Abstract
Kontekst
Adrenokortikal karsinom (ACC) er en sjelden og svært aggressive endokrine svulster, med begrensede behandlingsalternativer. Aktivering av β-catenin somatiske mutasjoner er funnet i ACC, og har vært forbundet med en dårlig klinisk resultat. Faktisk, aktivering av Wnt /β-catenin signalveien ser ut til å spille en viktig rolle i ACC aggressivitet, og kan dermed representere et lovende terapeutisk mål.
Mål
I likhet med pasient svulst prøven på H295 cellelinje avledet fra en ACC havner en naturlig aktive β-catenin mutasjon. Vi her vurdere
in vitro Hotell og
in vivo
effekten av β-catenin inaktivering ved hjelp av en doxycyklin (DOX) induserbar shRNA plasmid i H295R adrenocortical kreftceller linjen (klone kalt shβ).
Resultater
Etter DOX behandling en sterk reduksjon i
β-catenin
uttrykk påvises i shβ kloner i forhold til kontroll kloner (CTR). Følgelig, vi har observert en reduksjon i Wnt /βcatenin-avhengig luciferase reporter-aktivitet, så vel som et redusert ekspresjon av
AXIN2
representerer en endogen
β-catenin
målgenet. Samtidig,
β-catenin
stanse resulterte i en redusert celleproliferasjon, cellesyklus endringer med celle akkumulering i G1 fasen og økt apoptose
in vitro
.
In vivo
, på etablerte tumorxenotransplantater i atymiske nakne mus, 9 dager med
β-catenin
stanse resulterte i en betydelig reduksjon av
CTNNB1 Hotell og
AXIN2
uttrykk. Videre kontinuerlig
β-catenin
stanse, starter 3 dager etter tumorcelle vaksinasjonen, var assosiert med en fullstendig fravær av tumorvekst i shβ gruppen mens svulster var til stede i alle dyr i kontrollgruppen.
Konklusjon
i sammendraget, disse eksperimentene gir bevis på at Wnt /β-catenin vei hemming i ACC er et lovende terapeutisk mål
Citation. Gaujoux S, Hantel C, Launay P, Bonnet S, Perlemoine K, Lefèvre L, et al. (2013) Dempe mutert
β-catenin
hemmer celleproliferasjon og stimulerer apoptose i Adrenokortikal Cancer Cell linje H295R. PLoS ONE 8 (2): e55743. doi: 10,1371 /journal.pone.0055743
redaktør: Hans A. Kestler, Universitetet i Ulm, Tyskland
mottatt: 14. september 2012; Akseptert: 30 desember 2012; Publisert: 07.02.2013
Copyright: © 2013 Gaujoux et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av den Contrat d’Initiation à la Recherche Clinique (tilskudd KRETS 05045 – AP-HP), Plan Hospitalier de Recherche Clinique (AOM06179) til COMETE Network, Recherche Translationnelle DHOS /INCA 2009 (RTD09024), ESF (07-RNP-067), Association pour la Recherche sur le Cancer (SFI20111203542), den Weigand Trust Tyskland, Sander Stiftung (2011.003.1) og Ligue contre le cancer (RS12 /75-105). Videre har forskning som fører til disse resultatene fått støtte fra det sjuende rammeprogram (FP7 /2007-2013) under tilskuddsavtalenummer 259735 (ENS @ T-kreft). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Adrenokortikal karsinom (ACC) er en sjelden og svært aggressive endokrine svulster, med en 5-års overlevelse på rundt 40% [1] – [4]. Behandlingsalternativer for disse pasientene er knappe, og tilgjengelige chemotherapies av begrenset effektivitet. En bedre forståelse av tumorbiologi og molekylær prognostiske faktorer vil bidra til å velge relevante terapeutiske mål og utvikle innovative terapeutiske strategier.
