Abstract
Fremveksten av kastrering resistent prostatakreft (CRPC) bidrar til den høye dødeligheten av pasienter diagnostisert med prostatakreft (PCA), som delvis kan tilskrives eksistens og fremveksten av kreft stamceller (cscs). Nyere studier har vist at deregulert ekspresjon av microRNAs (mirnas) bidrar til initiering og progresjon av PCa. Blant flere kjente mirnas, la-7 familien ser ut til å spille en nøkkelrolle i tilbakefall og progresjon av PCa ved å regulere cscs; imidlertid mekanismen ved hvilken la-7 familie bidrar til PCa aggressivitet er uklart. Enhancer av Zeste homolog 2 (EZH2), en antatt mål for la-7 familie, ble demonstrert for å kontrollere stamcellefunksjon. I denne studien fant vi tap av utleid-7 familie med tilsvarende over-uttrykk for EZH2 i menneskelige PCA vevsprøver, spesielt i høyere grad svulster Gleason. Overekspresjon av la-7 ved transfeksjon av la-7 forløpere redusert EZH2 uttrykk og undertrykt klonogene evne og sfære dannende kapasitet på PCA celler, noe som var i samsvar med hemming av EZH2 3’UTR luciferase aktivitet. Vi fant også at behandlingen av PCA celler med BR-DIM (formulert DIM: 3,3′-diindolylmethane av Bio Response, Boulder, CO, forkortet til BR-DIM) oppregulert la-7 og nedregulert EZH2 uttrykk, i overensstemmelse med inhibering av selvfornyelse og klonogene kapasitet. Videre BR-DIM inngripen i vår pågående fase II kliniske studier på pasienter før radikal prostatektomi viste oppregulering av la-7 forenlig med nedregulering av EZH2 uttrykk i PCA vevsprøver etter BR-DIM intervensjon. Disse resultatene tyder på at tapet av la-7 mediert økt uttrykk av EZH2 bidrar til PCa aggressivitet, som kan dempes ved BR-DIM behandling, og dermed BR-DIM er sannsynlig å ha klinisk effekt
Citation.: Kong D, Heath E, Chen W, Cher ML, Powell jeg, Heilbrun L, et al. (2012) Tap av Let-7 Up-Regulerer EZH2 i prostatakreft I samsvar med Acquisition of Cancer Stem Cell signaturer som blir dempet av BR-DIM. PLoS ONE 7 (3): e33729. doi: 10,1371 /journal.pone.0033729
Redaktør: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japan
mottatt: 15 november 2011; Akseptert: 16 februar 2012; Publisert: 19 mars 2012
Copyright: © 2012 Kong et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av et stipend fra National Cancer Institute, National Institutes of Health (5R01CA108535-06 og 5R01CA083695-08) tildelt FHS. (https://projectreporter.nih.gov/reporter_searchresults.cfm? new=1 icde=4342569 loc=2 CFID=28929570 CFTOKEN=80568291). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (PCA) er den nest største årsaken til kreftdød i menn i USA drepte i løpet av 32,050 menn i 2010 [1]. I de siste ti årene har det vært betydelige forbedringer i de kirurgiske behandlingstilbud for pasienter diagnostisert med lokaliserte PCa. Prostata kirurgi har også dratt nytte av tekniske og teknologiske fremskritt som nervebevarende prostatektomi og robot prostatektomi. Adjuvant behandling, definert som tilleggsbehandling for å redusere eller eliminere lokal og fjernt sykdom, tilbys pasienter [2], særlig de som har høy risiko for tilbakefall (som ofte definert av d’Amico kriteriene for PSA 20 ng /ml, Gleason 8-10, og scenen T2C til T4) [3].
Strålebehandling og systemisk terapi spesielt androgen deprivasjon terapi (ADT) anses som rime adjuvant behandlingsalternativene. Pasienter i høyrisiko kategorien har et tilbakefall på mer enn 50% innen sin levetid, noe som er uakseptabelt. Men en av de bekymringer i tilby adjuvant terapi for alle pasientene i høyrisikogruppen er at selv om mer enn 50% av pasientene som gjentar seg, er det 38-50% av pasientene som ikke [4]. For å redusere byrden av overbehandling hos denne pasientgruppen, er flere verktøy for å identifisere de virkelig høyrisikopasienter. Aktuelle verktøy som blir studert inkluderer prediktiv nomogrammer [5] og studier som evaluerte genuttrykk profilering, som har identifisert noen markører for tumor aggressivitet [6], [7] Selv om slike funn ikke har blitt oversatt til pasientbehandling.
