), og ble analysert ved hjelp av student t-test. (*) Angir statistisk signifikante forskjeller mellom gruppene.
II. Ligand Uavhengig Nuclear Lokalisering av AhR
For å bestemme lokalisering av AhR protein, vi isolert cellulære fraksjoner og utført immunoblotting for AhR i atom og cytoplasmatiske fraksjoner. Western blot-analyse av cellulære fraksjoner viste at økningen AhR uttrykk i de avanserte prostatacancercellelinjer er ledsaget av akkumulering av kjernefysiske AhR uten stimulering av en eksogen ligand. Selv om AhR protein ble påvist i de cytoplasmiske fraksjoner av LNCaP-celler, ble det ikke påvist AhR i LNCaP atomfraksjoner. I motsetning til dette avanserte prostatakreftcellelinjer viste høy ekspresjon av det AhR proteinet i de nukleære fraksjoner (fig. 2A). Immunocytochemistry bekreftet tilstedeværelsen av AhR i kjernen av DU145, PC3 og PC3M celler. Fraværet av eventuelle flekker overlegg i det fusjonerte bildet av DAPI farget kjerner og FITC-farget AhR videre vist at LNCaP cellene ikke har kjernefysiske AhR (Fig. 2B).
A. Nukleære og cytoplasmatiske fraksjonering: Cellelinjer ble dyrket på 100 mm skåler til ca 75% sammenflytende, ble vasket med kald PBS og cellulære fraksjoner ble isolert ved per produsentens anbefalinger ved anvendelse av en NE-PER Extraction Kit. De nukleære og cytoplasmiske fraksjoner ble analysert ved western blotting for AhR protein ekspresjon. Den relative nivået av cytoplasma AhR var normalisert med β-tubulin uttrykk og den relative nivå av kjernefysisk AhR var normalisert med topoisomerase uttrykk. Barer representerer gjennomsnitt ± SEM av de korrigerte verdiene fra tre uavhengige eksperimenter og (*) angir konstituerende atomnivå AhR som er vesentlig forskjellig mellom cellelinjer. B. subcellulære lokalisering av AhR i prostata kreft cellelinjer ved immunocytokjemisk farging: Cellene ble dyrket på Dekk og faste med metanol: aceton. AhR ble visualisert ved farging med kanin anti-Ahr polyklonale antistoffer, etterfulgt av FITC-konjugert geite-anti-kanin-antistoff. Kjernene ble kontra farget med DAPI fluorescens fargestoff. Bilder fra FITC og DAPI-fluorescens kanaler ble slått sammen. Bilder ble tatt på et Olympus bred fluorescens mikroskop (400x forstørrelse).
III. Konstituerende AhR transkripsjonen aktivitet
Cignal XRE reporter ble brukt til å måle basal aktiviteten til AhR signalveien i avansert prostatakreft cellelinjer. Analysen anvendt for å teste AhR promoteraktivitet avslørte at forhånd prostatakreftceller DU145, PC3 og PC3M, alle har et høyt nivå av AhR binding til XRE i fravær av en eksogen ligand. Androgen sensitive LNCaP cellelinjen viste minimal XRE bindende. PC3-celler viste den høyeste aktivitet promoteren med en 10-gangers økning i XRE binding sammenlignet med de LNCaP-cellelinjer. DU145 og PC3M celler viste en 2,5 og 8-gangers økning i promoter-aktivitet sammenlignet med LNCaP-cellelinjen, henholdsvis (fig. 3A).
