Abstract
Dårlig lokal kontroll og tumor rømning er av stor bekymring i hodet-og-hals kreft behandlet med konvensjonell strålebehandling eller hadrontherapy. Redusert glutation (GSH) er mistenkt for å spille en viktig rolle i mekanismer som fører til radioresistance, og dens uttømming bør gjøre det mulig oksidativt stress fornærmelse, for derved å modifisere arten av DNA-lesjoner og de etterfølgende kromosomale endringer som potensielt føre til tumor unnslippe.
Denne studien forsøkte å fremheve betydningen av en GSH-utvinningsstrategi (dimethylfumarate, og l-buthionine sulfoksiminforbindelser forening) kombinert med karbon ion eller røntgenbestråling på typer DNA-skader (sparsom eller gruppert) og den påfølgende overføring av kromosom endringer i avkommet i en radioresistant cellelinje (SQ20B) som uttrykker et høyt endogen GSH-innhold. Resultatene er sammenlignet med de fra et radiosensitive cellelinje (SCC61) som fremviser en lav endogen GSH nivå.
DNA skade målinger (γH2AX /komet assay) viste at en forbigående GSH uttømming i resistente celler SQ20B forsterkes effekten av bestråling ved først å øke sparsom DNA-brudd og oksidative skader etter røntgenbestråling, mens karbon-ion bestråling forbedret kompleksiteten gruppert oksidativ skade. Videre ble rest DNA dobbelttrådbrudd målt uansett stråling kvaliteter. Naturen av de første DNA-lesjoner og mengde rest DNA-skader var lik de som ble observert i følsomme SCC61 celler etter begge typer stråling. Misrepaired eller ureparert lesjoner kan føre til kromosomforandringer, anslått i celle avkom av cytome analysen. Begge typer bestrålingsinduserte avvik i nondepleted motstandsdyktig SQ20B og sensitive SCC61 celler. Den GSH-utvinningsstrategi hindret overføring av avvik (komplekse rearrangementer og kromosom pause eller tap) i radioresistant SQ20B bare når forbundet med karbon ion bestråling. En GSH-nedbrytende strategi kombinert med hadrontherapy kan således ha en betydelig fordel i omsorgen for pasientene, ved å minimere genomisk ustabilitet og bedre lokal kontroll
Citation. Hanot M, Boivin A, Malésys C, Beuve M, Colliaux A, Foray N, et al. (2012) glutation Nedbrytning og Carbon Ion stråling potensere gruppert DNA lesjoner celledød og Forhindre kromosomforandringer i kreftceller avkom. PLoS One 7 (11): e44367. doi: 10,1371 /journal.pone.0044367
Redaktør: Janine Santos, medisinske og odontologiske av New Jersey, USA
mottatt: 03.09.2011; Godkjent: 06.08.2012; Publisert: 20.11.2012
Copyright: © 2012 Hanot et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av ETOILE forskningsprogram gjennom Regional Programme for Research in Hadrontherapy /Lyon universitet under CPER 2007-13 finansiering og Fondation Synergie Lyon kreft og Ligue contre le cancer (Ain). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Carbon ion hadrontherapy er meget effektiv for behandling av kreft lokalisert nær kritiske organer i fare som er motstandsdyktig mot konvensjonell radioterapi, slik som hode-og-hals squamous cell carcinoma (HNSCC), fordi en mer nøyaktig og effektiv dose kan brukes, noe som fører til en høy relativ biologisk effektivitet [1]. Carbon ioner indusere skadelig gruppert skaden består av en kombinasjon av DNA dobbelt og enkelttrådsbrudd (DSB og SSB), og abasic områder i umiddelbar nærhet av oksiderte baser. I motsetning til disse karbon-ion-indusert grupperte lesjoner, røntgen indusere ganske sparsom skader [2]. I begge tilfeller kan misrepaired eller repareres lesjoner føre til kromosomale aberrasjoner [3] – [5]. Noen kromosomale endringer overføres til celle avkom, kan således føre til kreftcelle tilpasning [6] og tumor flukt, den ledende årsaken til radioterapeutiske svikt. Den økende interessen for hadrontherapy for behandling av motstandsdyktige kreftformer krever avklare effekten av komplekse DNA-lesjoner på høyere forekomst av kromosomforandringer (CCS). Identifisere disse prosessene vil derfor være et stort fremskritt i forståelsen av kreft tilbakefall, en velkjent trekk ved radioresistant HNSCC [7] – [10]
