Abstract
diffuse store B-celle lymfom (DLBCL) er preget av stor genetisk og klinisk heterogenitet som kompliserer prognostisk prediksjon og påvirker behandlingseffekten. Den vanligste diett, R-CHOP, består av en kombinasjon av anthracycline- og immunbaserte legemidler inkludert Rituximab. Det gjenstår unnvikende hvordan og i hvilken grad genetisk variasjon påvirker respons og potensial toleranse til R-CHOP. Derfor er en bedre forståelse av mekanismene som fører til narkotika toleranse i B-celler avgjørende, og modellering av genetisk innblanding direkte i B-celler er grunnleggende i slike undersøkelser. Lentivirus-baserte genvektorer er mye brukt genet kjøretøyer, som i B-celler er et attraktivt alternativ til potensielt toksiske transfeksjons-baserte metoder. Her undersøker vi bruken av VSV-G-pseudotyped lentiviral vektorer i B-celler for å utforske effekten av microRNAs på toleranse for Rituximab. Spesielt finner vi at robust lentiviral transduksjon av kreft B-cellelinjer markert og spesielt øker motstanden av transduced Germinal senter B-celler (GCBs) til Rituximab. Selv om Rituximab fungerer delvis gjennom komplement-mediert cellelyse, er økt toleranse ikke oppnås gjennom effektene av lentiviral transduksjon på celledød mediert av komplement. Snarere reduserte nivåer av PARP1 og vedvarende høye nivåer av CD43 i rituximab-behandlede GCBs demonstrere anti-apoptotiske virkninger av lentiviral transduksjon som kan forstyrre med utfallet og tolkning av rituximab toleransestudier. Våre funn understreker at det bør utvises forsiktighet utnytte lentiviral vektorer i studier av toleranse for terapi i DLBCL. Viktigere er imidlertid demonstrere vi muligheten for å bruke den lentiviral genet leveranseplattform i studier adressering effekten av spesifikke microRNAs på Rituximab respons
Citation. Ranjbar B, Krogh LB, Laursen MB, Primo MN, Marques SC, Dybkær K, et al. (2016) antiapoptotisk Effekter av Lentiviral Vector Transduksjon fremme økt Rituximab Toleranse i Kreft B-celler. PLoS ONE 11 (4): e0153069. doi: 10,1371 /journal.pone.0153069
Redaktør: Kristy L. Richards, Cornell University, USA
mottatt: 24 november 2015; Godkjent: 23 mars 2016; Publisert: 05.04.2016
Copyright: © 2016 Ranjbar et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Agnes og Poul Friis Fond; Aase og Ejnar Danielsens Fond; Frits, Georg og Marie Cecilie Gluds Legat; Else og Mogens Wedell-Wedellsborgs Fond; Civil Frode V. Nyegaard og hustrus Fond; Arvid Nilssons Fond; Fabrikant Ejnar Willumsens Legat. All mottatt av J. G. Mikkelsen. PhD mobilitet fellesskap fra Aarhus Universitet mottatt av B. Ranjbar
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
diffuse store B-celle lymfom. (DLBCL) er den vanligste typen av non-Hodgkin lymfom hos voksne med en 5-års total overlevelsesrate på 60%, noe som illustrerer at noen pasienter er enten ikke svarer til dagens behandling eller utvikle resistens under behandling. DLBCL er både klinisk og molekylært en heterogen sykdom. Den største undertype er definert som DLBCL, ikke ellers spesifisert (DLBCL, NOS), som ved gen-ekspresjon profilering kan deles inn i følgende molekylære undergrupper: (i) germinal senter B-celle (GCB) DLBCL og (ii) aktivert B -celle (ABC) DLBCL, [1-3]. De to molekylære undergrupper GCB og ABC varierer i signalveien defekter, genetiske avvik, og patogenesen [1,4-6]. Overlevelsesutfall også forskjellig, så GCB pasienter har en høyere 5-års overlevelse på 69-79% sammenlignet med 52-53% for de med ABC DLBCL ved behandling med en standard immun- og antracyklinbasert multidrug kjemoterapi, kjent som R -CHOP, bestående av Rituximab (R), cyklofosfamid (C), doksorubicin (H), vinkristin (O), og prednison (P) [7]. Videre utvikler omtrent en tredjedel av DLBCL pasienter residiverende /refraktær sykdom. Således oppdagelse av nye biologiske markører og terapeutiske midler samt strategier for å overvinne resistens forbli hovedutfordringene for å tilby forbedret behandling for pasienter som DLBCL.