siden tumorresidiv og metastasering bidrar til den høye dødeligheten, studier har antydet at aggressivitet PCa kunne være tett knyttet til oppkjøpet av kreft stamceller (CSC) eller kreft stamceller lignende celler (CSLCs) egenskaper. Emerging bevis tyder på at deregulert uttrykk for mange microRNAs (mirnas) inkludert utleid-7 familie bidrar til kreft progresjon og tilbakefall [8]. MicroRNAs er en klasse av ikke-kodende RNA på omtrent 20 til 22 nukleotider i størrelse. De regulerer genekspresjon etter transcriptionally ved å binde seg til et område i 3’untranslated regionen (3 «UTR) av målet mRNA. De er blitt vist å regulere cellesyklus, og utvikling og progresjon av kreft [9]. La-7 ble først oppdaget og godt studert i Caenorhabditis elegans. Den menneskelige la-7 familie består av la-7a, la-7b, la-7c, la-7d, la-7e, la-7F, la 7g, la-7i og MIR-98. Den la-7 familie er vanligvis sett på som en tumor suppressor i samsvar med nedregulering av onkogener slik som Ras [10], høy mobilitet gruppe A2 (HMGA2) [11] og c-myc [12] ved å bindes til 3’UTR av de nevnte mRNA. Videre redusert la-7-ekspresjon ble funnet i mange kreftformer, inkludert PCa [13], og det har vært knyttet til dårlig pasientprognose i lungekreft [14], hode og hals squamous cell carcinoma [15], og eggstokk-kreft [16 ].
Interessant nok har la-7 familiemedlemmer blitt vist å regulere den selvfornyelse kapasitet av brystkreftceller [17] og PCA-celler ved å regulere stamcelle-assosierte faktorer som Oct4, Sox2, og Nanog uttrykket [18]. Nyere studier har også dokumentert at la-7 kunne regulere ekspresjonen av Lin28 og Lin28B, som i sin tur blokkerer akkumulering av modne la-7 [19]. Denne tilbakemeldingen regulering spiller en avgjørende rolle i å regulere «stemness» ved å kontrollere selvfornyelse [20] – [23], som er den cellulære karakteristisk for cscs eller CSLCs forbundet med tumor aggressivitet og gjentakelse. Disse resultatene tyder på at den la-7 familien kan spille en nøkkelrolle i utviklingen av PCa ved å opprettholde og regulere molekylære funksjoner i cscs eller CSLCs ved PCA; Men hvordan la-7 familie bidrar til PCa aggressivitet er ukjent.
Enhancer av Zeste homolog 2 (EZH2) er en av målene til la-7 familie av miRNAs, og at uttrykket av EZH2 er sterkt assosiert med molekylære funksjoner i både normale stamceller og cscs eller CSLCs. EZH2 er en histon-lysin N-metyltransferase, en underenhet av polycomb undertrykkende kompleks 2 (PRC2). Den polycomb gruppe proteiner er kjent for å være involvert i reguleringen av genet undertrykkelse gjennom kromatin modifikasjoner, som er avgjørende for opprettholdelse av den embryonale og voksne stamceller [24], [25]. PRC2 inneholder EZH2, Suz12, miljømessige dimensjon, og RbAp subenheter og dette komplekset er kjent for å fungere i de embryonale og voksne stamceller til å undertrykke utviklings gener som fortrinnsvis aktiveres under differensiering [26]. Videre har flere studier vist at PRC2 målgener er co-okkupert av stamcelle regulatorer som Oct4, Sox2, og Nanog [27]. Nyere studier har også antydet at polycomb gruppe proteiner er ikke bare viktig for embryoutvikling, men spiller også viktige roller i startfasen og progresjon [25]. Over-uttrykk for EZH2 har vært sterkt knyttet til kreft progresjon delvis fordi PRC2 hemmer E-cadherin uttrykk, som fremmer epitelial til mesenchymale overgang (EMT) i kreftceller [28], et fenomen som minner om cscs eller CSLCs. Suz12 har vist seg å mekle E-cadherin hemming av snail1 [29]. Enda viktigere, EZH2 direkte regulerer DNA metylering ved å fungere som en rekrutteringsplattform for DNA metyltransferase [30]. I vår forrige undersøkelse fant vi at nivåene av EZH2 og Suz12 mRNA ble økt i PC3 PDGF-D-celler (EMT-fenotypiske celler) i forhold til PC3 Neo celler [18]. Disse resultatene tyder klart på at PRC2 kan bidra til EMT kjennetegn PC3 PDGF-D celler, som er konsistent med underskrifter fra cscs eller CSLCs som er forbundet med kreft progresjon og tilbakefall.
