Abstract
Cancer stamceller (cscs) har høy tumor initiere kapasitet og har blitt rapportert for å være resistente mot terapi. Vice versa, terapiresistente kreftceller synes å manifestere CSC fenotyper og egenskaper. Det har vært generelt antatt at resistente kreftceller kan alle være cscs selv om det generelle i denne antakelsen er ukjent. Her har vi kronisk behandlet Du145 prostata kreft celler med etoposid, paclitaxel og noen eksperimentelle medikamenter (dvs. Staurosporin og to paclitaxel analoger), noe som førte til populasjoner av narkotika tolerant celler (DTC). Overraskende, disse feilkoder, da implantert enten subkutant eller orthotopically inn NOD /SCID-mus, viste mye redusert tumorigenicity eller var selv ikke-tumorigen. Narkotika tolerant DLD1 kolon kreftceller valgt av en lignende kronisk utvalg protokollen vises også redusert tumorigenicity mens narkotika tolerant UC14 blærekreftceller påvist enten økt eller redusert tumor-regenererende kapasitet. Narkotika tolerant Du145 celler demonstrert lav proliferativ og klonogene potensial og var nesten blottet for CD44
+ celler. Prospective knockdown av CD44 i Du145 celler hemmet celledeling og tumor regenerasjon, mens restaurering av CD44 uttrykk i narkotika-tolerant Du145 celler økt celledeling og delvis økt tumorigenicity. Interessant, narkotika tolerant Du145 celler viste både økning og reduksjon i mange «stemness» gener. Endelig bevis ble forutsatt at kronisk eksponering for legemidlet generert feilkoder via epigenetiske mekanismer som involverer molekyler som CD44 og KDM5A. Våre resultater viser altså at 1) ikke alle feilkoder er nødvendigvis cscs; 2) konvensjonelle cellegifter som taxol og etoposid kan direkte rettet mot CD44
+ tumor initiere celler; og 3) DTC generert via kronisk narkotika utvalg involvere epigenetiske mekanismer
Citation. Yan H, Chen X, Zhang Q, Qin J, Li H, Liu C, et al. (2011) Narkotika Tolerant kreftceller viser redusert Tumor-Initiere Kapasitet: Nedbryting av CD44
+ celler og Evidence for epigenetiske mekanismer. PLoS ONE 6 (9): e24397. doi: 10,1371 /journal.pone.0024397
Redaktør: Amit Singh, University of Dayton, USA
mottatt: 5 juli 2011; Godkjent: 08.08.2011; Publisert: 15.09.2011
Copyright: © 2011 Yan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Studien ble finansiert av National Institutes of Health (NIH) R01-ES015888, NIH 1R21CA 150009, Department of Defense, W81XWH-08-1-0472, Department of Defense, W81XWH-11-1-0331, Elsa Pardee Foundation, MDACC Senter for kreft epigenetikk. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
introduksjon til
kreft stamcelle (CSC) konsept, at svulster inneholde stilk-lignende kreftceller, ble foreslått flere tiår siden, og nylig gjenopplivet å forklare den cellulære heterogenitet i svulsten. En av de viktigste kriteriene for å definere cscs er deres forbedret evne til å regenerere trans svulster som histologisk rekapitulere den fenotypiske heterogenitet av foreldre svulst [1]. Som sådan, er cscs ofte kalt tumor-initiering celler. Cscs ble først identifisert i leukemi, og siden 2003 har blitt rapportert for mange menneskelige solide tumorer inkludert glioma [2], Ewings sarkom [3], og kreft i bryst [4], [5], tykktarm [6] – [ ,,,0],12], bukspyttkjertel [13], [14], lever [15] – [17], mage [18], lunge [19], [20], hode og hals [21], nyre [22], og eggstokk [ ,,,0],23], [24].
Monterings bevis tyder på at cscs kan være mer resistente overfor anti-kreft terapeutiske midler, som vist i leukemisk [25] og multippel myelom [26] stamceller. CD133
+ cscs-økning etter bestråling og bidra til glioblastom radioresistance gjennom preferanse aktivering av DNA-skade sjekkpunkt respons og en økning i DNA-reparasjon kapasitet [27]. Den CD44
+ CD24
lo /- bryst cscs er beriket med brystkreftpasienter som har fått adjuvant kjemoterapi [28] og mer motstandsdyktig mot noen cellegifter [29]. I musemodeller av brysttumorer, har cscs også vist seg å være upåvirkelig for cisplatinbehandling [30]. Videre kjemoresistent kolon kreftceller vise CSC fenotyper [31] og CD133
+ lever cscs er kjemoresistent grunn fortrinnsrett aktivering av Akt vei [32]. Disse nye funnene fremheve potensialet involvering av cscs i terapi motstand og i tilbakefall av sykdommen. Det har vært antatt at legemiddelresistente cancerceller kan alle bli anriket i cscs selv om den generelle anvendbarheten av denne antagelsen forblir testet.