Rituximab er den første FDA-godkjente antistoff som skal brukes i behandling av DLBCL . Rituximab rettet mot CD20-molekyler på overflaten av pre-B-celler, og mer differensierte B-celler stadier [8]. CD20 er et differensiering-spesifikt celleoverflateantigenet, som er til stede på B-celle-overflate fra tidlige stadier av B-celle utviklingen til post-germinale modningstrinn, men ikke på overflaten av modne plasmaceller [8]. Molekylet er involvert i aktivering og proliferasjon av B-celler, og er antatt å være en del av en celleoverflate-kompleks som er involvert i kalsiumtransport, selv om den ligand for CD20 fremdeles uidentifisert [8]. Har forskjellige virkningsmekanismer har blitt beskrevet for Rituximab, inkludert komplementavhengig celle cytotoksisitet (CDC), antistoff-avhengig celle-mediert cytotoksisitet (ADCC), og direkte induksjon av celledød ved apoptose [8,9]. Imidlertid, til tross for fordelene ved Rituximab, forblir medikamentresistens en utfordring for effektiv og langvarig behandling. Flere mekanismer som fører til Rituximab toleranse er blitt beskrevet; Disse inkluderer nedregulering av CD20 ekspresjon [10-12], nedregulering av apoptose-proteiner som er involvert Bak og Bax [13], og inhibering av p38 MAPK-aktivitet [14], som nylig gjennomgått av Pérez-Callejo og kollegaer [15]. I tillegg microRNAs (mirnas) antas å bidra til den medikamentrespons og potensielt motstand gjennom deres evne til å modulere ekspresjon av proteiner med viktige signaltransduksjonsveier [16-18].
mirnas er liten (ca. 20 nukleotider ) ikke-kodende RNA som post-transcriptionally regulerer genekspresjon via RNA interferens vei [19]. Disse RNA-molekyler, uttrykt fra RNApolII- eller RNApolIII-transkriberte gener i genomet, blir behandlet både i kjernen og, etter atom eksport, i cytoplasma. Som en del av RNA-induced Slå kompleks (RISC), modne mirnas gløding å gjenkjenningsseter i mål mRNA og megle mRNA degradering eller translasjonsforskning undertrykkelse [20,21]. Samspillet mellom miRNA og mRNA er basert på baseparing, men fullstendig match mellom de to molekyler er ikke nødvendig for miRNA funksjon. Følgelig har en enkelt miRNA potensialet til målet og regulere mange forskjellige mRNAer, mens en spesifikk mRNA kan bli målrettet ved et sett av forskjellige miRNAs. Dette skaper et nettverk av genet regulatoriske interaksjoner og antyder at mirnas spille en buffer rolle i genregulering med et visst potensiale redundans mellom miRNAs. Vurderer disse aktivitetene, mirnas er kritiske spillere i mange cellulære og utviklingsveier og bistå i å regulere grunnleggende cellulære egenskaper, inkludert differensiering, proliferasjon, apoptose, og homeostase. Det er velkjent at miRNA reguleringen påvirker kreftutvikling og progresjon [22], og mirnas kan tjene enten som tumor-suppressorer eller onkogener basert på deres mål-gen (e) å assistere i undertrykkelse og markedsføring, henholdsvis, av kreft vekst og progresjon [23 -26].