A. Hver prostatakreft-cellelinjen ble transfektert med en XRE reporter plasmid, så vel som med positive og negative kontroll reporter plasmider ved hjelp av attractene. Etter transfeksjon, ble en dobbel luciferase-assay utført. Promoteraktivitet verdiene uttrykkes som vilkårlige enheter (florescence AFU). Hver stolpe representerer gjennomsnittlig ± SEM (n = 3), og ble analysert ved hjelp av student t-test. (*) Angir statistisk signifikante forskjeller (P * 0,05). B. QRT-PCR analyse av CYP1B1 mRNA uttrykk i prostatakreftceller. Celler ble behandlet med 50 uM av AhR inhibitor (CH223191) eller bærerkontroll (DMSO) i 24 timer og total RNA ble isolert og kvantitativ RT-PCR ble utført for å bestemme mRNA-ekspresjon av CYP1B1 i hver prostatacancercellelinjer. mRNA-nivåer ble normalisert ved hjelp av L-19 som tjener som en intern kontroll. Hver stolpe representerer gjennomsnittlig ± SEM (n = 3), og ble analysert ved hjelp av student t-test. (*) Angir statistisk signifikante forskjeller (* P 0,05) sammenlignet med LNCaP prostatakreft cellelinje
Resultatene ovenfor antyder en transkripsjonelt aktiv AhR i avansert prostatakreft cellelinjer.. Flere rapporter har bekreftet forhøyet AhR og CYP1B1, men ikke CYP1A1 i tumorigen modeller [30], [40]. Disse studiene tyder på at det finnes forskjeller i regulering av disse to gener. CYP1A1 og CYP1B1 uttrykk er både AhR mediert men forskjeller i promoter struktur kan føre differensial uttrykk. Rapportene tyder på at CYP1A1 er kontroll av ligandaktivering av AhR og CYP1B1 er regulert av konstituerende AhR signalering [41], [42], Derfor, for å bekrefte transkripsjonen aktivitet av AhR signalveien, AhR responsive genet, CYP1B1 ble målt ved qRT- PCR i androgen sensitive LNCaP cellelinje samt avansert prostatakreft cellelinjer, DU145, PC3and PC3M. LNCaP cellene uttrykte minimale nivåer av CYP1B1 karakterutskrift. DU145 og PC3 cellene viste en 12 og 25-dobling av CYP1B1 i forhold til de LNCaP cellene. PC3M celler viste den største gangers økning i CYP1B1 med en nesten 30 ganger økning i forhold til LNCaP celler. Hemming av AhR signale ved direkte hemmer, CH223191, resulterte i en betydelig reduksjon i CYP1B1 nivåer i de avanserte prostata kreft cellelinjer. På grunn av lav basal ekspresjon av CYP1B1 i LNCaP-celler, CH223191 hadde ingen signifikant effekt på CYP1B1 mRNA-ekspresjon (Fig. 3B).
IV. Ablasjon av Constitutive AhR Signa Hemmer Androgen Uavhengig Vekst
Ovennevnte data viser evnen AhR antagonist, CH223191, for å hemme konstituerende AhR signalering. For å bestemme effekten av konstitutive AhR signalering på veksten av avanserte prostatakreftceller, ble hver cellelinje dyrket i fravær og nærvær av den spesifikke AhR inhibitor, CH223191. LNCaP, DU145, PC3 og PC3M prostatakreft-celler ble dyrket i nærvær av AhR inhibitor CH223191191 i konsentrasjoner varierende fra 1 uM til 50 uM (fig. 4A). Ablasjon av AhR signale var tilstrekkelig til å redusere veksten av alle cellelinjer inkludert androgen sensitive LNCaP celler. For å bekrefte effekten av CH223191191 var AhR avhengige, DU145 cellene ble transfektert med en kontroll vektor (SCR) og en vektor som bærer bestemt shRNA å målrette AhR protein (-AhR). De resulterende celler som uttrykker AhR (SCR) og er blottet for AhR protein (-AhR) ble behandlet med 50 uM CH223191191 (Fig. 4B). De DU145 (SCR) celler svare på CH223191191 behandling med en betydelig nedgang i veksten, mens DU145 (-AhR) celler viste ingen vekst respons på AhR antagonist (Fig. 4B). Androgen reseptor hemming av Casodex var bare effektiv i LNCaP celler. Behandling av avansert prostatakreft cellelinjer (DU145, PC3 og PC3M) med CDX hadde ingen effekt på vekst. LNCaP celler viste en 40% reduksjon i veksten i nærvær av CDX. CH223191 behandling resulterte i den største veksthemming i DU145 cellene. DU145 cellene viste også den høyeste vekstraten av alle cellelinjer under kontroll forhold. Også, co-behandling med CH223191 og CDX resulterte i en ytterligere reduksjon i vekstraten sammenlignet med CH223191 alene alle cellelinjer (fig. 4C). Vekst inhibering av prostatacancercellelinjer ved CH223191191 holdt seg i opptil 72 timer (fig. 4D).
