Abstract
Bakgrunn
Notch og Wnt trasé er viktige regulatorer av intestinal homeostase og endringer i disse banene kan føre til utvikling av kolorektal kreft (CRC). I CRC
Apc /β-catenin
gener i Wnt signalveien er ofte mutert og aktiv Notch signalering bidrar til tumorigenesis ved å holde epitelceller i en proliferativ tilstand. Disse banene er samtidig aktiv i proliferativ adenom celler og en crosstalk mellom dem har tidligere blitt foreslått i normal utvikling så vel som i kreft.
hovedfunnene
I denne studien,
i silico
analyse av mulige arrangører involvert i transcriptional regulering av gener som koder for proteiner i Notch signalveien avdekket flere antatte LEF-1 /TCF nettsider som potensielle mål for β-catenin og kanoniske Wnt signalering. Flere resultater fra konkurranseelektromobilitet-shift-analysen (EMSA) studier tyder binding av flere mulige steder i Notch sti genet arrangører til
in vitro
oversatt β-catenin /Lef-en. Villtype (wt) -Apc negativt regulerer β-catenin. Ved induksjon av wt-Apc eller β-catenin stanse i HT29 celler, observerte vi at flere gener i Notch pathway, inkludert
Notch-2
ble nedregulert. Til slutt ble aktiv Notch signale bekreftet i
Apc
Min /
+ musemodell der
Hes-en
mRNA nivåer ble funnet signifikant oppregulert i tarmsvulster i forhold til normal intestinal mucosa. Luciferase analysene viste en økt aktivitet for kjernen og proksimale
Notch-2
promoter ved co-transfeksjon av HCT116-celler med høy ekspresjon rekombinant Tcf-4, Lef-en eller β-catenin.
konklusjoner
i denne artikkelen har vi identifisert
Notch-2
som en roman mål for β-catenin avhengig Wnt signalering. Videre våre data støtter forestillingen om at flere gener i Notch veien kan bli transcriptionally regulert av Wnt signal i kolorektalkreft
Citation. Ungerbäck J, Elander N, Grünberg J, Sigvardsson M, Söderkvist P (2011) The
Notch-2
Gene er regulert av Wnt signale i Cultured tykktarmskreftceller. PLoS ONE 6 (3): e17957. doi: 10,1371 /journal.pone.0017957
Redaktør: Kerstin Borgmann, Universitetssykehuset Hamburg-Eppendorf, Tyskland
mottatt: 28 juli 2010; Godkjent: 21 februar 2011; Publisert: 18 mars 2011
Copyright: © 2011 Ungerbäck et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av Vetenskapsrådet og Östergötlands län Council. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser: Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
epitel av mage-tarmkanalen er kontinuerlig erstattet med en turn-over frekvensen av to til syv dager. For å opprettholde homeostase i tarmepitelet, behandler cellulær proliferasjon, differensiering, migrasjon og død må være strengt regulert [1] – [3]. Noen få, men svært konserverte signalveier er tenkt å kjøre disse prosessene (anmeldt i [4], [5] og [6]). Den kanoniske Wnt signalveien var den første til å bli oppdaget som avgjørende for intestinal krypten celleproliferasjon og homeostase [7] – [10]. En sentral komponent i denne reaksjonsvei er den cytoplasmiske protein β-catenin, noe som når translokert inn i kjernen som et resultat av wnt signaler, tjener som en ko-faktor for transkripsjonsfaktorene av LEF-1 /Tcf (Lymfoid enhancer faktor-1 /T-celle Factor) familie for å tillate aktivering av en nedstrøms genetisk program [11]. Nivået av β-catenin i tykktarmen epitel er regulert av ubiquitinin-proteasome system [12]. Ett av de kritiske komponenter i β-catenin ødeleggelse komplekset er adenomatøs polypose coli (APC) protein [11]. Mutasjonsinaktivering av dette gen fører til stabilisering av β-catenin [13] og økt celleproliferasjon og representerer en av de mest vanlige genetiske endringer i kolorektal cancer (CRC) [14]. Dette resulterer i økt nivå og kjernefysisk translokasjon av β-catenin og påfølgende feilregulert aktivering av LEF-1 /TCF målgener [5].