Globalt miRNA uttrykk profilering studier har avdekket tydelige miRNA signaturer for ulike DLBCL undergrupper, noe som tyder på at B-celle kreft kan klassifiseres på grunnlag av miRNA uttrykket profiler [27]. Gitt slike forskjeller i miRNA signaturer, kan spesifikke undergrupper av mirnas bli identifisert som potensielle prognostiske og prediktive biomarkører for sykdomsutvikling og behandling, henholdsvis. Som et eksempel, ble høy ekspresjon av MIR-155 befinner seg i en klinisk datasett for å være assosiert med svikt i R-CHOP behandling [27]. En fersk systematisk undersøkelse av studier som fokuserer på miRNA uttrykket i DLBCL identifisert totalt 30 mirnas assosiert med pasientenes prognose [28]. Spesielt, bare et relativt lite antall miRNAs har blitt identifisert i flere uavhengige studier som støtter forestillingen om at avvik kan forekomme på grunn av den ekstreme regulatoriske kompleksiteten og eksistensen av stort sett uidentifiserte nettverk av samarbeidende miRNAs. Videre har det vist seg at MIR-224, kan påvirke effektiviteten Rituximab via regulering av mål-genet som koder for CD59, som indikerer sannsynlige rolle mirnas i utviklingen av resistens til Rituximab [29]. En fersk studie antydet at MIR-199A og MIR-497 føre til økt følsomhet for Rituximab og andre kjemoterapeutika, bidrar til bedre total overlevelse i DLBCL [30].
Globalt analyser av kliniske prøver ved hjelp av arraybaserte teknologier eller neste -generasjons sekvensering er kraftige tilnærminger, som har ført til identifisering av molekylære prediktorer, inkludert mirnas, av DLBCL overlevelse og prognose [31,32]. Det er imidlertid viktig, for å modellere miRNA funksjon i B-celler og etablere en plattform for å studere miRNA nettverk og deres betydning for medikamentrespons og utvikling av potensielle medikamenttoleranse. Molekyl manipulering i B-celler er komplisert ved det faktum at disse cellene er vanskelig å transfektere med plasmid DNA og syntetisert eller
in vitro
-transcribed RNA, og at transfeksjon ved kjemisk behandling eller elektroporasjon kan være ledsaget av betydelig toksisitet og celledød. Virus-baserte genoverføring, men representerer en alternativ strategi for å modellere miRNA funksjon i B-celler. I denne studien undersøkte vi bruken av vesikulær stomatitt viruset glykoprotein G (VSV-G) -pseudotyped lentiviral vektorer i B-celler for å studere virkningen av miRNAs på følsomheten av kreft B-celler til Rituximab. Spesielt, viser vi at transduksjon av GCB-type B-celler med standard lentivirale vektorer fører til økt toleranse til Rituximab, og at anti-apoptotiske faktorer induseres ved å behandle cellene med lentivirale vektorer. Til tross for disse effektene av lentiviral vektor transduksjon av B-celler, viser vi muligheten for dette genet leveranseplattform i studier som tar for seg viktigheten av spesifikke miRNAs i forhold til Rituximab respons.
Materialer og metoder
cellelinjer
Seks DLBCL cellelinjene ble brukt for dose-respons-analyser. NU-DHL-en og SU-DHL-5 ble kjøpt fra DSMZ (tysk Samling av mikroorganismer og cellekulturer). Farage [33], OCI-Ly-7 [34], RIVA [35], og SU-DHL-8 [36] ble vennlig levert av Dr. Jose A. Martinez-Climent (Molecular Oncology Laboratory, University of Navarra, Pamplona , Spania). Alle celler ble dyrket ved 37 ° C med 5% CO
2. DLBCL linjer ble sådd i RPMI1640 (Lonza, Basel, Sveits) supplert med 10% FBS, 1% glutamin og 1% penicillin /streptomycin. HEK-293T-celler ble utsådd i DMEM (Lonza, Basel, Sveits) som inneholdt 5% FBS og 1% penicillin /streptomycin. Identiteten av cellelinjene ble verifisert ved DNA-strekkoding, slik som tidligere beskrevet [37].
Vector konstruksjon
En standard lentivirale miRNA ekspresjonsvektor (PLV /miRCS-PE), som bærer en miRNA kloningssetet (miRCS) for innsetting av PCR-amplifiserte miRNA sekvenser, ble opprettet ved kloning U1 uttrykk kassett som inneholder en intern kloningssete (U1-MCS-U1terminator) i lentiviral vektor plasmid PLV /PGK-EGFP [38], som inneholder PGK-EGFP (PE) ekspresjonskassett. Å tillate innføring av NotI-fordøyd fragmenter nedstrøms fra U1 promoter, ble en Bsp120I restriksjonssete innført mellom U1 promotor og U1 terminator. Genomiske DNA-sekvenser som koder for de forskjellige studerte mirnas ble PCR-amplifisert fra humant genomisk DNA isolert fra HeLa-celler og klonet inn i Bsp120I-spaltet PLV /miRCS-PE. Studerte mirnas og primere som brukes for PCR forsterkning er gitt i S1 tabell.