DNA-lesjoner og CCS er påvirket av endogene faktorer som reaktiv. oksygen arter scavenging systemer. Et høyt nivå av endogen redusert glutation (GSH) ofte fremmer kreftcelleoverlevelse og motstand [11], og dens uttømming, undersøkt i flere tiår sammen med radioterapi, er sitert i dag for nye terapeutiske betraktninger spesielt for behandling av kreft som er resistente mot konvensjonelle eller karbon ion radioterapi [12] – [15]. Blant andre strategier, kan en GSH-utarming strategi bli brukt som et verktøy for å modulere arten, antallet eller reparasjon av DNA-skade via oksydativt genereres komplekse DNA-skade [16]. Likevel, bare begrenset og motstridende data er tilgjengelig om forholdet mellom GSH nivå og høy lineær energioverføring (LET) og lav-LET stråling-indusert DNA skade. For eksempel, Mansour et al. [17] rapporterte at
N
acetylcysteine, en GSH forløper, beskytter lever vev fra stråling-indusert DNA-lesjoner, mens andre studier antydet en svak beskytter rolle eksogene GSH på DNA-skader i lymfocytter eller CHO-celler [18 ], [19].
studier av cytogenetiske effekter av høy-LET stråling er nyttig for å analysere mekanismene bak tumorcelle radioresistance fordi de reflekterer spesifisitet, kapasitet og kvaliteten til reparasjon eller misrepair prosessene som finner sted i bestrålte celler . De grupperte DNA-lesjoner indusert av karbon ion bestråling er kjent for å føre til svært komplekse kromosomale aberrasjoner ved metafase [3], [5], men lite er kjent om risikoen for deres overføring til kreftcelle avkom, noe som er en potensiell årsak til tumor flukt. Selv om et forhold som forbinder oksidativt stress og genomiske ustabilitet har blitt rapportert [20], [21], data relatert til modulering av antioksidantforsvar (slik som GSH) fremdeles er motstridende. For eksempel, uansett strålekvalitet, en økning i det endogene GSH bassenget kan hemme søsterkromatidutveksling [22], øke utvekslings avvik [19], eller redusere hyppigheten av avvikende metafaser [18]. Sletting er den eneste vanlige typen CC rapportert i tidligere studier som viser at antallet av delesjoner korrelerer inverst med GSH nivå [18], [19], [23], [24]. Selv om stadig flere data er tilgjengelige, med forklaringer eller hypoteser som knytter disse observasjonene til de opprinnelige radioinduced DNA-lesjoner, blir data på reparasjon kapasitet eller risikoen for CC overføring til cellen avkom fortsatt mangler. Bare Pujari et al. [19] har foreslått at høy LET-stråling kombinert med et GSH tilskudd marginalt påvirket kromosomale utveksling frekvens sammenlignet med X-stråler, noe som indikerer at GSH mislyktes i å beskytte celler mot DNA-skade under disse forsøksbetingelser.
Cytogenetiske studier har ofte ført til motstridende data, sannsynligvis på grunn av mangfoldet av metoder som brukes, som estimeres enten tidlige effekter (i metafase eller med premature kromosom kondense teknikker) [4], [18], [25] eller senskader (på avkom) [26], [27]. Måling av de tidlige effekter øker problemet med cellesyklusen forskyvning forårsaket av bestråling, noe som fører til en undervurdering av CCs når data blir samlet ved bare ett tidspunkt og til en mangel på indikasjon om virkningene på overførbare arrangementer [3], [4 ]. Videre kreftcellene viser en svært endret genomet som begrenser observasjoner og målinger av kromosomavvik ved hjelp av FISH-maleteknikker [4]. Måling av senvirkninger gir informasjon om transformasjon eller differensiering i avkom, men utelukker hendelser som oppstår ved første mitose [26], [27]. Således har det vært, opp til nå, om hvilken er ingen klar enighet om den mer relevante metode for å studere risikoen for kromosomale avvik overføring i overlevende celler.