Aktivering av Wnt /β-catenin signalveien i adrenocortical tumorigenesis har nylig blitt undersøkt i detalj [ ,,,0],5] – [10], og ser ut til å spille en viktig rolle i adrenokortikal karsinom prognose. I dyremodeller, en konstitutiv aktivering av Wnt /β-catenin bane i binyrebarken av transgene mus fører til utvikling av binyrebark tumorer med ondartede egenskaper [11]. Hos mennesker er denne veien hyppig aktiveres hovedsakelig trau β-catenin genet (
CTNNB1
, dvs. catenin (cadherin-assosiert protein), beta 1) mutasjoner [5], [7], og er assosiert med spesifikke kliniske og patologiske egenskaper og et dårlig resultat [8]. Likeledes, en bestemt transcriptomic signatur av svulster med
CTNNB1
mutasjon har nylig blitt vist [12], og kan være ansvarlig for den bestemte dårlig prognose for berørte pasienter. Samlet er disse observasjonene tyder Wnt /β-catenin signalveien inaktivering som et lovende terapeutisk mål i ACC.
Hensikten med denne studien var å vurdere
in vivo Hotell og
in vitro
effekter av Wnt /β-catenin signalveien bestemt inaktivering ved hjelp av kort hårnål RNA (shRNA) i en svulst modell for adrenocortical karsinom (H295R).
Materialer og metoder
Cell Kultur og generasjon av H295R Clones
Adrenokortikal carcinoma cellelinje H295R stabilt transfektert med Tet repressor (H295R /TR) ble vennlig levert av Dr. Lalli [13]. Celler ble dyrket som tidligere beskrevet [14]. Pter-β-catenin vektor som uttrykker et doxycyklin induserbar shRNA rettet
CTNNB1 plakater (
β-catenin
, målrettet sekvens: 5′-GTGGGTGGTATAGAGGCTC-3 «) mRNA, og styrevektor ( Pter) ble oppnådd fra Dr. van de Wetering [15]. H295R /TR ble transfektert med den Pter-β-catenin eller Pter og kloner ble selektert ved zeocin (50 ug /ml, InvivoGen). Tre shRNA-βcatenin kloner (shβ) ble valgt i hvilke
CTNNB1
ekspresjon ble nedregulert i det minste fem ganger i en doxycyklin (DOX, 0,2 ug /ml, Sigma) avhengig måte i forhold til tre kontroll kloner ( Ctr) transfektert med Pter vektor. Alle cellekloner ble undersøkt for sin evne til å uttrykke spesifikke steroidogenic gener (
Star Hotell og
CYP11B1
) og deres reaksjoner på cAMP /PKA sti som ble funnet å være sammenlignbar med foreldre cellelinje, H295R [16] (data ikke vist). S45P
CTNNB1 product: (
β-catenin
) genet aktivering mutasjon, tidligere identifisert i foreldre H295R cellelinje [5], [8], ble bekreftet ved direkte sekvensering i alt Ctr og shβ kloner (data ikke vist). Mens data presenteres for en enkelt Ctr og shβ klone alle
in vitro
eksperimenter ble bekreftet med tilsvarende resultater i 2-3 individuelle kloner (Ctr og shβ).
Analyse av RNA og proteinnivåer
Total RNA eller protein ekstraksjon og analyse fra cellelinjer ble utført som tidligere beskrevet [14] med primere og antistoffer beskrevet i tabell S1.
Cell transfeksjon og reporter analyser
som et Wnt /β-catenin veien reporter konstruksjon drivende ekspresjon av luciferase-genet, ble TopFlash plasmid (toppen) anvendes som inneholder to kopier av β-catenin /T-celle-faktor TCF-bindingsseter, mens den FopFlash plasmid (FOP) inneholder to mutert kopier av β-catenin /TCF-bindingsseter [5]. Rous sarcoma virus (RSV) -Renilla (Promega) ble anvendt som en kontroll av transfeksjonseffektivitet. Cellene ble kotransfektert og Firefly og Renilla luciferase-aktivitet ble målt i rekkefølge, som tidligere beskrevet [14].
celleproliferasjon, cellesyklus og apoptose analyse
Proliferasjon ble målt ved MTT-assay (Promega). Cellesyklus og apoptose ble analysert ved flowcytometri som tidligere rapportert [17].