Analyse av miRNA funksjon
For funksjonelle studier av klonede miRNA varianter, individuelle mål sekvenser ble smeltet til Rluc reporter genet ved innføring av glødet oligonukleotider inneholdende target-sekvensen inn i Notl /XhoI-spaltet psiCHECK-2-vektor (Promega, Madison, WI, USA), som beskrevet tidligere [39]. Funksjonalitet av klonede miRNAs ble sjekket inn HEK-293T celler co-transfektert med psiCHECK-to-avledet plasmid og PLV /miRCS-PE-avledet plasmid som koder for relevant miRNA bruker Dual luciferase assay (Promega, Madison, WI, USA) i henhold til produsentens protokoll.
Lentivirus produksjon og transduksjon
for å produsere lentiviral vektorer, HEK-293T celler ble sådd ut i 10 ml DMEM med en tetthet på 4 × 10
6 per 10-cm matrett. På neste dag ble cellene transfektert med lentiviral emballasje plasmider (13,0 mikrogram pIntg, 3,75 mikrogram pMD2G, 3,0 mikrogram pRSV-Rev og 13,0 mikrogram PLV /MIR [nummer] -PE). Medium ble endret etter 24 timer. 48 timer etter transfeksjon, ble supernatanten oppsamlet og ultra sentrifugert gjennom en pute sukrose. Viruset Utbyttet ble vurdert ved hjelp av en p24-ELISA-kit (XpressBio, Frederick, MD, USA), og mengden av virus for forskjellige vektor preparater ble normalisert basert på nivået av p24 protein. Cancerøse B-celler ble sådd ut ved en tetthet på 3 x 10
4 /ml i 2 ml RPMI 1640. Celler ble omformet på følgende dag bruker like mengder virus basert på P24 målinger. Transduksjon Effekten ble målt ved hjelp av flowcytometri (LSRFortessa, BD Bioscience, San Diego, CA, USA).
Rituximab Cvtotoksisitetsmålinq
For å undersøke effekten av de ulike mirnas på følsomheten til behandling med Rituximab, ble transduserte celler samlet opp, vasket og sådd ut ved 3 x 10
5 /ml i 0,8 ml RPMI 1640, 72 timer etter transduksjon. Celler ble behandlet den neste dag med rituximab i en dose svarende til GI50 av Rituximab eller det samme volumet av natriumklorid buffer. Et volum på 200 pl, sammenslått humant AB serum (HS) (Innovative Research, Novy, MI, USA) ble tilsatt til platene. Førti-åtte timer etter behandling, ble cellene telles direkte av trypan blå fargestoff (som levedyktighet markør) eksklusjon metoden bruker Neubauer kammeret (0,0025 mm
2) og farget parallelt med BrdU (BD Biovitenskap, San Diego, CA , USA) for å måle den formeringshastigheten. For noen eksperimenter ble komplement-proteiner inaktivert i humant serum (inHS) ved oppvarming til 56 ° C i 30 minutter.
Strømningscytometri
Celler ble samlet opp, vasket og farget i 30 minutter med fixable nær IR-død celle levedyktighet markør (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) i henhold til produsentens protokoll. Cellene ble deretter vasket og fiksert i 4% paraformaldehyd i 15 minutter og analysert for levedyktighet og GFP uttrykk. For CD43 og CD20 analyse ble cellene samlet, vasket og farget med APC-konjugert anti-CD43 (BD Biovitenskap, San Diego, CA, USA) og APC-konjugert anti-CD20 (BD Biovitenskap, San Diego, CA, USA) separat for 30 minutter ved 4 ° C i mørket og deretter faste 15 minutter med 4% paraformaldehyde. For å måle graden av apoptose, ble cellene samlet, vasket, permeabilized, og farget med PE-konjugert anti-Spaltet PARP1 (BD Biovitenskap, San Diego, CA, USA) i henhold til produsentens protokoll. For å måle den formeringshastigheten, ble cellene inkubert med BrdU i 55 minutter og deretter samlet opp, vasket to ganger, og permeabilisert og farget med APC-konjugert anti-BrdU (BD Bioscience, San Diego, CA, USA) i henhold til produsentens protokoll. Kvantifisering av GFP, levedyktighet, CD43 og CD20 uttrykk, kløyvde PARP1, og BrdU-positive celler ble undersøkt med et flowcytometer (LSRFortessa, BD Bioscience, San Diego, CA, USA) og dataene analysert ved hjelp FlowJo_V10 programvare.