Immunohistokjemisk farging [33], [34], klonogene analyser [35], [36 ], så vel som tumortransplantasjonsforsøk [37] – [41] har gitt bevis for at human prostatakreft (PCA) inneholder også stamme-lignende celler. Våre systematiske studier i xenograft-modeller viser at PCA-celler er heterogen med hensyn til deres tumor-initiere kapasitet med CD44
+ cellepopulasjonen huse både hvilende cscs og hurtig prolifererende tumor progenitorer [38], [42]. En brøkdel av CD44
+ PCA celler er slow-sykling, kan tilsynelatende gjennomgå selvfornyelse, fortrinnsvis uttrykke «stemness gener, og har høy tumorigen og metastatiske potensialer. Cscs kan bli ytterligere beriket bruker CD44
+ α2β1
hi markør profil [39] og PCA celle holoclones, hvor de fleste cellene er CD44
+ α2β1
hei, inneholder selvfornyende tumor initiere celler [41]. Våre siste arbeid viser at Nanog, viktig for selvfornyelse og pluripotency av ES-celler, er beriket i CD44
+ PCa cellepopulasjonen og funksjonelt nødvendig for tumorutvikling [43]. Faktisk, er tilstrekkelig til å gi gave CSC fenotypiske og funksjonelle egenskaper, og for å fremme kastrering-resistente PCa utvikling [44] induserbar Nanog uttrykk. Et sentralt ubesvarte spørsmål er om stammeliknende PCA-celler kan oppføre seg som enkelte andre cscs å være motstandsdyktig mot terapeutiske midler eller, alternativt, om behandling vil berike PCa-initierende celler. Her rapporterer vi det uventede funn at enkelte narkotika tolerant kreftceller er mye mindre tumorigen eller ikke-tumorigen. Overraskende, de legemiddel tolerant Du145 PCA cellekulturer er blottet for CD44
+ celler, som i det minste delvis, står for deres redusert tumorigenicity.
Materialer og metoder
Animal relatert studier har blitt godkjent av MD Anderson Cancer Center Institutional IACUC komiteen (ACUF 08-05-08132). Alle andre studier presentert her var de etterforsker initierte og ikke krever godkjenning fra andre kontrollorganer.
celler, reagenser og dyr
Du145, PC3, og UC14 celler ble oppnådd fra ATCC og dyrket i RPMI inneholdende 7% varme-inaktivert FBS, 100 ug /ml streptomycin, og 200 U /ml penicillin (Gibco). DLD1 celler ble oppnådd fra ATCC og dyrket i DMEM inneholdende 7% FBS med antibiotika. Etoposide (VP16) og paclitaxel ble kjøpt fra Sigma. Doksorubicin (Dox) og Staurosporin (STS) ble kjøpt fra Biomol. WP1102 og WP1103 ble to nylig syntetisert paclitaxel-analoger med erstatninger på 2′-OH (av Priebe gruppe, detaljer for å bli publisert andre steder). Primære antistoffer som brukes i den aktuelle studien inkluderte: kanin mAb til CD44 (Abcam) for Western blotting (1:1,000), mus mAb til CD44 (BD Pharmingen) for farging (1:500), mus mAb til ABCG2 (Abcam; 1: 500), kanin pAb til BCL-2 (Santa Cruz, 1:500), mus mAbs til p21 og p27 (Santa Cruz, 1:1,1000 for begge), kanin pAb å hTERT (Santa Cruz, 1:100), kanin mAb til GAPDH (Cell Signaling, 1:2,000) og mAb p-aktin (Cell Signaling, 1:1,000). Sekundære antistoffer ble kjøpt fra GE Healthcare og ECL Plus reagenser var fra PerkinElmer Inc. NOD /SCID-mus ble opprinnelig kjøpt fra Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) og hekkekolonier etablert i vår dyre anlegget og vedlikeholdes i standardbetingelser i henhold til institusjonelle retningslinjer.