Xenotransplantat, patologisk undersøkelse og immunhistokjemisk farging
Kvinne atymiske NMRI nu /nu mus (6-8 uker) var kjøpt fra Harlan Winkelmann (Borchen, Tyskland) og holdt under patogen-frie forhold. Alle forsøk ble utført følgende protokoller som er godkjent av Regierung von Oberbayern, og i henhold til de tyske retningslinjene for dyrestudier. 15 x 10
6-celler i de individuelle kloner ble inokulert i et volum på 200 pl PBS subkutant i halsen på hver mus. For kortsiktige terapeutiske eksperimenter DOX behandling ble igangsatt da de lengste Tumordiametere varierte mellom 0,2-0,9 cm i størrelse (etter 21-31 dager). Doxycyline ble tilsatt i en sluttkonsentrasjon på 2 mg /ml til drikkevann i ravfargede flasker. Etter 9 dager med DOX svulster behandling ble skåret ut, fiksert i formalin, innstøpt i parafin, og 4 mikrometer seksjoner kuttet og farget med Hematoxylin-Eosin-Saffron. Immunhistokjemi for β-catenin ble utført som tidligere beskrevet [5]. Celler for langsiktige terapeutiske eksperimenter ble inokulert og 3 dager etter tumor induksjons mus ble fra da kontinuerlig behandlet med DOX vann. Tumorstørrelse ble målt hver annen dag ved hjelp av en klave som tidligere beskrevet [18]. På dagen 31 dager etter tumorinduksjon, når første tumorer nådde en lengste svulst diameter på 1,5 cm, ble musene avlivet og svulster skåret.
Statistisk analyse
Alle
in vitro
data med statistiske analyser representerer kvantifisering av minst tre forsøk. Kontroll betingelser ble satt som 100%, og dataene ble analysert ved bruk av Fisher-test. Den statistiske analysen for sammenligning av tumor vekt etter langsiktig terapeutisk eksperiment
in vivo
ble utført av Mann-Whitney test. Signifikans ble satt til P 0,05 (representert ved * i figurene); P 0,01 (**) og P 0,001 (***)
Resultater
Effektiv inaktivering av
CTNNB1
av shRNA i binyrebark kreftceller
H295R celler, husing en heterozygot
CTNNB1
genmutasjon på GSK3p fosforylering nettstedet (S45P), viser en konstituerende transkripsjonen aktivitet av β-catenin-LSF /TCF [5]. Celle kloner uttrykker en doxycylin induserbar shRNA targeting β-catenin ble generert. To dager etter shRNA-β-catenin induksjon doxycyklin (DOX) behandling,
CTNNB1
mRNA (-85%; p 0,01) og proteinnivåer ble betydelig redusert (figur 1-A). Denne reduksjonen i
CTNNB1
mRNA og proteinnivåer fortsatte med DOX behandling opp til 10 dager. I kontrast, DOX behandling hadde ingen effekt på
CTNNB1
uttrykk i kontroll klone (Ctr) (figur 1-A).
A, Histogram og Western blot paneler representere
CTNNB1
(
β-catenin
) mRNA og protein akkumulering, i Ctr og shβ kloner etter 2, 5 eller 10 dager etter tilsetning av doxycyklin (DOX) i dyrkningsmedium (0,2 ug /ml). B-venstre, celler ble transient co-transfektert med en kunstig Wnt /-β-catenin veien reporter kont (Til toppen) eller hans kontroll mutert (FOP). Etter 24 timer ble cellene behandlet med et kjøretøy eller DOX (0,2 ug /ml) i 24 timer og luciferase-aktiviteten ble målt. -rett, Histogram representere
AXIN2
mRNA akkumulering etter 2 dager med DOX behandling. C-venstre, Celleoverlevelse kurve av celler, som bestemt ved MTT-analysen, uten eller med DOX (0,2 ug /ml) i 1, 4, 8 eller 12 dager. -senter, Fordelingen av cellene i de forskjellige faser av cellesyklusen ble analysert ved strømningscytometrisk analyse av propidiumjodidfarging etter kjøretøy eller dox behandling for 2, 5 og 10 dager. Western blot viser β-catenin, CyclinA og CDK2 proteinnivåer på 10 dag. -rett, histogrammer representerer apoptotiske celler målt ved hjelp av strømningscytometrisk annexin V inkorporering, etter kjøretøy eller dox behandling i 2, 5 og 10 dager, uten eller med staurosporin ko-behandling for de siste 6 timer (0,5 ug /ml). Western blot viser kløyvde caspase 3 (CC3) i samme tilstand.