Kvantifisering av mRNA nivåer av qPCR
Cellene ble høstet, vasket og lysert 48 timer etter Rituximab behandling. Total RNA ble renset ved hjelp av Mirvana miRNA Isolation Kit (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) i henhold til produsentens protokoll. Uttrykket av CD43 ble målt ved primere og probe (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA) i henhold til produsentens protokollen med lys Cycler 480 (Roche, Basel, Sveits). Nivået på uttrykket ble normalisert til uttrykk av RPLP0.
Statistisk analyse
Student t-tester (to halet) paret og uparet ble utført. Alle eksperimenter inkludert legemiddelanalyser og gen- og proteinuttrykk analyse ble utført tre ganger i biologiske triplicates.
Resultater
Effektiv lentiviral transduksjon av B-celler av GCB- og ABC-lignende opprinnelse
for å undersøke effektene av miRNA uttrykket på Rituximab respons i vanskelige å transfeksjon DLBCL cellelinjer, må vi først genererte en lentiviral vektorkonstruksjon, PLV /miRCS-PE, med to ekspresjonskassetter tillater samtidig uttrykk for (i) en miRNA av interesse uttrykt fra den humane U1 små nukleær RNA (snRNA) promoter og (ii) den EGFP reporter-genet drevet av en fosfoglyceratkinase (PGK) promoteren (figur 1a). Bruke uttrykk for EGFP som en markør for vellykket genet levering, bestemt vi transduksjon frekvensen av upconcentrated LV /miRCS-PE i totalt seks kreft B-cellelinjer av DLBCL opprinnelse. To av disse cellelinjene var refraktære til transduksjon av VSV-G-pseudotyped lentiviral vektorer, men de resterende cellelinjer viste robuste nivåer av lentiviral transduksjon (S1 A Fig). I tillegg, levedyktigheten av celler etter transduksjon var nær 100% for alle cellelinjer (Fig S1b). Basert på denne screening for cellelinjer som skulle utsatt for lentiviral transduksjon, fokuserte vi på de to GCB-lignende cellelinjer OCI-Ly-7 og SU-DHL-5 og to ABC-lignende cellelinjer Riva og NU-DHL- 1. Som bestemt ved strømningscytometri-analyse, disse fire B-cellelinjer som alle var positive for CD20 ekspresjon på celleoverflaten (S2 Fig). For disse cellelinjer utførte vi flere transduksjon eksperimenter og bekreftet effektiv genet levering av fluorescens mikroskopi (Fig 1b). Derfor nivåer av transduksjon bestemt ved strømningscytometri varierte fra 57 ± 3% i RIVA celler til 78 ± 2,5% i SU-DHL-5-celler (representative ekspresjons-profiler er vist i figur 1c). Det bør også bemerkes at morfologien til disse fire cellelinjer skilte seg på en måte som var uavhengig av lentiviral behandling. Derfor både OCI-Ly-7 og SU-DHL-5 celler dannes klynger av celler med større celleaggregater, spesielt tydelig i OCI-Ly-7 kulturer, mens verken RIVA eller NU-DHL-1 celler viste noen tendens til å klynge.
(a) en lentiviral vektor, PLV /MIR-PE ble konstruert for å samtidig uttrykke en bestemt miRNA (fra en U1 promoter) og EGFP (fra en PGK promoter). Den lilla boksen (merket «T») indikerer U1 terminatorsekvens som avslutter transkripsjonen av miRNAs satt inn i BSp120I nettstedet. Lysegrå boksen illustrere elementer (R, U5, og ΔU3) av de lange terminale gjentakelser av lentiviral vektor. CMV (lys grå pil) indikerer promoter anvendt for å drive ekspresjon av vektoren RNA i vektor-produserende celler. Transduksjon effektivitet av vektoren ble analysert ved (b) florescence mikroskopi og (c) flowcytometri analyse på ulike kreft B-cellelinjer. Omfanget av mikroskop bilder indikeres av den røde linjen representerer en lengde på 0,1 mm på alle bildene.