Tidligere prekliniske studier fra vårt laboratorium har vist at indol-3-carbinol (i3c) funnet i cruciferous grønnsaker og dens
in vivo
metabolitt 3,3′-diindolylmethane (DIM) spesielt formulert DIM (BR-DIM eller B-DIM) som vi har brukt i vår fase i kliniske studier [31], er potente midler i inhibering av veksten av PCA-celler, som er mediert av forandringer i multiple cellesignalisering [32]. Våre siste resultatene viste at BR-DIM forårsaket oppregulering av MIR-200B og MIR-200c som vanligvis tapt i PCA celler [33]. I denne studien fant vi tap av uttrykk for skuffelse 7 familie i samsvar med overuttrykk EZH2 ved PCA celler og i humane PCA vevsprøver, spesielt i svulster med høyere Gleason grad. Resultatene fra korrelasjonsanalyse viste at la-7 uttrykk ble omvendt assosiert med EZH2 uttrykk hos pasienter med høyere klasse svulster Gleason. Her finner vi også gi bevis for rollen som BR-DIM (formulert DIM: 3,3′-diindolylmethane, forkortet som enten BR-DIM eller B-DIM) i reguleringen av la-7 og EZH2 i PCA celler som dokumentert av vår pre-kliniske funn, samt funn fra vår pågående fase II klinisk studie i PCA pasientene fikk BR-DIM før radikal prostatektomi.
Materialer og metoder
Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP og kultur tilstand
LNCaP, C4-2B, og CWR22RV1 ble opprettholdt i RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) tilsatt 10% føtalt bovint serum (FBS), 10 umol /L Hepes, 50 enheter /ml penicillin og 50 ug /ml streptomycin. Stabile cellelinjer som over-uttrykker PDGF-D og tom vektor pcDNA3 ble samlet ved transfeksjon av PC3-celler med pcDNA3-PDGF-D: His eller tilsvarende tom vektor pcDNA3 neo som tidligere er beskrevet og referert til som PC3 Neo, eller PC3 PDGF-D celler [34], henholdsvis gjennom dette manuskriptet. Den PC3 Neo, PC3 PDGF-D, PC3, DU145-celler ble dyrket i RPMI 1640 medium med 2 mmol /l glutamin, 10 umol /L HEPES (Invitrogen, Carlsbad, CA) supplert med 5% føtalt bovint serum (FBS), 50 enheter /ml penicillin og 50 ug /ml streptomycin. PZ-HPV-7 og RWPE-1-celler ble anskaffet fra ATCC (Manassas, VA). Disse cellene ble dyrket i keratinocytt serumfritt medium (SFM-K) levert av Invitrogen (GIBCO) og forsynes med 0,05 mg /ml bovint hypofyseekstrakt (BPE) og 5 ng /ml human rekombinant epidermal vekstfaktor (EGF). Alle celler ble opprettholdt i en 5% CO
2-fuktet atmosfære ved 37 ° C, og genotypisk karakterisert til å støtte ektheten av disse cellene, som var i samsvar med sin opprinnelse.
Reagenser og antistoffer
antistoff mot EZH2 ble kjøpt fra BD Biosciences (Bedford, MA). Antistoff mot glyseraldehyd 3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) ble kjøpt fra Affinity BioReagents (Golden, CO). Geit-anti-mus IgG (H + L) -HRP konjugat ble oppnådd fra Bio-Rad (Reinach, BL). BR-DIM, et formulert DIM med høyere biotilgjengelighet, ble vennlig levert av Dr. Michael Zeligs (forkortet til BR-DIM eller B-DIM, Bio Response, Boulder, CO) og ble oppløst i DMSO for å gjøre 50 mmol /L lagerløsninger og lagret ved -20 ° C i flere deler for
in vitro
studien.