En alternativ fremgangsmåte kan tilveiebringe en kobling av kromosomal ustabilitet mellom disse forskjellige data og refererer til cytokinese-blokken mikronukleus som utvikler seg til en «cytome assay» [28] – [31]. Denne analysen er basert på morfologiske observasjoner av kjerner etter cytokinese blokkering, dvs. celler som har fullført en kjernefysisk divisjon er identifisert av sin binucleated utseende. Den gir informasjon om noen CCs overført til datterceller [32], [33] gjennom mikrokjerne og nucleoplasmic bro formasjon. Dette godt beskrevet analysen er nå ansett som en referanse test for overvåking av menneske cert og muliggjør identifisering av celler som passerer gjennom den første forsinket mitose. Slike overførbare avvik kan indusere genomisk ustabilitet i overlevende celler, som fører til tumor flukt.
Formålet med denne studien var først å bestemme kvaliteten og mengden av DNA-lesjoner i forhold til endogen GSH nivå og stråling kvalitet, og andre å bestemme påfølgende CCs i overlevende kreftceller etter X-ray og karbon ion bestråling for å vurdere risikoen for radioinduced ustabilitet og deretter svulst flukt. En motstandsdyktig HNSCC cellelinje (SQ20B) viser en høy endogen GSH (~70 nmol /mg protein) nivå ble valgt som en modell studie. En forbigående GSH-uttømming strategien ble anvendt før bestråling, basert på bruk av dimethylfumarate (DMF), en glutation nedbrytende middel, og buthionine sulfoksiminforbindelser (BSO), en glutation-inhibitor. Denne strategien har tidligere blitt testet [14] i form av in vitro toksisitet og de aktiverte veier som fører SQ20B celler til døden etter bestråling ble tydelig demonstrert. Det tillot SQ20B celler for å vise den samme følsomhet som SCC61 celler, en radiosensitive HNSCC cellelinje som viser en lav endogen GSH innhold [14], [34]. I denne utredningen, ble data innhentet fra radioresistant SQ20B celler og GSH-utarmet SQ20B celler derfor sammenlignet med sensitive SCC61 celler. Å sammenligne hendelser som førte til et tilsvarende nivå av celledød, røntgen og 75 MeV /n karbon ion bestråling ble brukt på biologisk ekvivalente doser, forutsatt en relativ biologisk effektivitet på ca 2 til 10% overlevelse for begge cellelinjer [34].
til sammen våre resultater fører til en ny forståelse av kvaliteten og antall DNA-lesjoner i forhold til GSH nivå og strålekvalitet og således klargjøre noen avvikende resultater er rapportert i litteraturen. I denne forbindelse, cytome analysen ga en klar oversikt over kromosomavvik overføres i de overlevende kreftceller. Det aktivert påstanden om at en økning av DNA-lesjon kompleksiteten oppnådd ved GSH-uttømming adjuvant terapi i kombinasjon med hadrontherapy kan redusere genomiske ustabilitet i resistente kreftceller og derved redusere fenomenet tumor flukt etter strålebehandling.
Materialer og Metoder
Cell Kultur og behandlinger
SCC61 (SF2 = 0,36) og SQ20B (SF = 0,72) cellelinjer ble dyrket som beskrevet tidligere [34]. Cellene ble dyrket i mer enn 12 passeringer. Dimethylfumarate (DMF, 100 uM), en GSH nedbrytende middel, og l-buthionine sulfoksiminforbindelser (BSO, 100 uM), en inhibitor av GSH-biosyntesen, ble tilsatt til SQ20B kulturmediet 4 timer før bestråling for å utarme GSH, slik som beskrevet tidligere [14]. I noen eksperimenter,
N
acetyl cystein (NaCl, 5 mM) ble også tilsatt til kulturmediet i 4 timer før bestråling og i kombinasjon med DMF /BSO behandling.
Chemicals
Primær γH2AX og centromeric protein A (CENPA) muse-antistoffer ble oppnådd fra henholdsvis Upstate og Abcam, og det sekundære antistoff AlexaFluor 488 geit-anti-mus IgG ble oppnådd fra Invitrogen. Antifade montering medium ble kjøpt fra Dako. Lavt smeltepunkt agarose og SYBR grønn løsning var fra Sigma, og den Formamidopyrimidin glykosylase (Fpg) ble oppnådd fra Trevigen.