Etablering av narkotika tolerant celler (DTC) og bestemmelse av IC
50 verdier
Du145, DLD1, og UC14 cellene ble først utsatt for ulike rusmidler, i fire brønner , ved et område av konsentrasjoner, det vil si, 0, 0,1 nM, 1 nM, 10 nM, 50 nM, 0,1 pM, 0,5 pM, 1 uM, 2 uM, 4 uM og 10 uM. Narkotika var etterfylles hver 3 dager, og cellene ble behandlet kontinuerlig i 2 uker. Celle overlevelse og død ble nøye overvåket under en omvendt fase-kontrast mikroskop. På slutten av en to-ukers behandling, «optimale» narkotikakonsentrasjoner ble fastsatt basert på kriteriet at narkotika viste signifikante hemmende effekt på celle ekspansjon, men ikke helt drepe hele befolkningen (~90% celledreping). Hele forsøket ble gjentatt en gang. Disse eksperimentene førte til fastsettelse av optimale konsentrasjoner (angitt i teksten). Deretter kreftceller ble dyrket kontinuerlig i medium inneholdende den optimale konsentrasjonen av medikamenter for minst 3 måneder for å etablere den feilkoder, som ble betegnet som Du145-VP16-celler, Du145-paclitaxel-celler, så videre og så videre. Den DTC ble rutinemessig dyrket i medium som inneholder den optimale konsentrasjoner av enkelte legemidler.
For å bestemme halv-maksimal konsentrasjon av hemming (dvs. IC
50) av foreldrenes kreftceller og feilkoder,, 2.5 3,0 x 10
5-celler ble sådd ut i fire eksemplarer i 24-brønners plater. Etter dyrking over natten, ble cellene behandlet med forskjellige konsentrasjoner av det opprinnelige valget medikament eller ikke-valgt medikamenter (for å undersøke potensielle kryssresistens) i 24-48 timer. Ved slutten av behandlingen ble levedyktige celler tellet ved hjelp av trypanblått-analyser og GraphPad prisme 5.0 programvare ble benyttet for å analysere dataene og beregning av IC
50 verdier.
Klonale og BrdU-inkorporering analyser, immunfluorescens, og immunoblotting
Grunnleggende prosedyrer for disse forsøk er beskrevet i våre tidligere publikasjoner [37] – [39], [43] – [45]. For å bestemme de totale celletall, ble 5000-celler sådd ut i triplikat eller fire eksemplarer i 12-brønners plater og dyrket i 10 dager, med friskt medium matet hver 3. dag. Ved slutten, ble levedyktige celler tellet ved bruk av trypan blå. For BrdU-analysene ble celler sådd ut i triplikat på dekkglass (10.000 celler /dekkglass) over natten og deretter pulset med 10 mM BrdU i 4 timer. Ved slutten ble cellene fiksert i 4% paraformaldehyd inneholdende 5% sukrose i 10 minutter. Celler ble inkubert i 20 min i 1% Triton-100, og deretter denaturert, nøytralisert, blokkert og inkubert med monoklonalt anti-BrdU-antistoff (1:100) i 1 time ved 37 ° C, etterfulgt av geit-anti-mus-IgG-Alexa Fluor 594 (30 min ved 37 ° C). En total på 500-1000 celler ble tellet pr dekkglass og to dekkglass ble tellet for hver celletype for å bestemme andelen av prolifererende (dvs. BrdU
+) celler.
For klonal analyse, 100 cellene sådd ut i triplikat i 6-brønners plater og dyrket i 10 dager med friskt medium ble matet hver 3. dag. Ved utgangen, både holoclones og meroclones [41] ble nummerert og resultatene ble presentert som kloningseffektiviteten. Paraclones inneholdt store og senescent celler [41] og generelt hatt 20 celler, og derfor ble ikke kvantifisert. Immunfluorescens farging av CD44 ble utført som beskrevet [38], [45]. For Western blotting. foreldre Du145 og forskjellige medikament tolerant Du145-celler ble høstet for å fremstille hele cellelysatet i Western blot-analyse av de molekyler som er angitt i figuren paneler. I noen eksperimenter ble Du145-VP16 celler først behandlet med ulike konsentrasjoner av trichostatin A (TSA) eller 5′-aza-deoxycytidine (AZA) i 72 timer.