Etikk uttalelse
Pasient vev ble samlet etter å ha fått godkjenning fra Wayne State University Institutional Review Board (IRB). Denne kliniske protokollen er klassifisert som fritatt # 4 kategorier under NIH politikken fordi slike studier er retrospektive studier med arkiv prøven. IRB fravikes behovet for samtykke til bruk av arkiv prøvene, som var i samsvar med NIH retningslinjer, og prøvene ble analysert anonymt. PCa vevsprøver fra vår pågående klinisk studie av BR-DIM (B-DIM) intervensjon før radikal prostatektomi ble også oppnådd etter å ha fått godkjenning fra Wayne State University Institutional Review Board (IRB) og informert samtykke ble innhentet fra alle forsøkspersonene. Fordi denne studien er en vanlig klinisk studie, IRB prosessen som kreves skriftlig samtykke fra pasienter tidligere periodisert i den kliniske studien, som rutinemessig koordinert gjennom klinisk studie kontor (CTO). Godkjenningen gjennom IRB impliserer samsvar med samtykkende og periodisering uten hvilke pasienter som ikke kan meldes inn i studien, og dermed vår studie oppfylte alle de nødvendige samsvars retningslinjer fra CTO og IRB. Den lokale klinisk studie protokollnummer er 2007-128, som kan finnes i NIH klinisk trials.gov. (https://clinicaltrials.gov/show/NCT00888654). På tidspunktet for prøvetagning for den pågående etterforskningen, studieprotokollen påløpte 20 pasienter; har imidlertid studiet nå påløpt totalt 33 pasienter. Det er forventet at vi vil stenge denne studien med 37 pasienter tidlig i 2012.
Pasienter og prostatavevet prøvetaking
Etter å ha fått Institutional Review Board godkjenning, retrospektive arkiv forbehandling PCA vev og matchet tilstøtende normalt vev ble oppnådd fra Biospecimen Kjerne av Karmanos Cancer Institute (KCI) innsamlet fra pasienter som gjennomgikk radikal prostatektomi 2004-2010 på KCI. Vi har også fått PCA vevsprøver fra vår pågående klinisk studie av BR-DIM (B-DIM) intervensjon før radikal prostatektomi nydiagnostiserte PCA pasienter 2009-2011 på KCI og Henry Ford Health System (HFHS), Detroit, Michigan . Formalinfiksert parafin-embedded (FFPE) vev ble kuttet for miRNA og mRNA-analyse. Pasientenes kliniske egenskaper ble hentet fra sykehuset database inkludert rase som vist i Tabell 1. Patologiske funksjoner ble konstatert fra mikroskopisk vurdering av tumor lysbilder av patologer både KCI og på HFHS. Gleason score (klasse) ble oppnådd i hvert tilfelle fra den kliniske database.
klonogene analysen
C4-2B, PC3 PDGF-D, og PC3 PDGF-D-celler transfektert med la-7 familie i 24 timer ble samlet opp etter trypsinering, og re-suspendert i fullstendig medium. Enkeltcellesuspensjoner ble platet i vanlige 10 cm i diameter petriskåler på kolonien tetthet på 2000 celler pr tallerken. Etter 2-3 ukers inkubering med endring av friskt medium hver 3-4 dager ble kolonier farget med krystallfiolett i ytterligere 10 min, og vasket med 1 x PBS. Koloniene ble fotografert.
Soft agar assay
C4-2B cellene ble høstet og suspendert i kulturmedium. Myk-agar assay ble utført som tidligere beskrevet av vårt laboratorium [18]. Cellene ble behandlet med 10 eller 25 mikrometer BR-DIM med skiftende frisk media med BR-DIM hver 3. dag. Etter tre ukers vekst, ble kolonier farget ved inkubering med 0,5 mg /ml MTT i 4 timer, og deretter ble fotografert (40 x). Kolonien tallene ble talt under et fasekontrastmikroskop. Data ble presentert som koloni tall (% kontroll).
selvfornyelse kapasitet analysen
Enkeltcellesuspensjoner av C4-2B og PC3 PDGF-D-celler ble sådd ut i ultra lave tilhenger brønner av 6 -vel-plater (Corning, Lowell, Massachusetts) ved 2000 celler /brønn i DMEM /F12 (Invitrogen) inneholdende 1 x B27 og N2 (Invitrogen). Enkelt celle status ble bekreftet i henhold mikroskop. Friskt medium med 10 eller 25 uM ble tilsatt hver 3-4 dager. Etter en uke ble det numrene til prostaspheres tellet under et mikroskop og data ble presentert som kule tall per 1000 celler sådd. Prostaspheres ble fotografert (40 ×) under et fasekontrastmikroskop.