Bestrålings Procedures
monolag av dyrkede celler ble bestrålt som beskrevet tidligere [35 ]: X-ray bestråling med 6 MV ble utført i Lyon-Sud Hospital (Strålebehandling Department), Frankrike, på en Clinac CD irradiator ved en dose på 2 Gy /min. Bestråling med 72 MeV /u karbonioner (LET 33,6 keV /μ) ble utført ved GANIL, Caen, Frankrike.
Analyse av klonogene Cell Survival
klonogene celle overlevelse ble overvåket etter X-ray og karbon-ion eksponering i doser fra 1 til 5 Gy. Cellene ble sådd ut før bestråling og reseeded umiddelbart etter eksponering inn i kolber på 25 cm
2 ved forskjellige konsentrasjoner. Celleoverlevelse ble bedømt ved standard kolonidannelse analyse som beskrevet i [35].
HPLC-analyse
Total glutation ble kvantifisert ved HPLC-analyse. Kort, proteiner ble utfelt fra mobil homogenat med sulfosalisylsyre og sentrifugert ved 13.000 x
g
. Supernatanten ble deretter derivatisert med
o
-phthalaldehyde. Kromatografisk separasjon ble oppnådd på en Spherisorb 5 um C18-kolonne med en mobil fase bestående av metanol og 0,15 M acetat-buffer pH 7 (7.5:92.5). Fluorescens av glutathione-
o
-phthalaldehyde derivater ble oppdaget ved en emisjon bølgelengde på 420 nm og en eksitasjon ved 340 nm [36].
immunfluorescens
Påvisning av γH2AX foci eller CENPA ble analysert ved immunhistokjemi. I korthet ble cellene fiksert i 3% paraformaldehyd i 20 minutter, og immundeteksjon ble utført som beskrevet [37]. Den CENPA påvisning ble utført med cytome analysen beskrevet nedenfor. Digitale bilder ble oppnådd ved hjelp av et fluorescerende mikroskop (Axio Imager Z1 Zeiss mikroskop, 400 × forstørrelse). Et minimum av 100 kjerner ble scoret hver gang for å beregne gjennomsnittlig antall γH2AX foci hjelp ImageJ programvare.
Enkelt DNA lesjon Detection med alkaliske encellede Gel elektroforese (SCGE)
Celler ble trypsinert, sentrifugert ved 1000 rpm ved 4 ° C, og pelleten ble suspendert i frysemedium (10% DMSO, 40% DMEM, 50% SVF) og lagret ved -80 ° C. Etter tining, ble prøvene sentrifugert (1000 rpm, 4 ° C), og pelleten ble suspendert i kald PBS og blandet med 0,6% lavt smeltepunkt agarose. Geler ble spredd på objektglass og SCGE teknikken ble anvendt som beskrevet av Tice et al. [38]. Presentasjoner beregnet for oksydert DNA-base målinger ble vasket med enzymet buffer (0,1 M KCl, 10 mM EDTA, 10 mM HEPES-KOH, 0,02 mg /ml BSA, pH 7,4) og inkubert i 20 min (37 ° C) med Fpg i enzymet buffer eller med buffer alene. Alle snittene ble deretter inkubert i 40 minutter i en alkalisk elektroforese buffer (pH 13) for å indusere DNA-avkobling. Elektroforese ble utført i den samme buffer i 35 min ved 25 V /300 mA ved 4 ° C. Platene ble skyllet med 400 mM Tris-base (pH 7,5) for å nøytralisere overskuddet av alkali. Etter farging med SYBR Grønn løsning, ble kjerner «kometer» vises på Zeiss mikroskop. Til sammen 100 kometer ble observert visuelt og scoret på hvert lysbilde ved hjelp av gratis CASP programvare. Halen intensitet, definert som andelen av DNA migrere fra leder av kometen i halen, ble målt for hver scoret kjernen.
Cell Cycle Analysis
propidiumjodid (PI) farging var brukes til å analysere cellesyklusfordeling, som tidligere beskrevet [34]. I korthet ble cellene fiksert med 70% etanol, ble inkubert med 5 pg /ml PI (Sigma-Aldrich) og 0,5 mg /ml RNase A (Sigma-Aldrich), og deretter analysert ved hjelp av et FACScan strømningscytometer.