CTNNB1
lyddemping avtar Wnt /β-catenin-LSF /TCF avhengig transkripsjon
Wnt /β-catenin-LSF /TCF avhengig transkripsjon ble undersøkt ved hjelp av Top-Flash /Fop-Flash-plasmider (Topp og FOP). Som forventet, transfekterte H295R celler viste høyere transkripsjonen aktivitet av β-catenin-LSF /TCF avhengig luciferase reporter konstruere Top i forhold til det muterte Fop konstruksjon (figur 1-B, Ctr-Fop: 5% i forhold til Ctr-Top: 100 %, p 0,01; og shβ-Fop: 9% sammenlignet shβ-Top: 100%, p 0,01). H295R celler som uttrykte shRNA-β-catenin (shβ med DOX) viste lavere transkripsjonen aktivitet av reporter konstruere Top (shβ-Top: -53%, p 0,01). Dox behandling ikke påvirke aktivitet av Top konstruere i kontroll klone (Ctr-Top) eller på Fop konstruere med muterte LSF /TCF steder i begge kloner (Ctr-Fop og shβ-FOP).
Dess
CTNNB
en lyddemping for to dager betydelig redusert mRNA-nivået til endogen kanoniske nedstrøms target gen av Wnt /β-catenin vei, det vil si
AXIN2
, i shβ klone (figur 1-B , shβ: -82%, p 0,01) sammenlignet med kontroll kloner (Ctr,
ns
)
CTNNB1
stanse endrer spredning, cellesyklus og apoptose
en gang kurs studie av
CTNNB1
stanse i H295R cellelinje viser en signifikant reduksjon i spredning (-45,8% på 12 dager, p 0,05) sammenlignet med shβ klone uten
CTNNB1
tie (-dox) eller kontroll klon (figur 1-C), bestemt ved MTT-konvertering.
Strømningscytometrisk analyse av cellesyklus ved propidiumjodidfarging viste ingen effekt på cellesyklus inntil 5 dager. Men etter 10 dager med behandling DOX,
CTNNB1
stanse resulterte i akkumulering av celler i G1 faser, og en reduksjon av celleandelen i S-fasen (figur 1-C, shβ-10D-G1: 55,3 ± 0,4%
vs
65,8 ± 2,2%; -S: 27,5 ± 0,2%
vs
16,5 ± 1,6%, p 0,05). Ingen slik forskjell ble observert i kontrollgruppen klon (Ctr). På dette tidspunktet, observerte vi en reduksjon på to viktige proteiner for G1 /S overgang, cyclin A og CDK2 bare i celler forstummet for
CTNNB1 plakater (figur 1-C).
På samme måte ingen effekt på apoptose analysert ved flowcytometrisk analyse av annexine V inkorporering i celler, ble observert inntil 5 dager mens 10 dager DOX indusert
CTNNB1
stanse økt andelen av apoptotiske celler (figur 1-C, shβ- 10d: 167%, p 0,05) sammenlignet med celler uten DOX behandling. Ingen slik forskjell ble observert i kontrollgruppen klonen. Denne økningen av apoptose av
CTNNB1
lyddemping ble også bekreftet av gevinsten av en proapoptotiske protein nivå, kløyvde caspase3 (CC3), som var påviselig allerede på et tidligere tidspunkt (5 dager, figur 1-C). Likeledes
CTNNB1
stanse økt apoptotisk effekt av staurosporin (figur 1-C; shβ-5d + stau: 224%
vs
377%, p 0,05), mens ingen signifikant forskjell ble observert i kontroll kloner.
CTNNB1
lyddemping avskaffe xenograft utviklingen av ACC cellelinje
for å evaluere den funksjonelle betydningen av β-catenin knock-ned på svulst utvikling vi gikk videre med etterforskningen i en subkutan xenograft tumor modell i atymiske nakne mus.