Vest-blot analyse
Totalt cellelysater ble oppnådd ved å lysere cellene i RIPA buffer. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved å bruke BCA-proteinanalyse (Pierce, Rockford, IL). Western blotting ble utført som tidligere beskrevet [35].
miRNA og transfeksjon
Cellene ble transfektert med 40 nmol /L av la-7 forløpere eller miRNA forløpere negativ kontroll # 1 (Ambion, Austin , Texas) bruker DharmaFECT3 transfeksjon reagens (DHARMACON, Lafayette, CO). Etter en dag med transfeksjon ble cellene trypsonized, og resuspendert i fullstendig medium. Enkeltcellesuspensjoner ble bekreftet under et mikroskop for klonogene analysen. I tillegg, etter 3 dager av transfeksjonen ble cellelysater fremstilt for Western blot-analyse.
luciferase aktivitetsanalyse
PC3 PDGF-D-celler med lavere nivåer av la-7 ble sådd ut ved en tetthet på 6 x 10
3 celler /brønn i en 96-brønnplate og inkubert i 24 timer. Cellene ble co-transfektert med EZH2 3’UTR luciferase plasmid (Origene, Rockville, MD) eller Renilla luciferase plasmid og kontrollere miRNA, la-7a, la-7b, la-7c, og la 7d forløpere hjelp DharmaFECT duo transfeksjon reagens (DHARMACON, Lafayette, CO). Etter 48 timer inkubasjon ble luciferase aktivitet analysert ved hjelp Steady-Glo Luciferase Assay System (Promega). Den Renilla luciferaseaktivitet ble anvendt som en kontroll for transfeksjonseffektivitet.
Sanntids RT-PCR
For bestemmelse av mRNA-nivåer, ble det totale RNA fra celler isolert ved anvendelse av RNeasy Mini Kit (Qiagen ) og DNA ble fjernet ved anvendelse av en RNase-fri NDase kit (Qiagen). En mikrogram av RNA ble revers transkribert til cDNA ved hjelp av en høy kapasitet RNA-til-cDNA Kit (Applied Biosystems, Fostor, CA) i henhold til produsentens anvisninger. PCR ble utført som tidligere beskrevet [18]. Den relative mengde av mRNA ble normalisert til ekspresjon av GAPDH. For testing av miRNA nivåene, ble det totale RNA fra cellene isoleres ved hjelp av miRNeasy Mini Kit (Qiagen), og DNA ble fjernet ved anvendelse av en RNase-fri NDase kit (Qiagen). 20 ng av RNA ble revers transkribert til cDNA ved hjelp av et Universal cDNA Synthesis Kit (Exiqon, Woburn, MA) i henhold til produsentens anvisninger. Real time PCR ble utført ved hjelp av spesifikke miRNA primere (Exiqon) for å kvantifisere miRNA uttrykk ved hjelp SYBR® Grønne RT-PCR reagenser (Applied Biosystems). Den relative mengde av miRNA ble normalisert til ekspresjon av RNU48. For å bestemme mRNA eller miRNA nivåer i prostata kreft pasient vev, ble det totale RNA isolert fra FFPE- vev ved hjelp miRNeasy FFPE Kit (Qiagen) i henhold til produsentens anvisninger. RT-PCR-analyse for miRNA og mRNA-ekspresjon ble bestemt som ovenfor. Den relative mengden av mRNA som var normalisert til ekspresjon av beta-aktin og relativ mengde av miRNA ble normalisert til ekspresjon av RNU1A.
Microarray for miRNA profil i prostatakreftpasientvevet
miRNA microarray samt dataanalyse ble gjennomført etter prosedyrene som tidligere beskrevet av Kong et al [18].
Alle data er MIAME kompatibel og at rådata har blitt deponert i en MIAME kompatibel database. GEO sjonsnummer er GSE34310.