Etablering av GFP-merket narkotika tolerant DU145 cellene
Kort, 293ft emballasje celler [43] ble transfektert med pLL3.7-GFP lentiviral vektor [43] sammen med emballasje plasmider ved hjelp Lipofectamine. Virusinneholdende medium ble samlet opp 48 til 72 timer senere, sentrifugert ved 3000 rpm, ført gjennom et 0,45 um filter for å fjerne rusk og til slutt underkastet ultrasentrifugering (20 000 rpm x 2 t ved 4 ° C). Narkotika tolerant DU145 cellene ble så infisert med viruset på MOI (mangfold av infeksjon) på 20-25.
subkutan (sc) og ortotopiske kreft eksperimenter
Grunnleggende prosedyrer ble tidligere beskrevet [37 ] – [39], [41], [43], [46]. Kort fortalt ble foreldre og narkotika-tolerant Du145 (og andre) cellene ved ulike tall injisert i 50% Matrigel s.c inn flankene av NOD /SCID-mus. Når den største svulsten (e) i en hvilken som helst gruppe må avsluttes med IACUC forskrifter eller tumorbærende dyr ble døende, ble alle dyr i gruppen ofret og svulster høstet. For ortotopisk implantering, ble dyrene bedøvet og celler ble injisert i en 20 ul medium-Matrigel-blanding (1:01) inn i dorsal prostata. Når tumorbyrde ble klart (ved palpasjon), ble forsøket avsluttet, dyrene avlivet, og primærtumorer sammen med flere organer (f.eks lunge, lever, milt, bukspyttkjertel, nyre, etc) ble dissekert og undersøkt for mikro og macrometastasis (dvs. GFP
+ foci) under et Nikon epifluorescence mikrodisseksjon mikroskop.
CD44 knockdown eksperimenter
shRNA-mediert knockdown ble utført som nylig beskrevet [43], [46]. Kort fortalt ble 293ft emballasje celler transfektert med enten pGIPz CD44-shRNA lentiviral vektor eller pGIPz-NS kontroll vektor. Den virusholdige kulturmedium ble samlet 72 timer etter transfeksjon, sentrifugert ved 3000 rpm, filtrert gjennom et 0,45 um-sprøytefilter, og til slutt underkastet ultrasentrifugering (20 000 rpm x 2 t ved 4 ° C). Viruspelleten ble rekonstituert i OPTI-MEM medium og anvendt for å infisere HT1080 fibrosarkom celler for å bestemme den virale titer. Deretter Du145 celler ble infisert med pGIPz-NS eller pGIPz-CD44shRNA virus ved en MOI på 20, og 24-48 h senere ble brukt i enten in vitro karakterisering eller in vivo tumor eksperimenter.
CD44 overekspresjon eksperimenter
Den grunnleggende retrovirale prosedyren ble tidligere beskrevet [45]. Kort sagt ble retrovirale vektorer, herunder kontroll vektor pBabe-GFP og pBabe-CD44 (Addgene, Cambridge, MA) transfektert inn i de Ampho-Phoenix 293-celler (ATCC). 48-72 timer etter transfeksjon, virusholdige kulturmedium ble samlet, sentrifugert ved 3000 rpm, filtrert gjennom et 0,45 um-sprøytefilter, og til slutt underkastet ultrasentrifugering (22 000 rpm x 2 t ved 4 ° C). Viruspelleten ble rekonstituert i OPTI-MEM medium og anvendt for å infisere medikament tolerant Du145 celler i 24-48 timer, som deretter ble anvendt i både in vitro og in vivo eksperimenter.
Terapeutisk behandling av ortotopisk PC3 svulster med paclitaxel
Den grunnleggende prosedyren for terapeutiske eksperimenter ble nylig beskrevet [46]. Kort sagt ble PC3-GFP-celler implantert i dorsal prostata (DP) på hann NOD /SCID-mus (500.000 celler /DP; n = 10). Tre uker senere ble 5 dyr per gruppe injisert intravenøst med 15 mg /kg kroppsvekt av paclitaxel eller bærerkontroll (PBS). Injeksjonene ble gjentatt hver uke i to uker (det vil si totalt 3 injeksjoner) ble terminert og dyr 49 dager etter tumorcelle implantasjon. DP-tumorer ble dissekert ut, avbildes, og veies mens flere organer, inkludert lungene, bukspyttkjertelen, lymfeknuter, lever og hjerne, ble kontrollert for metastasering på en dissekere epifluorescens mikroskop [46].