A. Celler ble dyrket i en 96-brønners plate ved 5,0 x 10
3-celler per brønn. Cellene ble behandlet med DMSO eller 1 uM, 5 uM, 10 uM, 25 uM og 50 uM av CH223191. Cellevekst ble målt ved hjelp av Promega CellTiter 96 Cell Proliferation Assay per produserer instruksjoner. B. Bekreftelse på AhR protein uttrykk i DU145 celler med egge vektor kontroll (SCR) og shRNA lentivirus mot AhR (-AhR) av western blotting. 20 ug av protein isolert fra ble analysert ved western blotting. β-handling anvendes som en lastekontroll. Spredning av DU145 (SCR) og DU145 (-AhR) celler ble analysert ved hjelp av CellTiter 96 celleproliferasjonsanalyse i nærvær og fravær av 50 pM av CH223191. C. Cellene ble dyrket i svidde strippet media og behandlet med DMSO (CON), 20 uM Casodex (CDX), 50 uM CH223191 eller en kombinasjon av CDX og CH223191 i 72 timer. Cellevekst ble målt ved hjelp av Promega CellTiter 96 Cell Proliferation Assay per produserer instruksjoner. Hver søyle representerer gjennomsnitt ± SEM (n = 3), * p 0,05. D. Cellene ble serumsultede for 24 timer og vokst i kull strippet (CSS) media. Cellene der deretter behandlet med DMSO (Con) eller 50 M CH223191 i ytterligere 24, 48 eller 72 timer. Ved hvert endepunkt, ble cellene analysert for DNA-innhold ved hjelp av celleproliferasjonsanalyse som beskrevet i materialer og metoder. Hvert datapunkt representerer gjennomsnittlig ± SEM (n = 3). (*) Angir en signifikant forskjell i forhold til de respektive DMSO kontroll.
V. AhR Nuclear Opphopning i Prostate Cancer Tissue
Uttrykket og lokalisering av AhR ble vurdert i prostata kreft vev ved immunhistokjemisk farging. I tråd med målet med denne studien som viser at AhR er konstitutivt aktiv i avansert prostatakreft, vurderte vi AhR uttrykk i prostata kreft vev som strekker seg fra klasse 1 til klasse 3. klasse 1 vev er godt differensiert og cellene vises normalt. Grad 2 vev er moderat differensiert og cellene vises litt annerledes enn normalt. Grad 3 vev er dårlig differensiert og cellene ser unormal og har en tendens til å vokse og spre seg mer aggressivt. 100% av vev farget positivt for cytoplasma AhR. Men var bare 14% av karakteren 1 vev positivt for atom AhR sammenlignet med 50% av grad 2 og grad 3 kreft vev (fig. 5A og tabell 1). Tilstedeværelsen av atom AhR i klasse 2 og klasse 3 vev sammen med in vitro data fra prostatakreftcellelinjer foreslå en transkripsjonelt aktiv AhR i disse høyere klasse svulster. I tillegg alle klasse 1 svulster positive for atom AhR var alle klassifisert som Stage IV svulster. Analyse av total AhR uttrykk viste at grad 2 og 3 svulster besitter betydelig mer total AhR i forhold til grad en vev (fig. 5B). I tillegg ~80% av vev med Gleason score 7 eller mer har økt anti-AhR reaktivitet sammenlignet med bare 47% av vev med Gleason scorer 2-6 (tabell 2).
A. Representant Grade 1, klasse 2 og grad 3 prostata kreft vev: Øvre panel beiset med anti-AhR polyklonale antistoff; nedre panel farget med hematoksylin og eosin. Pilene viser positiv anti-AhR reaktivitet i kjernen av klasse 2 og klasse 3 svulster. B. Total anti-AhR reaktivitet ble scoret i klasse 1, klasse 2 og klasse 3 prostata kreft vev basert på intensitetsnivå i både cytoplasma og cellekjernen (0-1).