Statistiske metoder
Eksperimenter som presenteres i tallene for cellelinje studiene er representative for tre eller flere uavhengige repetisjoner. Dataene er presentert som gjennomsnitt og standardavvik (SD) i søylediagrammer. Mirna og mRNA-data fra pasient vevsprøve ble log transformert før analyse. Sammenligninger av de kontinuerlige variabler mellom to uavhengige grupper ble gjort ved hjelp av Wilcoxon rank sum test. For sammenkoblede relaterte grupper (dvs. normalt vev og sammenkoblede G6 tumor vev), den Wilcoxon signert rank test ble benyttet. Spearman korrelasjoner ble brukt til å beskrive styrken av lineært forhold mellom to variabler. Statistisk test av betydningen av korrelasjonen var basert på tilnærmes
t
distribusjon. Alle statistiske tester ble to-sidig ved signifikansnivå på 0,05, med mindre annet er angitt. For å redusere falsk positivitet, med andre ord kontrollere familie kloke Type I feil, i denne foreløpige tidlig fase eksplorerende studie, brukte vi justerte p-verdier fra to-trinns step-up falske funnrate (FDR) kontrollerende metode [36] . En nominell feilrate for å estimere antall sanne nullhypotese i to-trinns FDR prosedyren ble satt til 0,05.
Resultater
Uttrykk for den la-7 familie ble tapt i prostatakreft ( PCA) vevsprøver
for å bestemme nivåer av la-7 familie i PCA vevsprøver, samlet vi pre-behandling PCA vev og matchet tilstøtende prøver normalt vev (brukt som kontroll for sammenligning med tumorvev). Resultatene fra miRNA ekspresjon av mircroarray ekspresjonsanalyse viste at alle medlemmer av la-7 familien (MIR-98 var ikke målbart) ble redusert i PCA vev i forhold til tilstøtende normale vevsprøver (Fig. 1A). Videre fant vi at uttrykket av utleid-7a, la-7b, la-7c og la 7d var nøyaktig målbar i forhold til andre familiemedlemmer fordi deres uttrykk var svært lav (Fig. 1a). Derfor har vi bestemt og bekreftet uttrykk for skuffelse 7a, la-7b, la-7c, og la 7d i alle tilfeller inkludert 129 PCA vevsprøver og 94 tilstøtende prøver normalt vev. Vi oppdaget at uttrykket av utleid-7 familie i histologisk normale prostata vev fra Gleason grad 7 eller høyere svulst ble redusert sammenlignet med histologisk normalt vev fra Gleason grade 6 svulster (data ikke vist), noe som tyder på at histologisk normalt vev fra prostata kjertelen hos pasienter med høyere klasse svulster er ikke normalt. Dermed tok vi normalt fra prostata av alle pasienter diagnostisert med karakteren 6 svulster for videre analyse og brukte det som «normalt vev kontroll». Vi observerte at uttrykk for skuffelse 7 familie i klasse 6 svulster er ikke signifikant forskjellig i forhold til normal kontroll. Men vi fant en betydelig redusert uttrykk for la-7a, la-7b, let7c og la 7d ved PCA med Gleason grad 7 eller høyere svulster i forhold til normalt vev kontroll (Fig. 1B). Disse resultatene tyder på at tapet av la-7 familien kan være forbundet med PCa aggressivitet spesielt fordi de lavere grad svulster var ikke forskjellig fra normalt vev kontroll, mens høyere klasse svulster var annerledes.
(A) Microarray profilering ble gjort for å vurdere uttrykk for miRNA hjelp total RNA ekstrahert fra tre PCA vevsprøver og matchet tilstøtende normale prostata vev. Resultatene viste at la-7a, la-7b, la-7c og la-7d ble sterkt uttrykt i prostata vev og deres ekspresjon ble tapt i humane PCA vevsprøver (* P 0,05, ** p 0,01). (B) Resultatene fra sanntid-RT-PCR bekreftet at nivåene av la-7b, la-7c og la 7d signifikant nedregulert i tumorer med høyere Gleason grad. (7a: la-7a, N: normal; TG6: tumor-vev fra pasienter med Gleason grad 6. n = 39 for normal, n = 44 for TG6, n = 52 for TG7, n = 33 for TG8, 9). (C) En betydelig oppregulering av ekspresjonen av EZH2 ble observert i PCA vevsprøver med Gleason grad 7 (n = 46) og høyere (n = 33), men ikke i PCa eksemplarer med Gleason klasse 6 (n = 39) . (D) EZH2 nivåer ble omvendt korrelert med let-7b og la 7c uttrykk i vevsprøver med Gleason grad 7.