i et første skritt, kortsiktige eksperimenter med
CTNNB1
inaktive på etablerte tumorer (21 til 31 dager etter xenografting) for en varighet på 9 dager ble utført for å speile tidsforløpet fra vår
in vitro
eksperimenter (figur 1-C). Ligner på
in vitro
sette mRNA uttrykk analyser avslørte en DOX avhengig betydelig reduksjon i tumor
CTNNB1 Hotell og
AXIN2
uttrykk i shβ klone (figur 2-A;
CTNNB1
: -89%, p = 0,007;
AXIN2
: -87%, p 0,001), mens kontroll kloner forble upåvirket av DOX behandling. Videre, og i samsvar med de cellekultur eksperimenter, immunohistokjemisk analyse (figur 2-B) viste en DOX behandling avhengig reduksjon av β-catenin protein. Men, vi har ikke observert noen forskjeller for Ki67 og det spaltede caspase3 uttrykk ved immunhistokjemi analyser (data ikke vist), noe som tyder på at 9 dager av DOX er ikke tilstrekkelig
in vivo
å indusere effekter på spredning og på apoptose . Fordi denne gangen kurset er for kort til å undersøke en potensiell effekt på tumorvekst i en
in vivo
modell, ble lang sikt DOX behandling utført. Ctr og shβ kloner ble injisert subkutant og 3 dager etter tumorfremkallelse mus ble behandlet med DOX på en kontinuerlig måte. Det er ingen vesentlig forskjell etter 31 dager i tumorstørrelse mellom shβ og Ctr kloner i fravær av DOX behandling, men det er synes at shβ klone vokse saktere enn Ctr klone, sannsynligvis på grunn av en klonal effekt. Av denne grunn doxycyklin-induserbare system er egnet, fordi klonene har sin egen kontroll. Mens DOX behandling ikke påvirke tumorvekst og vekt i kontroll klone (figur 2-C-venstre, median vekt: 112 mg
vs
162,7 mg,
ns
), var det en betydelig virkningen av
CTNNB1
stanse på DOX behandling i shβ klone (figur 2-C-rigth). Faktisk, for shβ klon, i løpet av de første 10 dagene, tumorvekst var observerbare i begge gruppene (uten eller med DOX), men etter 13 dager, ingen svulst var detekterbar i noen av musene i shβ gruppen behandlet med DOX, også etter disseksjon og patologisk analyse (figur 2-C-rigth, median vekt 67,4 mg
vs
0 mg, p 0,001).
A, Histograms representere
CTNNB1 plakater (
β-catenin
) og
AXIN2
mRNA-akkumulering i xenograft for både Ctr (-dox n = 6; + DOX, n = 5) og shβ (-dox, n = 5; + DOX, n = 5) kloner på etablerte svulster og etter 9 dager av DOX behandling. B, hematoxylin-eosin-safran og β-catenin, farging (× 20) på representative svulster shβ klone uten og med DOX behandling (samme eksperiment som B). C, boksplott, er kreft størrelser for Ctr og shβ xenograft i mus behandlet kontinuerlig med bil eller DOX etter 3 dager med svulst induksjon. Boksplott i venstre hjørne representerer vekten av tumorer skåret. Ctr (-dox n = 7, + DOX n = 8), shβ (-dox, n = 7; + DOX, n = 8)
Diskusjoner
I mange. kreft, spiller Wnt /β-catenin signalveien en viktig rolle å regulere cellevekst, motilitet, og differensiering [19]. Vi og andre har tidligere vist betydningen av Wnt /β-catenin signalveien aktivering i binyrebarken tumorigenesis [5] – [10]. Denne aktiveringen er forbundet med en spesifikk molekyl signatur og et dårligere resultat med lavere totaloverlevelse [12]. Doghman og kolleger tidligere viste at et TCF antagonist hemmer spredning av binyrebark celler H295R, tyder på en sentral rolle Wnt /β-catenin banen i adrenocortical tumorigenesis [20]. Dette kan imidlertid farmakologisk tilnærming ikke være spesifikk for Wnt signalering. Vi her, med både
in vitro Hotell og
in vivo
eksperimenter viser at direkte og spesifikke β-catenin inaktive føre til endringer av spredning, cellesyklus og apoptose som fører til en dramatisk nedgang i svulst utvikling i en svulst modell for ACC. Ytterligere forsøk er nødvendig for å vite om β-catenin inaktive undertrykker vekst eller hindrer innpoding av cellene. Likevel, disse resultatene bekrefter en /den biologiske konsekvensen av Wnt /β-catenin vei aktivering i adrenocortical tumorigenesis, og 2 /hoved terapeutisk interesse å målrette denne veien.
Hemming av Wnt /β-catenin banen i en undergruppe av aggressive ACC synes å være en interessant terapeutisk mål og bør vurderes nærmere i fremtiden.
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1.
PCR betingelser og antistoffer som brukes
doi:. 10,1371 /journal.pone.0055743.s001 plakater (XLS)
Takk
Dr. E Lalli for den generøse gaven av H295R /TR celler og Dr. H Clevers for den generøse gaven av Pter-sh
βcatenin
vektor.