modning av tarm stamceller er også regulert av Notch signalveien som representerer en annen evolusjonær konservert signaleringssystem som er involvert i å opprettholde tykktarm epitel homeostase [2] – [4], [15] – [17]. Kjerneelementer i denne signalveien er de monomere transmembrane bundet Notch reseptorer (Notch1-4 hos pattedyr), som ved binding til ligand (Deltalike-1, -3, -4, Jagged-1 eller -2) slipper et intracellulært domene (NiCd ) som fungerer som en transkripsjonen ko-faktor. Spesifisiteten av ligand /reseptor interaksjon er bestemt gjennom tilsetting av sukkerdeler av glycosyltransferases fra
Fringe
genet familien (
Lunatic Fringe
,
Lfng
;
Maniac fringe
,
Mfng Hotell og
Radical frynser
,
Rfng
) [18] – [20]. NICD translocates inn i kjernen for å danne en transkripsjonen aktivering kompleks med DNA-bindende faktor CSL (RBP-jκ) og co-aktivatorer som hører til
Mastermind-lignende
familie (
Maml
) [ ,,,0],15], [21], [22]. Noen av de beste-preget målene for denne transkripsjonen aktivering komplekset hører til
Hes
-og
Hei
familie av gener, som fungerer som transkripsjons repressors av ytterligere nedstrøms mål som
Math- 1 product: (musehomolog av menneskelig
Hath-en
) [23] – [25]. Det har blitt foreslått at Notch-1 og Notch-2-funksjon redundant i tarmen, og det kanoniske bane aktivering gjennom en av disse reseptorene er tilstrekkelig til å forhindre differensiering av proliferative krypten stamceller i post-mitotiske slimceller, noe som indikerer at Notch signale kunne være disponerende for malign transformasjon [2]. Dette har vært forbundet med derepresjon av den cyklin-avhengige kinase-inhibitorer p27
Kip1 og p57
Kip2 [2], så vel som oppregulering av
Math-1
mRNA og protein [2], [26 ], [27]. Imidlertid
Notch-2
har også blitt foreslått å ha en tumor undertrykkende effekt på CRC [28], som tyder på komplekset, eventuelt trinn relatert, funksjoner av Notch signalering i tarmen.
I tillegg til de uavhengige rollene til wnt og Notch signalveier i tumorgenese i tykktarmen, funnene som tumorutvikling i APC-manglende mus forsterkes ved samtidig aktivering av Notch og wnt signaler [29], og at mange tarmsvulster viser unormal aktivering av begge reaksjonsveier [3] tyder på en molekyl samspill mellom Notch og Wnt signalering i dannelsen av CRC. Til tross for den tilsynelatende betydningen av denne crosstalk og som koordinerte tiltak har blitt rapportert på ulike nivåer [30], er lite kjent om de molekylære mekanismene som knytter disse banene i tarmepitelet. Det har vist seg at
Hath-en
uttrykk øker når Wnt veien er sperret [26] og at
Hes-en
er et direkte mål for kanoniske Wnt signal i kolorektale adenomer og karsinomer [29], [31] Videre har Jagged-en vist seg å representere en molekylær forbindelse mellom Wnt og Notch i CRC, der
Jagged-en
genet er direkte regulert av β-catenin /Tcf-4 [32]. Samspillet mellom Wnt og Notch i CRC, og resultatene av disse, er ikke fullt ut forstått og resultater fra ulike studier er ofte divergerende [3], [31]. Dette understreker kompleksiteten av krysstale og antyder at det ikke kan ganske enkelt være et spørsmål om felles nedstrøms mål for trasé.
I denne studien vi har undersøkt muligheten av Wnt signalveien for direkte regulering av gener involvert i Notch signalering. Denne viste at flere av de antatte promoter regioner i Notch pathway forbundet gener inneholde Lef-1 /Tcf-bindingssteder. Noen av disse genene ble nedregulert ved ekspresjon av et funksjonelt APC-genet i det HT29 CRC-cellelinjen, støtter ideen om at unormale Wnt signalering har en direkte innvirkning på ekspresjon av gener som koder for proteiner involvert i Notch-signalering. Derfor foreslår vi at viktige deler av Notch signalveien er direkte påvirket av Wnt signalering med den konsekvensen at selv en genetisk normal Notch vei kan bidra til tumorigenesis grunn av responsen på p-catenin eller
Apc
mutasjoner.