Cytome analyse: Mikrokjerner (MN) og kromosom rearrangements
multiendpoint cytokinese-blokkert mikronukleus ble brukt for å vurdere kromosomavvik [32]. Cytochalasin B (5 ug /ml) ble tilsatt til kulturmediet for å blokkere cytokinese og samle cellene som hadde fullført den første atom divisjon. Det er ingen binucleated celler er nummerert i 5 timer etter tilsetning av cytokalasin B. Konsentrasjonen velges som antydet ovenfor viste de høyeste frekvenser av binucleated celler i kontrollene (95%, 28 timer etter tilsetning av cytokalasin B) og hadde ingen innvirkning på nivået av spontant forekommende MN eller nucleoplasmic broer. Cytochalasin B ble tilsatt 4 t før bestråling for å kumulere de mest representative cellepopulasjon på en binucleated scene 24 timer senere. Celler ble fiksert i 3% paraformaldehyd og farvet med DAPI (5 ug /ml). I disse eksperimentene ble forskjellige endepunkter vurdert: binucleated celler med MN, cent-positive MN, nucleoplasmic broer (NPB), og celler med samtidig NPB og MN (NPB + MN) [28], [39], [30]. Disse markørene er beskrevet her i stigende rekkefølge av kompleksitet.
Celler med MN. Disse cellene er karakterisert ved nærvær av både en hovedkjerne og en eller flere små kjerner kalles MN. Frekvensen av MN i cellepopulasjonen er utbyttet av Mn (Ymn), som er beregnet som: hvor MN1 er antall celler med en mikrokjerne, MN2 antall celler med to MN, mnn antall celler med n MN og BN er det totale antall binucleated celler. Tilstedeværelsen av MN indikerer tapet av kromosomfragmenter som samsvarer med asentrisk kromosom /kromatid som følge av unrepaired DNA brekkasje arrangementer. I motsetning til dette, MN inneholdende en eller flere sentromerer (immunpåvist som CENPA) indikerer kromatid /kromosom tap. Forholdet mellom cent-positive mikrokjerner (c + MN) ble beregnet som prosentandelen av celler med binucleated c + MN.
Celler med NPB. NPB er kontinuerlige DNA-holdige strukturer som knytter kjernen i en binucleated celle. NPB stammer fra disentrisk kromosomer der sentromerer er trukket til motsatte poler under anaphase og er derfor representativ for misrepaired DNA, kromosom omorganisering eller telomer-end fusjon.
Celler med samtidig uttrykk for NPB og MN. Uttrykket av NPB + MN i delt celler oppstår fra break-fusion-break sykluser, og representerer en svært kompleks omorganisering.
Alle scoring kriterier ble brukt i henhold til de morfologiske parametere beskrevet av Fenech [33].
Statistical Analysis
dataene fra minst tre uavhengige eksperimenter er presentert som gjennomsnittet og standardavviket. Dataene ble analysert ved hjelp av Student
t
test.
P
. 0,05 sammenlignet med kontrollgruppen tilstanden ble betraktet som signifikant
Resultater
Effekter av DMF /BSO Kombinert med Bestråling på Endogen GSH nivåer av SQ20B Cells
i det første sett av eksperimenter (tabell 1 A), har vi kvantifisert totale GSH-innholdet i SQ20B celler behandlet under forskjellige betingelser. Når de brukes i kombinasjon, DMF og BSO behandlingen resulterte i total GSH uttømming etter fire timers inkubering med en langsom gjenopprettelse av GSH-nivå ved 24 timer. En 4 timer DMF /BSO forbehandling kombinert med røntgen eller karbon ion eksponering aktivert stabilisering av GSH uttømming og inhiberingen av glutation resyntese indusert etter bestråling (tabell 1B). Ingen betydelige variasjoner av oksidert glutation ble oppdaget under vårt eksperimentelle forhold (data ikke vist). Denne protokollen ble derfor ansett som optimalt å effektivt og forbigående utarme SQ20B GSH butikker.