Uttrykk for EZH2 ble økt i PCA vevsprøver og ble omvendt korrelert med uttrykket av la-7 familie
Siden uttrykk for la-7 familien gikk tapt i PCA vev av pasienter med høyere Gleason grad, reiser det et spørsmål om hvordan den la-7 familien kunne regulere PCa aggressivitet. Vi har søkt mål av utleid-7 familie ved hjelp TargetScan programvare, og vi fant ut at EZH2 kan bli regulert av skuffelse 7 familien fordi det er en spesifikk bindingssete i 3’UTR av EZH2 mRNA. Dermed har vi vurdert uttrykk for EZH2 mRNA i PCA vev. Våre resultater viste at EZH2 uttrykk ble økt i PCA vevsprøver med Gleason grad 7 og høyere sammenlignet med normalt vev kontroll (Fig. 1C). Uttrykket av la-7b og la 7c ble omvendt korrelert med EZH2 uttrykk med r = -0,36 (95% KI: -0,61 til -0,06), p = 0,0414 og r = -0,43 (95% KI: -0,65 til – 0,15), p = 0,0132, henholdsvis (fig. 1 D). Disse resultatene tyder på at tapet av la-7 kan være ansvarlig for økt uttrykk av EZH2.
La-7 trykt EZH2 uttrykk og hemmet klonogene vekst av PCa celler
Vi har undersøkt uttrykk for EZH2 ved PCA cellelinjer og udødelig prostata epiteliale cellelinjer, og fant at EZH2 ble uttrykt i prostatakreftceller ved relativt høyere nivåer i forhold til udødeliggjorte prostata epiteliale cellelinjer: PZ-HPV-7 og RWPE-1 celler (figur 2A, øvre panel. ). For ytterligere å bestemme den biologiske konsekvensen av la-7 familie ekspresjon i reguleringen av EZH2 uttrykk, transfektert vi PC3 og PC3 PDGD-D-celler med la-7-forløpere, og resultatene viste at la-7 familiemedlemmer kan i betydelig grad hemme ekspresjonen av EZH2 i disse to cellelinjer (fig. 2A, midtre og nedre panel). Disse resultatene tyder på at La-7 familie regulerer ekspresjonen av EZH2. For å oppnå ytterligere mekanisk innsikt, testet vi om la-7 direkte kunne undertrykke ekspresjon av EZH2 ved binding til 3’UTR av EZH2 mRNA. Vi ko-transfektert EZH2 3’UTR luciferase plasmid og la-7-forløpere, og fant at la-7a, 7b-la, la-7c, og la-7b kan sterkt hemme EZH2 3’UTR luciferase-aktivitet sammenlignet med transfeksjon av celler med kontroll miRNA (fig. 2B). Den la-7 bindingsseter i 3’UTR av EZH2 mRNA er vist i figur 2C. Vi testet den biologiske konsekvensen av celler transfektert med pre-la-7 familie og vurderes klonogene vekst som en indirekte
in vitro
mål på tumor aggressivitet. Vi fant at overekspresjon av la-7 familie vesentlig hemmet veksten av klonogene PC3 PDGF-D-celler, som til å begynne viste lavere ekspresjon av la-7 (fig. 2D). Men foreløpig er det ingen metode som kan være klinisk nyttig for oppregulering av tapte miRNAs. For å nå dette målet, har vi testet vår hypotese ved å teste om BR-DIM kan være nyttig for oppregulering av miRNAs.