Økt toleranse for Rituximab i GCB-lignende celler behandlet med lentiviral vektorer
med sikte på å utnytte lentiviral levering i studier av Rituximab toleranse i B-celler, setter vi ut først å identifisere cellulære virkningene av lentiviral vektor transduksjon. I en standard medikamentrespons Assay (DRA) (eksperimentelle oppsettet vist i S3 figur), eksponert vi transduserte celler til Rituximab i nærvær av humant serum (HS) 72 timer etter transduksjon med LV /miRCS-PE og målte effekten av Rituximab behandlingen etter ytterligere 48 timer ved telling av antallet celler eller analyse merking med BrdU som et mål på celleproliferasjon. Til å begynne med, OCI-Ly-7 og RIVA celler ble behandlet med økende doser av Rituximab, svarende til GI50 (medikamentkonsentrasjon som forårsaker 50% inhibering av cellevekst), TGI (medikamentkonsentrasjon som forårsaker total veksthemning), og 2 x TGI.
for de OCI-Ly-7 celler vi observert at celler transduced med standard uttrykk vektor, LV /miRCS-PE, viste økt motstand mot alle doser av Rituximab (som bestemmes av celletelling og BrdU spredning analyser) i forhold til celler som ikke ble behandlet med en lentiviral vektor (figur 2a og 2b, venstre panel). En slik forbedret toleranse kunne ikke identifiseres i transduserte RIVA celler (figur 2A og 2B, høyre panel). Behandling av de to celletyper med Doxorubicin avdekket ingen effekter på narkotika toleranse etter lentiviral transduksjon (fig 2c og S4a figur), noe som tyder på at den induserte toleranse i OCI-Ly-7 celler ble bestemt for Rituximab. Ved hjelp av en Rituximab konsentrasjon svarende til GI50, vi utførte Rituximab toleransestudier i alle fire cellelinjer (OCL-Ly-7, SU-DHL-5, Riva, og NU-DHL-1 celler) og fant de samme effektene av transduksjon med LV /miRCS-PE i de to GCB-lignende cellelinjer, mens toleranse for Rituximab var upåvirket i de to ABC-lignende cellelinjer (figur 2d og S4B figur), noe som tyder på at den induserte toleranse var spesifikk for GCB-lignende DLBCL celle linjer. Parallelt direkte celle-telling av transduserte OCL-Ly-7 og SU-DHL-5-celler viste en reduksjon i formeringshastigheten (figur 2e), som ble støttet ved analyse av BrdU-inkorporering (S4C figur) og illustrerer at den Rituximab toleransen ikke et resultat av økt celledeling i lentivirally omsatte cellene.
celler ble behandlet med Rituximab (RTX) 72 timer etter lentiviral vektor transduksjon. Celleproliferasjon ble målt 48 timer etter behandling ved hjelp av Rituximab (a) Trypan blå farging og direkte celle-telling, og (b) BrdU-analyse og strømningscytometri-analyse. (C) Mangel på virkning av doxorubicin, som vist ved måling av celleproliferasjon 48 timer etter behandling med stoffet. (D) Lentivirus-mediert økning av toleranse til Rituximab i GCB-Like DLBCL cellelinjer (OCI-Ly-7, SU-DHL-5), men ikke i ABC-lignende celler. (E) Reduksjon av celleproliferasjon i OCI-Ly-7 og SU-DHL-5-celler behandlet med lentivirale vektorer. Antall celler ble bestemt etter 96 timers inkubering. NTC, nontranduced celler; LVTC, lentiviral vektor-transduced celler. Stjernene indikerer nivået av betydning som følger: *:
p
value≤0.05, **:
p
value≤0.01, ***:
p
value≤0.001.