Resultater
Arrangøren sett og
i silico
identifisering av potensielle LEF-1 /TCF-sider i Notch pathway arrangører
for å identifisere potensielle mål for interaksjoner mellom Notch og wnt signalveier, 65 gener, kjent for å være viktig for Notch og wnt signalering, ble valgt bioinformatically bruker oppfinnsomhet pathways Analysis (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com), sammen med omfattende litteratursøk. Gene promotersekvenser ble hentet med Genomatix Gene2Promoter programvaren og den gjennomsnittlige lengden på den antatte kjerne, proksimale og deler av de distale arrangører ble justert til ca 2500 bp (detaljer tilgjengelig på forespørsel). Ved hjelp av den MatInspector programvare [33] promoterregionene sett for putatitve LEF-1 /TCF-områder ble identifisert med de antatte konsensus sekvensene: 5 «- (A /T) (A /T) CAA (A /T) G-3 «[34]. Tjuefire av de undersøkte genene i Notch veien ble funnet å inneholde en eller flere mulige LEF-1 /TCF områder (Fig. 1 og tilleggsinformasjon S1).
I silico
analyse av genetiske nettverk direkte involvert i Notch og Wnt signal foreslå overlapping og direkte krysstale via Notch målet genet aktivisering gjennom kanoniske Wnt signalering. Ved hjelp av MatInspector, [33] gen-promotorer i Notch pathway ble funnet å inneholde i det minste en formodede LEF-1 /TCF-site (antall områder i per-genet er beskrevet i hakeparenteser). Gener i grå bokser ble utsatt for ytterligere semi kvantitativ RT-PCR-analyse.
Dermed
i silico
analyse av de genetiske nettverkene er involvert i Notch og Wnt signal støtter tidligere vist interaksjoner med
Hes-1 product: [31] og
Ujevne-1 product: [32] og, dessuten, antyder en direkte krysstale via målet genaktivering på flere andre nivåer i hakk pathway.
den β-catenin /Lef-en-kompleks binder in vitro til hakk sti genet arrangører
for å finne ut om
i silico
identifisert LSF-1 /TCF bindende sekvenser fysisk binde seg til den β-catenin /Lef-en kompleks
in vitro
, gjennomførte vi en konkurransedyktig elektro mobilitet-shift-analyse (EMSA) med et radioaktivt merket konsensus LSF-1 /TCF sterk binding probe (CD1TOP [35]) og duplex oligonukleotider som dekker de potensielle områdene i mål arrangører. Notch pathway EMSA promotor sonder (Tabell S1) ble testet mot en
in vitro
oversatt Lef-1 /ß-catenin kompleks.
For å bekrefte at radioaktivt merket CD1TOP binder Lef-en spesifikt, plasmid -fri reticulocyte lysatene ble utsatt for
in vitro
oversettelse og inkuberes med en radiomerket probe. Som ventet ingen binding ble observert (fig. 2). Alle de undersøkte
Notch
genet arrangører,
Notch-2
,
Jagged-en
,
Maml-en
,
Hes-en
,
Rfng
,
Lfng Hotell og
Numbl
, viste binding av minst en antatt LSF-1 /TCF området i sine promotorområdene identifisert
i silico product: (fig. 2) (ekstra konkurranse EMSA resultater er funnet i). Så vidt vi vet
Notch-2
,
Maml-en
,
Rfng Hotell og
Lfng
er nye potensielle Wnt målgener som ikke er beskrevet tidligere. To av de sterkeste bindingsseter ble funnet i
Jagged-en
promoter ved -1933 og -1635 forhold til oversettelse start området, som er i samsvar med tidligere studier der
Jagged-en
har vist seg å være en β-catenin /Tcf-4-regulert gen i human CRC [32] samt i mus hårsekkene [36].
Hes-en
har nylig også blitt identifisert som en direkte transcriptional mål av β-catenin /Tcf-4-avhengige Wnt signal i CRC [31] og vår EMSA data støtter denne oppfatningen ved klart å identifisere
Hes -1
-528 som et bindingssete for β-catenin /Lef-en kompleks (fig. S1).