klonogene Cell Survival
Resultatene for klonogene celle overlevelse i radiosensitive SCC61 og radioresistant SQ20B cellelinjer etter røntgen eller karbon ion bestråling er vist i fig. 1. Eksponeringen for karbonioner resulterte i en lavere overlevende brøkdel sammenlignet med røntgenstråler i begge cellelinjer. Overlevelsesfraksjon på 2 Gy (SF2) var 0,81 (røntgen) og 0,33 (karbonioner) for SQ20B celler og 0,34 (røntgen) og 0,12 (karbonioner) for SCC61 celler. SQ20B celler ble systematisk mer motstandsdyktig enn SCC61 celler, selv i respons til karbonioner. Den relative biologiske effektivitet på 10% overlevelse nivået var 2,1 for SQ20B celler og 1,9 for SCC61 celler. I nærvær av DMF /BSO, bestrålingssensibilisering av resistente celler SQ20B oppstått, og den resulterende SF2 (0,28 for X-stråler og 0,19 for karbonioner) ble funnet å være lik den som er målt i den ubehandlede følsomme SCC61 cellelinje. En slik bestrålingssensibilisering ble reversert i nærvær av fem mikrometer NaCl, en svært kraftig antioksidant agent, som dokumentert av SF2 verdien (0,84) av behandlede SQ20B celler etter røntgenbestråling.
SQ20B, DMF /BSO ( TTT) -behandlet SQ20B, og SCC61 celler ble eksponert for røntgenstråling (A) eller karbon ion stråling (B). Den motsatte effekten fra NAC over glutation uttømming behandlingen ble evaluert av coincubating DMF /BSO (TTT) -behandlet SQ20B med 5 mM av
N
acetyl cystein (NAC) (SQ20B + TTT + NaCl) før X- ray stråling.
DNA DSB Analyse av γH2AX analysen
Vi har evaluert første effektivisere DSB reparasjon i henhold til kinetikk γH2AX foci. Som vist på fig. 2
A
, den første toppen av γH2AX foci per celle etter X-ray bestråling var lik i både radioresistant SQ20B (31,3 ± 1,0) cellelinje som viser det høyeste nivået av endogent GSH og radiosensitive SCC61 (30,8 ± 2,4) cellelinje, og dermed tyder på at GSH innhold ikke innvirkning på utbyttet av DSB etter røntgenbestråling. Men kinetikken reparasjon forskjellig: reparasjon var tregere i de følsomme SCC61 celler og resulterte i en opphopning av rest DSB (8 foci /kjerne) 24 timer etter bestråling. Etter karbon ion eksponering (fig. 2
B
), maksimalt antall γH2AX foci per celle var lavere enn etter røntgenbestråling (19 ± 0,7 og 22,2 ± 0,3 for SQ20B og SCC61 cellelinjer, henholdsvis) . I motsetning til den røntgenbestråling respons, reparasjonskinetikken var like i de to cellelinjene. Til slutt, antallet av gjenværende γH2AX foci målt på sensitive celler 24 timer etter carbon ion eksponering var ekvivalent med det som ble observert etter den biologiske isodose av røntgenstråler (7,7 ± 0,6 foci /nucleus), mens ingen gjenværende DSB ble målt i resistente celler etter begge typer bestråling.
Cellene ble bestrålt med 2 Gy av røntgenstråler (A, C) eller en Gy karbonioner (B, D). ▴ SQ20B celler, ▵ SQ20B + bestråling, • SQ20B + GSH utarming, • SQ20B + GSH utarming + bestråling, □ SCC61 + bestråling. I panelene C og D, den motsatte effekten av
N
-acetyl cystein i nærvær av DMF /BSO behandling ble analysert. Ett hundre celler ble bedømt for hver gang, og målingene ble foretatt i triplikat, og gjentatt tre ganger. *
P
. 0,05
tappe intracellulære GSH nivået i SQ20B celler ved DMF /BSO behandling ikke føre til noen betydelig variasjon i spontan DSB beløp sammenlignet med kontrollceller ( 0 til 5 foci) i løpet av tidsforløpet studeres, mens kombinasjonen med røntgen eller karbon ion bestråling betydelig påvirket den cellulære respons. Antallet foki γH2AX økt betraktelig (
P
0,05) 30 minutter etter røntgenbestråling (42,3 ± 2,3 foci versus 31,3 ± 1,0 i bestrålte SQ20B celler) og reparasjonskinetikk ble deretter langsommere enn de som ble observert i bestrålte, men ubehandlede SQ20B celler. Økningen i antallet innledende DNA-lesjoner førte til gjenværende DSB (9,7 ± 1,5 foci) ved 24 timer, et nivå lik den som er målt i følsomme SCC61 celler. Interessant, etter carbon ion eksponering, responsen av GSH-utarmet SQ20B celler passet perfekt at av bestrålte SCC61 celler i forhold til den første DNA-skade, reparasjon kinetikk, og rest DSB. Disse resultater indikerer at uttømming av det endogene GSH bassenget i resistente celler kombinert med røntgen eller karbon ion eksponering ved en biologisk ekvivalent dose førte til utholdenhet av DNA-lesjoner på et nivå tilsvarende den i de følsomme SCC61 cellene.