Lentiviral vektor-indusert Rituximab toleranse ikke innebærer komplement-mediert cellelyse
for å undersøke hvilken rolle komplement-mediert celle lysering for økt Rituximab toleranse i lentivirally omformet GCB-lignende celler, analyserte vi responsen til GI50 doser av Rituximab i nærvær av HS og komplement-inaktivert humant serum (inHS). Vi først dyrkede OCI-Ly-7 og Riva celler, transduced med LV /miRCS-PE i nærvær av inHS og HS. For OCI-Ly-7 celler, har vi funnet nedsatt toleranse til Rituximab, i nærvær av komplement (celler dyrket med HS) i forhold til celler dyrket i fravær av komplement (celler dyrket med inHS), målt ved å telle celler (Fig 3a, venstre panel). I kontrast, ble responsen på Rituximab ikke påvirket av komplement i Riva celler (fig 3a, panel til høyre). Disse funnene ble støttet ved å måle inkorporering av BrdU (S5a fig). Derfor celledød indusert ved Rituximab behandling av OCI-Ly-7 oppsto delvis gjennom mekanismer som involverer komplementavhengig cytotoksisitet (CDC).
(a) økt toleranse til Rituximab (RTX) i GCB-liknende celler i nærvær av komplement i forhold til celler dyrket i fravær av komplement. Behandling av celler med varmeinaktivert humanserum (inHS) viste at den apoptotiske effekt av Rituximab var uavhengig av komplementsystemet i RIVA (ABC-liknende) celler, men ikke i OCI-Ly-7 (GCB-liknende) celler. (B) Relativ overlevelse av rituximab-behandlede celler dyrket i human serum (HS) og inHS ikke skiller mellom nontransduced og lentivirally transduced celler. Antallet OCI-Ly-7 og SU-DHL-5-celler ble bestemt med og uten lentiviral transduksjon i fravær eller nærvær av aktivt komplement. For begge GCB-lignende cellelinjer (OCI-Ly-7, SU-DHL-5) den relative økningen i Rituximab toleranse var lik i NTC og LVTC grupper, som viser at beskyttende effekter av lentiviral transduksjon ikke innebærer effekter på CDC. Lys grå og skraverte kolonner representerer celle tall, målt i nærvær av HS og i nærvær av inHS, respektivt. Det absolutte antall av celler ble kvantifisert ved trypan blått fargestoff utelukkelse Fremgangsmåte etter behandling med Rituximab og normalisert til antall ubehandlede celler. Det relative antall av celler ble anvendt som en veksthem indeks som viser forholdet mellom behandlede celler i forhold til den ubehandlede kontroll.
ved siden ut for å teste om den beskyttende effekten av lentiviral transduksjon i GCB lignende celler involvert effekter på CDC. For dette formål, ble antallet OCI-Ly-7 og SU-DHL-5-celler bestemt med og uten lentiviral transduksjon i fravær eller nærvær av aktivt komplement. For begge cellelinjer, ble det observert økt toleranse til Rituximab av celler behandlet med lentivirale vektorer uavhengig av nærvær av komplement. Derfor fikk den relative overlevelse av rituximab-behandlede celler dyrket i HS og inHS ikke skiller mellom nontransduced og lentivirally transduced celler (figur 3b), som ble bekreftet av BrdU innlemmelse målinger (S5b Fig). Dette underbygger at den beskyttende effekten av lentiviral transduksjon ikke innebærer komplement-mediert cellelyse.
Lentiviral vektor transduksjon induserer anti-apoptotiske effekter i GCB-lignende celler
Neste, vi adressert enten de beskyttende virkninger av lentiviral transduksjon ble forbundet med en endret apoptotisk respons. Ved hjelp av kløyvet PARP1 som et mål for apoptose hastighet, har vi funnet at antall spaltede PARP1-positive apoptotiske celler i fravær av Rituximab og HS ble redusert fra 1,4 ± 0,15% i nontransduced celler til 0,7 ± 0,1% i OCI-Ly-7 celler som ble transdusert med lentiviral vektor (figur 4a). Denne anti-apoptotisk effekt av lentiviral transduksjon var betydelig også i OCI-Ly-7 og SU-DHL-5 celler behandlet med Rituximab (fig 4b), noe som viser at celledødsveier ble berørt under lentiviral vektor levering. Spesielt, men testet vi anti-apoptotiske kapasiteter på lentiviral transduksjon som respons på en serie av apoptose-induserende stimuli (Actinomycin D, kamptotecin, cykloheksamid, deksametason, og Etoposide) og funnet økt celletall bare i transdusert OCI-Ly-7 utsatt for Rituximab (fig 4c), noe som tyder på at de observerte anti-apoptotiske effekter var spesifikke for Rituximab. I sammendraget, forstyrrer lentiviral transduksjon med mekanismer for apoptose som er spesielt utløst av Rituximab.