Konkurranse elektro mobilitet-shift analyse av den proksimale
Notch-2
promoter. Duplex CD1TOP prober ble «end merket» med [
32P] dATP, inkuberes med
in vitro
oversatt β-catenin /Lef-en og utsatt for konkurranse med overflod av kald eller kalde muterte promoter duplex oligonukleotider ( × 300 og × 900, henholdsvis). De protein-DNA-kompleksene ble separert ved elektroforese og visualisert ved autoradiografi. Som en konkurranse kontroll kald CD1TOP og kald mutert CD1FOP konkurrerte med radiomerket CD1TOP og for å bekrefte at radioaktivt merket CD1TOP binder Lef-en spesielt, plasmid-free retikulocyttlysat ble utsatt for
in vitro
oversettelse og inkubert med radiomerket probe. Gene nummerering beskrive plasseringen av LEF-1 /TCF-site forhold genet oversettelse start stedet. Justeringer i hele bildekontrastnivåer ble utført i Adobe Photoshop CS4.
Resultatene fra både
i silico Hotell og DNA-bindende analyser tyder på at en transkripsjons nettverk knytter Wnt og Notch sti , noe som tyder på en funksjonell regulering av kanoniske Wnt signal på flere nivåer i Notch veien.
Canonical Wnt signal regulerer Notch pathway gener i HT29 tykktarmskreft cellelinje og musetarm adenomer
mutasjonsinaktivering av
Apc
genet er en viktig hendelse i kolorektal kreftutvikling og gjengir konstituerende aktiv Wnt signal [13], [14]. For å utvikle de
i silico Hotell og DNA bindingsanalyser og funksjonelt undersøke effektene av aktivert Wnt signal på Notch pathway gener, nitten gener i Notch sti, kjent for å være viktig for kanonisk Notch signalering (Fig. 1 og tabell S1), som inneholder antatte LEF-1 /TCF-sider, ble valgt ut for videre studier med semi-kvantitativ RT-PCR. For å aktivere wt-Apc og dermed begrense nivåene av kjernefysisk β-catenin, ble en HT29 cellelinje bærer en Zn-induserbar wt-Apc vektor brukt. Som forventet var det en økning på vekt-APC nivåer i HT29-APC, 6-24 timer etter Zn
2 + -stimulation, men ikke i HT29-β-gal celler (fig. 3A). De 19 Notch pathway gener ble analysert ved semi-kvantitativ RT-PCR og
Hes-en
,
Hes-7
,
Notch-2
,
Maml- 1
,
Lfng
,
Rfng
,
Numb Hotell og
Numbl
ble funnet å være transcriptionally nedregulert, mens negativt regulert genet
Hath-en
var tydelig oppregulert 18-24 timer etter wt-Apc induksjon (fig. 3B). Som en positiv kontroll,
cyklin D1
-Gene ekspresjon, indusert av β-catenin [37], ble nedregulert 6-24 timer etter Zn-induksjon, som bekrefter inhibering av Wnt vei via ekspresjon av vill-type APC og redusert β-catenin nivåer. Resultatene er i overensstemmelse med tidligere studier hvor β-catenin proteinnivåer har vist seg å bli nedregulert [38] og den β-catenin /hTcf-4 atom kompleks redusert [39] på Zn-stimulering i HT29-APC-celler indikerer, redusert nivåer av kjernefysisk β-catenin. Interessant, vi kunne ikke finne noen påvirkning av Wnt signal og wt-Apc uttrykk på
Jagged-en
i HT29 celler selv om en bekreftet spesifikk binding av CD1TOP til
in vitro
oversatt Lef-en ble erstattet med en 300-fold overkant av kalde
Jagged-en
-1933 og -1635 sonder, men ikke med sine muterte varianter (fig. 2). For å avgjøre om nedregulering av Notch sti gener, ved wt-APC, er direkte under kontroll av β-catenin, utførte vi anti-β-catenin siRNA stanse forsøkene (fig. S2), ved hjelp av en pool av fire forskjellige siRNAs rettet mot β- catenin. Generelt downregulation var av mindre betydning enn Zn indusert reduksjon i
Notch-2
,
Numb og Numbl plakater (Fig. 2A), viser en svak, men konsekvent nedgang i sine respektive mRNA nivåer.
Hes-en
var tydelig downregulated 72-96 timer etter transfeksjon, bekreftende funnene av Peignon
et
al. [31].