Analyse «stemness» genuttrykk profiler ved kvantitativ revers transkriptase – polymerase chain reaction (qPCR)
Den grunnleggende prosedyren for qPCR analyse ble nylig beskrevet [44], [46]. I korthet, ble total RNA ekstrahert fra Du145 Du145 og VP16-celler ved anvendelse av en RNeasy RNA-rensing kit (Qiagen, Valencia, CA). ABI High-Capacity cDNA Arkiv Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, California) og tilfeldige heksamer ble brukt for cDNA syntese. qPCR ble utført av M.D. Anderson Science-Park Molecular Biology Kjerne Facility ved hjelp av en ABI Prism 7900HT (Applied Biosystems). File Builder 3.1 programvare (Applied Biosystems) ble anvendt for å konstruere PCR primere og prober. Humane genspesifikke primer-par ble anvendt for ekspresjon profilering av den SYBR® grønne metoden. Den eksperimentelle Ct (syklus terskel) ble kalibrert mot at 18S kontroll produkt. Alle amplifikasjoner ble utført in triplo. Den DDCt metoden ble benyttet for å bestemme mengden av genproduktet i forhold til at uttrykt i foreldre Du145 celler (en-fold, 100%).
Statistiske analyser
GraphPad prisme 5.0 programvare og F- test ble anvendt for å sammenligne IC
50 verdier. Uparet
t
-test ble brukt til å sammenligne forskjeller i celle tall, BrdU
+% celler, kloning effektivitet, CD44
+% celler og kreft vekter. Fishers eksakte test ble brukt til å sammenligne forekomsten og ventetid.
Resultater
Kronisk sublethal behandling førte til narkotika tolerant kreftceller
Klinisk mange kreftpasienter er ofte behandlet kronisk av anti-kreftbehandling. Det beste eksempelet er kanskje KML (kronisk myelogen leukemi) pasienter som må ta imatinib (Glivec) kontinuerlig i år [47]. Videre metronomisk kjemoterapi – er en form for cellegift administrasjon preget av hyppig, ofte daglig, utvidet bruk av små doser av konvensjonelle chemodrugs uten store pauser [48], fremstår som en standard terapeutisk regime for mange kreftformer. Basert på de forutsetninger som cscs kan ha en spesiell fordel overlevende therapeutics og sannsynligvis cellene som medierer resistens, testet vi om kreftceller som har overlevd KRONISK behandling kan alle har CSC egenskaper. Vi først behandlet Du145 prostatakreft (PCA) celler med to kliniske medikamenter, dvs. etoposid (VP16) og paclitaxel (Taxol) samt tre eksperimentelle medikamenter, staurosporin (STS), en promiskuøs proteinkinase inhibitor, og to nylig syntetiserte paclitaxel-analoger benevnt WP1102 og WP1103 (detaljer som skal presenteres andre steder). Som beskrevet i Methods, vi først behandlet Du145 celler med disse fem stoffene på et område på 10 konsentrasjoner i 2 uker for å fastsette de «optimale» subletale konsentrasjoner på hvilke medikamenter betydelig hemmet svulst celle ekspansjon, men ikke drepe hele befolkningen. Ved hjelp av denne kronisk behandling protokollen at «etterligner» metronomisk behandling i klinikken, vi fast bestemt på de optimale konsentrasjoner i Du145 celler, av VP16, paclitaxel, STS, WP1102, og WP1103 på 1,25 mikrometer, 50 nM, 7 nM, 5 nM, og 25 nM, respektivt. Du145 cellene ble deretter dyrket, kontinuerlig, i medium som inneholder den optimale konsentrasjoner av medikamenter for ~3 måneder. De resulterende narkotika-tolerant celle (DTC) linjer ble utpekt som Du145-VP16, Du145-Paclitaxel, Du145-STS, Du145-WP1102, og Du145-WP1103 celler, henholdsvis.