(A) Uttrykk for EZH2 ble funnet å være høyere i PCA cellelinjer mot udødelig prostata epitelceller linjer: PZ-HPV-7 og RWPE-1 (øvre panel) og transfeksjon av la-7 forløpere hemmet EZH2 uttrykk i PC3 og PC3 PDGF-D-celler 3 dager etter transfeksjon (midtre og nedre panel). (B) la-7 familiemedlemmer trykt EZH2 3’UTR luciferase aktivitet i PC3 PDGF-D-celler (lavere nivåer av la-7 familie i disse cellene) co-transfektert med la-7 og EZH2 3’UTR luciferase plasmid. (C) la-7 bindingsseter i 3’UTR av EZH2 mRNA ble vist. (D) Transfeksjon av la-7 forløpere betydelig redusert klonogene vekstevnen i PC3 PDGF-D-celler (Con: kontroll, 7a: pre-la-7a, ** p 0,01)
BR. -DIM behandling førte til oppregulering av la-7 familie og dermed nedregulert uttrykk for EZH2 i PCA celler
i denne studien fant vi at BR-DIM behandling økt uttrykk av la-7 familie i flere PCA-cellelinjer, inkludert LNCaP, C4-2B og PC3-celler (fig. 3A og fig. S1A-C). Dessuten, BR-DIM behandling førte også til redusert ekspresjon av EZH2 mRNA (fig. 3B) og protein i forskjellige PCA cellelinjer og ved forskjellige tidspunkter (fig. 3C, 3D og fig. S1D). Videre Mer interessant, data fra vår pågående fase II klinisk studie viste at BR-DIM behandling av PCA pasienter før radikal prostatektomi førte til økt uttrykk av la-7a, la-7b, la-7c, og alfa 7d i tumorprøver etter BR-DIM intervensjon (fig. 4A-C), og disse resultatene er i overensstemmelse med redusert ekspresjon av EZH2 (fig. 4D). Derfor våre resultater tyder på at BR-DIM kan være et viktig middel for å re-uttrykke tapte mirnas spesielt la-7 familie, noe som vil redusere nivået av EZH2 uttrykk og kompromiss cscs eller CSLCs funksjon.
( A) Total RNA ble isolert fra LNCaP, C4-2B og PC3 celler behandlet med 25 mikrometer BR-DIM i 24 timer, og resultatene fra real time RT-PCR viser at uttrykket av la-7 ble økt etter BR-DIM behandling sammen til ubehandlet kontroll (c: DMSO-kontroll). (B) Nivåer av EZH2 mRNA ble undertrykt av BR-DIM behandling på en doseavhengig slemmere. (C og D) Cellelysatene ble fremstilt fra celler behandlet med BR-DIM i 48 timer og Western blot som viser proteinnivåer EZH2, som ble nedregulert ved BR-DIM behandling (PC3 PD: PC3 PDGF-D-celler, *, p 0,05; **, p. 0,01)
RNA ble hentet fra BR-DIM intervensjons kliniske studier prøver der BR-DIM ble gitt til pasienter i 2-4 uker før operasjonen . RNA ble også hentet fra formalinfiksert parafin-embedded (FFPE) vevsprøver av PCA pasienter med matchet svulst Gleason grad, tumorstadium og pasientens alder som kontrollgruppe. Uttrykket av miRNAs og mRNA ble vurdert ved hjelp av real time RT-PCR. Relative miRNA og mRNA-nivåer ble normalisert til RNU1A1 og beta-aktin, respektivt. (A) BR-DIM intervensjon førte til økte nivåer av trenden i Let-7a uttrykk. (B og C) la-7b, la-7c og la 7d signifikant oppregulert ved BR-DIM intervensjon. (D) EZH2 uttrykk ble nedregulert av BR-DIM intervensjon.
BR-DIM behandling hemmet selvfornyelse og klonogene kapasitet på PCA celler
For å teste om BR-DIM kunne regulere den selvfornyelse kapasitet og evne klonogene av PCA-celler, utførte vi kule-dannende analyser og funnet at behandling av C4-2B og PC3 PDGF-D-celler med 10 eller 25 uM BR-DIM markert redusert antallet og størrelsen av prostaspheres sammenlignet med ubehandlet kontrollgruppe (DMSO-kontroll) (fig. 5A). Videre BR-DIM behandling også hemmet klonogene vekstevnen i PCA cellelinjer C4-2B og PC3 PDGF-D-celler (fig. 5B). Resultatene fra myk-agar assay viste videre at behandling av C4-2B celler med 10 eller 25 uM BR-DIM redusert kolonistørrelse og antall (Fig. 5C og 5D), noe som tyder på at BR-DIM kan eliminere tumorceller, særlig celler med cscs eller CSLCs egenskaper med opp-regulering la-7 familie og følgelig ved å nedregulere ekspresjon av EZH2.
(A) Enkeltcellesuspensjoner celle~~POS=TRUNC suspen~~POS=TRUNC av C4-2B og PC3 PDGF-D-celler ble sådd ut i ultra lave adherente brønnene i 6-brønnsplate ved 2000 celler /brønn i DMEM /F12 supplert med B27 og N2 og med 10, 25 uM BR-DIM og inkubert i 6 dager. Prostasphere tall ble redusert med BR-DIM behandling (øvre panel).