Rfng Hotell og
Lfng
ble ikke påvirket av β-catenin stanse indikerer at deres downregulation av Wnt signal observert i fig. 3B kan ikke være en direkte effekt av β-catenin indusert transkripsjon brukt i denne eksperimentelle oppsettet.
Cyclin D1
ble brukt som en positiv kontroll for siRNA eksperimenter og var tydelig downregulated 72-96 timer etter transfeksjon. For å teste mer langsiktige effektene av deregulert Wnt signal i tarmepitelet vi analysert
Notch-en
,
Notch-2 Hotell og
HMS-1
mRNA uttrykk nivåer i Apc
MIN /+ mus (fig. 3C) som bærer en kimlinje avkorting heterozygot mutasjon ved kodon 850. mRNA-nivåer av
mHes-1
ble funnet å være signifikant oppregulert i adenomer (median relative uttrykk = 2,0, interkvartile området = 1.5 til 2.4) sammenlignet med normal tarmslimhinnen (median relativ uttrykk = 1,5, indre kvartilområdet = 0,9-1,7) (Mann-Whitney U-test,
p
= 0,013), noe som indikerer overactivated Notch signalering i muse adenomer.
En
trend mot oppregulering ble observert for
mNotch-2
i svulstvev (median relativ uttrykk = 1,6, interkvartilt område = 1,0-2,0) sammenlignet med normal tarmslimhinnen (median relativ uttrykk = 1,3 , interkvartilt område = 0,9 til 1,8) (Mann-Whitney U-test,
p
= 0,14), mens ingen statistisk signifikante forskjeller kunne påvises for
mNotch-en product: (median relativ uttrykk = 3.9, indre kvartilområdet = 02.05 til 05.07 (svulstvev)) vs (median relativ uttrykk = 3,8, interkvartilt område = 02.04 til 05.03 (normalt vev)) (Mann-Whitney
U
-test,
p
= 0,9).
Wt av APC ble indusert i HT29-APC-celler ved tilsetning av 100 mM ZnCl
2 til vekstmediet. Semi-kvantitativ RT-PCR ble utført på cDNA reverstranskribert fra 200 ng total-RNA fra hvert tidspunkt (0-24 timer etter wt-APC induksjon). Barer beskrive den relative uttrykk for
Notch-2
i HT29-APC-celler (*) versus HT29-β-galaktosidase celler (**) normalisert mot
GAPDH
uttrykk.
Cyclin D1
ble anvendt som en positiv kontroll for Wnt inaktivering. (B) Et protein ekspresjon av APC (~310 kDa), Notch-2 (~265 kDa), vekt- og lasting kontroll, GAPDH, ble bestemt ved Western blot etter 0-24 h av sink stimulering. Justeringer i hele bildekontrastnivåer ble utført i Adobe Photoshop CS4. (C) Relativ mRNA uttrykk for murine
Notch-en
,
Notch-2 Hotell og
Hes-en
i tumorer og tilsvarende ikke-tumor normal tarmslimhinnen av Apc
Min /+ mus. mRNA uttrykk var knyttet til den endogene kontroll genet GAPDH. Hvite søyler (n = 16), svart kolonner (n = 22). Barer er presentert som median uttrykk verdier. Feilfelt beskrive interkvartile området.
I konklusjonen, inaktivering av Wnt vei gjennom aktivering av wt-Apc i HT29 CRC celler nedregulerer flere målgener i Notch veien mens mRNA-nivåer av Notch målet
mHes-en
er betydelig oppregulert i tarmsvulster fra APC mangelfull mus. Dette ytterligere støtter en direkte transkripsjonen crosstalk foreslått av
i silico Hotell og
in vitro
DNA-bindende analyser.
i silico
identifisert hakk 2 promoter inneholder fire antatte LEF1 /TCF-sider og bidrar til en høy luciferase genaktivitet
Notch-to funksjoner redundant med Notch-en i kolon epitelceller der begge gener er viktige for å holde cellene i krypten rommet i en proliferativ og udifferensiert tilstand [2]. Men relativt lite er kjent om transcriptional regulering av
hakk
gener og en potensiell regulering av
Notch-2
gjennom Wnt signal kan være av betydning i utvikling og /eller progresjon av CRC og potensielt i andre kreftformer også. Tidligere har det vist seg at både
Hes-1 Hotell og
Jagged-1
er direkte mål av kanoniske Wnt signal i CRC [31], [32]. Våre resultater fra
i silico
,
in vitro
DNA-bindende analyser og aktivering av wt-Apc, sterkt at det er en direkte positiv regulering av
Notch-2
gjennom Wnt-signal. Derfor ønsket vi å ytterligere belyse β-catenin /Lef-1 /Tcfs regulere potensialet i
Notch-2
promoter i CRC cellelinjene HT29 og HCT116.