For å finne ut om narkotika-tolerant Du145 cellene var virkelig tolerante av de opprinnelige utvalgs narkotika, behandlet vi paren og narkotika-tolerant Du145 celler side-ved-side med de respektive fem stoffer. Som vist på fig. 1, narkotika-tolerant Du145 cellene var generelt mer motstandsdyktig enn foreldre Du145 celler til valg narkotika. Således Du145-VP16-celler ble 10 ganger mer motstandsdyktig enn Du145 celler til VP16 (IC
50 verdier er 0,78 uM for Du145 og 9,17 uM for Du145-VP16-celler). Du145-paclitaxel-celler ble -7 ganger mer motstandsdyktige mot paclitaxel enn Du145-celler (fig. 1, A og C). Tilsvarende Du145-WP1103 celler ble nesten 30 ganger mer motstandsdyktige mot WP1103 enn Du145-celler (fig. 1B-C). Endelig Du145-STS og Du145-WP1102 celler var ca. 1,5 og 3 ganger mer motstandsdyktig mot henholdsvis STS og WP1102, enn uselekterte Du145 celler (Fig. 1B-C). Derfor differensial narkotika motstand blant de etablerte DTC rangert Du145-WP1103 Du145-VP16 Du145-Paclitaxel . Du145-STS≈Du145-WP1102
A-B. Foreldre Du145 og narkotika tolerant Du145 cellelinjer valgt med to kliniske narkotika (A) eller tre eksperimentelle medikamenter (B) ble utsatt, side-by-side, til de respektive valg legemidler (f.eks Du145-VP16 celler til VP16 og Du145- paclitaxel celler til paclitaxel) ved de konsentrasjoner (transformert til logaritmen) angitt. Y-aksen representerer cellevekst-inhibering (%). C. tabulert presentasjoner av IC
50 verdier (se Materialer Metoder) og tilsvarende 95% KI (konfidensintervall) Du145 celler og narkotika-tolerante Du145 celler som svar på de fem narkotika indikert. Verdiene ble beregnet fra data innhentet i A og B.
Deretter utsatte vi Du145-VP16 celler til tre ikke-velge narkotika, dvs. paclitaxel, STS, og doxorubicin (Dox). Som vist på fig. 2, Du145-VP16 cellene mer motstandsdyktige (enn foreldre Du145 celler) til paclitaxel (~4 fold), STS (1,5 ganger), og Dox (13 ganger), noe som tyder på at DTC var også kryss-resistente mot andre ikke-velge narkotika
Du145-VP16 celler ble behandlet med paclitaxel (A), STS (B), og doxorubicin (Dox; C). ved de konsentrasjonene [logg] indikert. Resultatene er presentert som% hemming og IC
50 (D) ble bestemt som i figur 1.
Ved hjelp av lignende strategier, vi også etablert narkotika tolerant DLD1 kolon (Fig. 3) og UC14 blære (ikke vist) som kreftceller. I DLD1 celler, de optimale konsentrasjoner for VP16, paclitaxel, WP1102, og WP1003 ble bestemt til å være ved 2,5 uM, 100 nM, 120 nM og 100 nM, respektivt. Som vist på fig. 3, de etablerte DLD1-VP16, DLD1-Paclitaxel, DLD1-WP1102, og DLD1-WP1103 celler var resistente mot de respektive utvelgelses narkotika. Videre DLD1-VP16-celler viste også kryssresistens til paclitaxel og Dox (Fig. 3B). Narkotika tolerant UC14 celler var tilsvarende mer motstandsdyktig mot valg legemidler (dvs. paclitaxel, STS, VP16, Dox, WP1102, og WP1103), enn foreldre UC14 celler (ikke vist).
Foreldre og narkotika tolerante DLD1 cellelinjer valgt med optimale konsentrasjoner (se tekst) av VP16, paclitaxel, WP1102, og WP1103, ble eksponert, side-ved-side, til de respektive utvalgs stoffene ved de konsentrasjoner (transformert inn i logaritmen) viste (A). Y-aksen representerer cellevekst-inhibering (%). B. tabulert presentasjoner av IC
50 verdier og tilsvarende 95% KI (tillit intervaller) av foreldre DLD1 celler og narkotika tolerant DLD1 linjer som svar på både valg og ikke-velge narkotika.
Narkotika tolerant Du145 celler var overraskende mindre tumorigent enn foreldre Du145 celler
Vi antok at DTC kan ha CSC egenskaper og være mer tumorigent in vivo. Til vår overraskelse, alle medikament tolerant Du145 celler subkutant (sc) sprøytes inn i NOD /SCID-mus demonstrerte mye redusert tumor-initiering kapasitet sammenlignet med det samme antall paren Du145 celler, som viste et tumor-initiering frekvens (TIF) av ~ 1/175 (tabell 1). Injeksjon av stadig flere foreldre Du145 celler, ventet, ført til redusert ventetid (tabell 1). I motsetning til dette, Du145-VP16-celler viste en TIF av ~ 1 /62.000 og, på 100.000 celler injisert, tumor ventetid var mer enn dobbelt så lang som for den samme antall Du145 celler (Tabell 1). Faktisk både Du145 Du145-paclitaxel og-WP1103-celler var ikke-tumorigen opp til 10 000 (for Du145-WP1103) og 100 000 (for Du145-paclitaxel) celler implantert (tabell 1). Selv for Du145-STS og Du145-WP1102 celler, som viste de laveste IC
50 differensialer (Fig. 1B-C), redusert svulst forekomst med TIF av 1/971 og 1/45 787, henholdsvis, og mindre svulster var også observerte (tabell 1).