(a) Redusert apoptose rate i lentivirally omformet versus ikke-omformet OCI-Ly-7 celle. (B) Redusert nivå av apoptose i transduserte celler i forhold til nontransduced celler eksponert til Rituximab i 48 timer. (C) Analyse av potensielle anti-apoptotiske kapasiteter på lentiviral transduksjon som respons på en serie av apoptose-induserende stimuli, inkludert Rituximab (RTX) i OCI-Ly-7 celler. Det relative antall av celler ble anvendt som en veksthem indeks som viser forholdet mellom behandlede celler i forhold til den ubehandlede kontroll.
vedvarende ekspresjon av CD43 i lentivirally transduserte GCB-lignende celler behandlet med Rituximab
Tap av ekspresjon av overflateproteinet CD43, uttrykt primært i lymfocytter, er forbundet med første trinn av apoptose i polymorfonukleære celler [40]. Reduksjon av nivået av CD43 kan derfor tjene som en markør for celler som gjennomgår tidlige trinn av apoptose. I henhold til en populasjon av OCI-Ly-7-celler utsatt for Rituximab, viste økt nivå av spaltede PARP1 i celler med lavere nivåer av CD43, mens celler med høyere CD43 ekspresjon hadde lavere nivåer av spaltet PARP1 (figur 5a). Derfor celler med en lavere CD43 ekspresjonsprofilen viste høyere nivå av apoptose. Interessant, observerte vi at apoptose (spaltes PARP1) hastighet for lavt-uttrykkende CD43-celler (definert ved forholdet mellom Q3 og Q4 i figur 5a) var identisk for de to gruppene (0,18 for både NTC og LVTC), viser et konstant nivå av apoptose i celler med lav uttrykk for CD43. Celler transdusert med lentivirale vektorer var overveiende positiv for CD43 og hastigheten av apoptose, målt ved celler med tapt ekspresjon av CD43 eller økte nivåer av spaltet PARP1, ble markert redusert (figur 5a og 5b). Vi deretter fulgte uttrykk for CD43 i OCI-Ly-7 celler over tid etter Rituximab behandling og viste et gradvis tap av CD43 uttrykk i ikke-transduced celler. Imidlertid, celler som ble transdusert med lentivirale vektorer var i stand til å motstå tap av CD43 ekspresjon, som vist ved flowcytometri (figur 5c) og bekreftet på RNA-nivå ved qPCR 48 timer etter behandling Rituximab (figur 5d). Som konklusjon, disse funnene tyder på at anti-apoptotiske virkninger bidrar til økt toleranse til Rituximab av lentivirally transduserte celler.
(a) Redusert apoptose i transdusert OCI-Ly-7-celler 8 timer etter behandling Rituximab, målt ved analyse av CD43 uttrykk og spaltet PARP1 i NTC og LVTC. (B) Reduksjon av CD43 uttrykk i OCI-Ly-7 celler 48 timer etter Rituximab behandling. Histogrammet viser plott antall CD43-positive celler i nontransduced celler (NTC), i lentivirally transduserte celler (LVTC), og i en negativ kontrollcellelinje. (C) Tap av CD43 i respons til Rituximab behandling er blokkert av lentiviral transduksjon av OCI-Ly-7 celler. (D) Konfirmasjon av vedlikeholdt CD43 uttrykk nivåer i celler transduced med lentiviral vektorer og deretter utsatt for Rituximab. Analyse av CD43 genekspresjon ble utført ved hjelp av qPCR på total RNA isolert fra NTC og LVTC.
Utnyttelse lentiviral transduksjon for analyse av virkningen av miRNAs på Rituximab toleranse
lentiviral vektorer er unike verktøy for å levere gener effektivt inn i B-celler og derfor også attraktive, i studier av miRNA funksjon. Men tatt i betraktning effekten av lentiviral transduksjon på celledød og toleransen til GCB-lignende celler til Rituximab, var det uklart hvorvidt effekten av leverings verktøyet selv ville forstyrre studier av gener, inkludert miRNA-kodende gener, påvirker toleranse til stoffet.