for å bekrefte rollen redoks endringer på DNA-skade, inkuberes vi SQ20B celler med NaCl. Under disse eksperimentelle forhold, gjorde NaCl ikke indusere γH2AX foci i kontrollforsøk (Fig. 2 C og D). I nærvær av DMF /BSO behandling og NaCl tilsatt 4 timer før bestråling, de γH2AX Målingene viste at nivået av DSB og kinetikken for reparasjon kamp med bestrålte, men ubehandlede, SQ20B celler, for begge typer av bestråling. NaCl kan dermed reversere effekten av GSH uttømming.
Enkelttrådbrudd og oksidativt DNA-lesjoner målt ved SCGE analysen
Nivået av alkali-labile områder og SSB i DNA ble undersøkt ved hjelp av SCGE analyse. Som vist på fig. 3
En
, følsom SCC61 og resistente SQ20B cellelinjer vises tydelig distinkte reaksjoner i form av radioinduced SSB. Ikke noe signal ble oppnådd fra SQ20B celler i løpet av tiden undersøkt med begge typer av bestråling. I motsetning SCC61 celler var svært følsomme og viste en høy grad av pauser på de korteste tider etter bestråling. Rask reparasjon skjedde etter røntgenbildet, som vist ved avtagende antall brudd over tid. Selv om carbon ion bestråling induseres en tilsvarende første andel av hale-DNA, sammenlignet med røntgenbestråling, reparasjon kinetikken i SCC61 cellene var betydelig langsommere og viste en vedvarende økning opp til 2 timer fulgt av en minskning i lengre tid. Interessant, GSH-utarmet SQ20B celler viste et lignende mønster som ble observert for SCC61 celler og hastigheten var lik etter eksponering for begge typer stråling. Dette tyder på at høye endogene GSH nivåer beskytte DNA mot stråling i SQ20B celler. I et andre sett av eksperimenter ble andelen av hale-DNA identifiseres ved hjelp SCGE alene subtrahert fra det som ble oppnådd etter behandling med FPG enzymet for å studere den romlige fordelingen av oksyderte baser. Resultatene er vist i fig. 3
B
indikerer at i SQ20B celler, gjorde røntgen eller karbon ion bestråling ikke modifisere oksydasjon av DNA-baser sammenlignet med kontroller. Imidlertid GSH-utarmet SQ20B celler vises mer spredt oksidativ skade på kortest mulig tid etter røntgenbestråling, mens en mindre varierende mønster av skade etter eksponering for karbonioner foreslo lokal produksjon av frie radikaler.
Midlere prosent av DNA-skader i SCC61, SQ20B, og DMF /BSO (TTT) -behandlet SQ20B cellelinjer etter 10 Gy av X-ray eller 5 Gy av karbon ion eksponering. Comet analyser ble utført på alkaliske betingelser uten (A) eller i nærvær av Fpg enzym (B). ▵ SQ20B celler, ▴SQ20B + bestråling, • SQ20B + GSH lytter, ○ SQ20B + GSH utarming + bestråling ▪ SCC61, □ SCC61 + bestråling. *
P
. 0,05
Radioinduced G2 /M fase Arrest og akkumulering av celler i under G1 fasen etter Cell Cycle Analysis
For å avgjøre til hvilken grad GSH uttømming og den gjenværende DSB kan påvirke cellulær respons overfor røntgen eller karbon ion bestråling gjennom cellesyklus omfordeling, det relative antall SCC61, SQ20B, og GSH-utarmet SQ20B celler i sub-G1 (fig. 4
A
) og G2 /M (fig. 4
B
) faser ble analysert ved flowcytometri. De følsomme SCC61 celler raskt gjennomgikk apoptose (ca. 32% av sub-G1-celler etter 48 timer, økende til 68% ved 120 timer). I motsetning til dette ble ingen betydelig grad av apoptose målt i SQ20B celler etter begge typer bestråling. I stedet, ble opp til 55% av SQ20B celler arrestert i G2 /M sjekkpunktet etter 24 timer etter begge typer av bestråling, og disse cellene reentered cellesyklusen etter 48 timer. GSH uttømming av SQ20B celler økte G2 /M fase arrest, hvoretter cellene ble frigjort og ført tilbake til basalnivået bare 72 timer etter bestråling. Den tilbakefall av G2 /M arrest korrelert med økningen i andelen av apoptotiske celler etter røntgenbestråling (55% maksimal). Denne økningen var litt forsinket (96 h) etter eksponering karbon men nådd samme nivå på 120 timer. Disse data indikerer at nedbrytning av endogene pool av GSH påvirker den andel av celler arrestert i G2 /M sjekkpunktet i kultur og dets varighet i forhold til strålingskvaliteten.