Som beskrevet ovenfor,
in silico
analyser ble brukt for å identifisere humane
Notch-2
promoter og en potensiell transkripsjonen startsetet (TSS) ble funnet 256 bp oppstrøms det translasjonelle startsete, verifisere resultatet fra Gene2Promoter analyse. Fire putative LEF-1 /TCF-konsensusseter ble identifisert i kjernen og proksimale promoterregion i posisjonene -2261, -869, -689 og -110 i forhold til det translasjonelle startsetet (fig. 4A). Den -110 området viste sterk binding til Lef-en i
in vitro
DNA-bindende konkurranse EMSA analysen mens sider -2261 og -689 viste svak binding (fig. 2).
(A ) Skjematisk fremstilling av den proksimale
Notch-2
promoter med de fire antatte LEF-1 /TCF-bindende konsensus områder, identifisert med Genomatix MatInspector, i posisjonene -2261, -869, 0,689 og -110 relative translasjonell startwebstedet (ATG). En potensiell transkripsjon start stedet ble kartlagt for å posisjonere -256 hjelp Genomatix Gene2Promoter og PromoterInspector programvare. Store bokstaver indikerer kjernen konsensussekvens. (B) N2PR -2327 /-99, N2PR -110 i pGL3-TATA samt tom pGL3-TATA (Smith
et al
, 2002 [40]) ble transfektert inn HCT116 og og co-transfektert med pSV-β-galaktosidase kontroll vektor. Cellelysatet 24 timer etter transfeksjon ble utsatt for luciferase-rapportør analyser og relativ luciferaseaktivitet bestemt. Feilfelt beskrive SEM.
For å analysere
Notch-2
promoter, fokuserte vi på 2200 nucleotide regionen spenner over både den 5 «og 3» regioner av
Notch -2 antatte
transkripsjonen start stedet. To separate konstruksjoner ble generert, en som strekker seg fra posisjon -2327 til -99 (N2PR -2327 /-99) (tall i forhold til translasjonsforskning start stedet), og dermed dekker alle fire antatte LEF-1 /TCF-sider og en som dekker antatte LEF- 1 /TCF-området -110. De ble klonet inn en ildflue luciferase reporter vektor (pGL3 Luciferase reporter vektor, Promega) som inneholder en TATA-boks for å oppdage mulig enhancer og repressor
cis
-acting elementer (beskrevet tidligere [40]). Konstruksjonene ble transient transfektert inn HCT116 eller HT29 celler og reporter gen aktiviteter ble målt til 24 timer etter transfeksjon. Arrangøren aktivitet ble forsterket 13 ganger for N2PR -2327 /-99 vs. 1,7 ganger for N2PR -110 arrangøren konstruksjon i forhold til bakgrunnen i HCT116 cellelinjer (p 0,007 vs. p = 0,04, n = 6 (fig 4B. )). Luciferase-analysen viser at det klonede området av den antatte
Notch-2
promoteren inneholder forsterkerelementer som fører til økt transkripsjon av luciferasegenet. Disse resultatene sterkt at plasseringen av kjernen, den proksimale delen og deler av den distale
Notch-2
promoter som er identifisert av
i silico
analyse.
Overuttrykte β-catenin, Lef-en eller Tcf-4 resultat i økt Notch-2 promoter aktivitet
Notch-2
mRNA og proteinnivåer er tydelig downregulated 18-24 timer etter Zn-induksjon av wt-APC i HT29-celler (fig. 3B og B).
Notch-2
mRNA uttrykk ble også analysert følgende
RNAi
stanse av β-catenin i HT29 celler hvor en svakere effekt ble observert lik den andre vekt-Apc /β-catenin regulert Notch pathway gener (fig. S2).
resultatene fra HT29-APC cellelinje hvor Apc ble aktivert eller β-catenin forstummet, innebærer en aktiverende rolle Wnt veien på
Notch-2
og nedstrøms målet genet
Hes-en product: [31].