For å finne ut om svulst implantasjonsstedet kan ha en effekt på differensial tumorigenitet observert, vi etablert GFP-merket Du145 foreldre og narkotika-tolerant Du145 celler og implantert like tall (dvs. , 500 000) av celler orthotopically i dorsal prostata (DP) på de mannlige NOD /SCID-mus. Når forsøket ble avsluttet 75 dager etter tumorcelle injeksjoner, observerte vi at Du145-VP16 og Du145-STS celler generert mindre svulster enn foreldre Du145 celler (fig. 4A). Faktisk, både Du145-Paclitaxel og Du145-WP1103 celler var ikke-tumorigen i DP svulst regenerering modellen (fig. 4A). Betydelig, foreldre Du145 celler spredning til flere organer, inkludert lymfeknuter, nyre, bukspyttkjertel, lever, lunge og milt, mens narkotika tolerant Du145 celler manglet tydelig metastaser til noen av disse organene (fig 4B-C. Data ikke vist)
A. GFP-merket foreldre eller narkotika tolerant Du145 celler ble implantert (500.000 celler /injeksjon), i 50% Matrigel, i DP av NOD /SCID-mus. Alle dyrene ble avsluttet 75 dager etter implantasjon. Vist er svulst forekomst og tumor vekter (gjennomsnitt ± S.D, statistikk ikke gjelder på grunn av relativt lite antall dyr). B-C. Representative tumor og organ bilder fra et tumor-bærende dyr i Du145 (B) og Du145-VP16 (C) gruppe, respektivt. Alle bildene ble anskaffet ved hjelp av en Nikon microdissecting epifluorescence mikroskop på 0,75 × og eske området i B (lungene GFP bildet) representerer en utvidelse som viser GFP
+ flekker i lungene.
Narkotika- tolerante DLD1 celler viste også redusert tumorigenicity mens narkotika tolerant UC14 celler demonstrerte rusmiddelavhengige endringer i tumor-initiering kapasitet
for å finne ut om den reduserte tumorigenitet forbundet med resistente celler er begrenset bare til Du145 celler, vi tilsvar injisert, sc, økende antall foreldre DLD1 og fire narkotika-tolerante DLD1 cellelinjer inn i NOD /SCID-mus. Som vist i tabell S1, de legemiddel tolerant DLD1 celler, men viser lignende svulst forekomst, regenerert betydelig mindre svulster i forhold til foreldre DLD1 celler på samme celle tall.
Vi har gjennomført lignende begrensende fortynning tumor eksperimenter 6 narkotika valgt UC14 celler (tabell S2). I motsetning til narkotika-tolerant Du145 og DLD1 celler, som jevnt demonstrert redusert tumorigent potensiale, 4 av de 6 narkotika tolerant UC14 celler (tabell S2, skygget brun) vist forbedret tumor-regenerering kapasitet sammenlignet med samme antall foreldre UC14 celler. Interessant, to narkotika tolerant UC14 cellelinjer også regenerert mye mindre svulster enn samme antall foreldre UC14 celler (tabell S2, skygget rosa). Disse resultatene tyder på at narkotika tolerant UC14 cellene er enten mer eller mindre tumorigent enn foreldre celler, avhengig av de første valg narkotika.