SCC61, SQ20B, og DMF /BSO ( TTT) behandlede SQ20B celler ble eksponert for røntgenstråler eller karbon ion stråling. (A) Prosentandelen av celler i sub-G1 fase. (B) Den prosentandelen av celler i G2 /M-fasen. ▴ SQ20B celler, ▵ SQ20B + 5 Gy karbon ion stråling, ▵ SQ20B + 10 Gy røntgen, • SQ20B + GSH lytter, ○ SQ20B + GSH uttømming + 5 Gy karbon ion stråling, ○ SQ20B + GSH-uttømming + 10 Gy X -rays, ▪ SCC61, □ SCC61 + 5 Gy karbon ion stråling □ SCC61 + 10 Gy røntgenstråler. *
P
. 0,05
mikronuklei Målinger påvises ved å bruke Cytome analysen
repareres eller misrepaired DNA-skade kan føre til kromosomendringer overlevende kreftceller. Dannelsen av MN, som inneholder et fragment av et kromosom /kromatid, kan være knyttet til ureparerte DSB, således reflekterer en defekt i reparasjon. Utbyttet av MN ble estimert ved å beregne Ymn verdi. Som vist på fig. 5
A
, de Ymn verdier etter eksponering for røntgen og karbon-ion bestråling er korrelert med celleradiosensitiviteten. Mer MN ble produsert i sensitive SCC61 sammenlignet med SQ20B celler etter begge typer bestråling. Den maksimale avkastning i SCC61 celler var ikke signifikant forskjellig mellom de to typer stråling (2,1 ± 0,3 etter røntgenbestråling og 1,68 ± 0,3 etter karbon ion bestråling). Den maksimale verdien ble litt forsinket etter at karbon ion bestråling (96 h), et tidspunkt som tilsvarer utløsning av apoptose, som beskrevet ovenfor. I motsetning til dette, har utbyttet av MN indusert i resistente celler SQ20B ikke overstige 0,75, og var den samme for begge typer av bestråling. Selv om bestrålingssensibilisering av SQ20B cellene gjennom GSH uttømming førte til rest DSB identiske med de som ble observert i SCC61 celler etter bestråling, det gjorde ikke indusere samme mønster av MN. De Ymn verdiene målt i GSH-utarmet SQ20B var lik de i undepleted SQ20B celler etter X-bestråling (unntatt ved 120 timer etter bestråling), men var lavere etter carbon ion eksponering for de fleste av de kinetiske tidspunkter. Til slutt, bare karbon ion bestråling indusert en åpenbar nedgang i antall radioinduced MN i GSH-utarmet SQ20B celler.
Utbytte av mikrokjerner (A) og cent-positive mikrokjerner (B) i SCC61, SQ20B, og DMF /BSO (TTT) -behandlet SQ20B cellelinjer etter 10 Gy av X-ray eller 5 Gy av karbon ion bestråling. *
P
. 0,05
I et annet sett av eksperimenter, ble kromosom /kromatid tap (identifisert som cent-positive MN, c + MN) beregnet (Fig. 5
B
). Prosentandelen av celler med c + MN var lav etter røntgenbestråling og skilte seg ikke mellom sensitive og resistente celler (maks ~4% til 5%). Som vist på fig.