Narkotika tolerant Du145 cellene var mindre proliferativ og viste lav kloning effektivitet
Siden det var ganske uventet at noen narkotika tolerant kreftceller, viste redusert tumor-regenererende kapasitet, vi senere fokusert på narkotika tolerant Du145 celler i forsøk på å avdekke mulige mekanismer. Vi konsekvent observert at de fleste narkotika tolerant Du145 celler syntes å spre seg saktere enn Du145 celler. Faktisk, i en prospektiv 10-dagers eksperiment måling levende celle tall, observerte vi at alle narkotika tolerant Du145 celler, unntatt Du145-WP1102 celler, viste mye lavere end-point levende celle tall (Fig. 5A), noe som tyder på at DTCs var mindre proliferativ og /eller mer utsatt for celledød. Vi utførte deretter BrdU-inkorporering eksperimenter for å direkte måle celleproliferasjon. Som vist på fig. 5B, narkotika-tolerant Du145 celler utstilt lavere proliferative indekser (dvs.% BrdU
+ celler). Interessant, selv Du145-WP1102 celler viste en lavere proliferativ indeks (fig. 5B) selv om disse kulturene viste lignende totale levende celle tall til foreldre Du145 celler (Fig. 5A). Husk at Du145-WP1102 celler viste også forholdsvis mindre reduksjon i tumor-initiering kapasitet i forhold til andre medikament-tolerant Du145-celler (tabell 1). Det er mulig at Du145-WP1102 cellene proliferated mindre, men hadde også mindre spontan celledød, noe som resulterer i lignende endepunkts levende celle tall (Fig. 5A) og mindre markant nedgang i tumorigenicity (tabell 1). Ja, vi konsekvent observert at Du145-WP1102 celler, kronisk valgt å bruke 5 nM WP1102 sammensatt, viste mindre flytende og apoptotiske celler i kulturflasker sammenlignet med Du145-WP1103 celler (ikke vist), som ble kronisk valgt å bruke 25 nM WP1103 sammensatte. Til slutt, observerte vi at alle narkotika tolerant Du145 celler viste lavere kloning effektivitet enn foreldre Du145 celler (Fig. 5C).
A. Kvantifisering av antall levedyktige celler. Parent og narkotika-tolerant Du145 celler ble sådd ut i fire eksemplarer, i 12-brønners plater (5.000 celler /brønn) og levedyktige celler ble kvantifisert ved anvendelse av Trypan blå eksklusjon assay 10 dager etter plettering. B. Kvantifisering av% BrdU
+ celler (se Materialer Methods). C. Fastsettelse av kloning effektivitet. Parent og narkotika tolerant Du145 celler ble belagt, i fire eksemplarer, i 6-brønners plater (100 celler /brønn) med friskt medium fylles hver 3. dag. Antallet holoclones og meroclones ble bestemt 10 dager etter plating. I alle data, barer representerer gjennomsnitt ± SD og statistiske analyser ble utført ved bruk av Student
t
-test (*, P 0,05, **, P 0,01)
. i samsvar med redusert celleproliferasjon, narkotika tolerant Du145 celler viste økte nivåer av to cyclin-avhengig kinase hemmere, p21 og p27, spesielt i Du145-paclitaxel og Du145-WP1103 celler (fig. 6A), de to cellelinjer som fullstendig manglet tumorigenicity (tabell 1). De P27-nivåer ble også forhøyet i alle tre andre legemiddel tolerant Du145 cellelinjer (Fig. 6A). Intriguingly, den betydelig økt p27-proteinbånd i Du145 Du145-paclitaxel og-WP1103 celler migrert litt raskere enn protein på andre cellelinjer (Fig. 6A). Fremtidige studier vil avklare dette potensielt interessant observasjon. I motsetning til p21 og p27, bcl-2, et anti-apoptotisk protein, viste mindre, enskjønt dramatiske minskninger, igjen, i de to ikke-tumorigene Du145 linjer, dvs. Du145-paclitaxel og Du145-WP1103 (Fig. 6A).
A. Hele cellelysat fra celletypene er angitt ble anvendt i Western blotting av p21, p27, Bcl-2, og hTERT og Blottet ble reprobed for β-aktin. NS, ikke-spesifikk. B. Western blotting av CD44 og ABCG2. Blottet ble reprobed for β-aktin og GAPDH. C-D. Du145 og narkotika tolerant Du145 celler ble sådd ut på dekkglass og farget for CD44 bruker monoklonalt antistoff. Vist er representative bilder (C) og kvantifisering av CD44
+ celler (D; gjennomsnitt ± SD, *, P 0,01).
Narkotika tolerant Du145 kulturer viste redusert antall av, eller var blottet for, CD44
+ celler
Flere bevisene tyder på at redusert tumor-regenererende kapasitet i narkotika tolerant Du145 celler kan innebære, i tillegg til kompromittert proliferativ potensial kanskje mediert av økt p21 og p27, narkotikainduserte defekter i tumor-initiering celler. C-D.
