Abstract
epidermal vekstfaktor reseptor monoklonalt antistoff ble godkjent for behandling av metastatisk kolorektalcancer bærer KRAS villtype DNA. Men nyere studier viser at pasienter med KRAS G13D mutasjon kan ha nytte av EGFR antistoff terapi. I denne studien forsøkte vi å finne ut om den overflod av KRAS mutasjon kan påvirke effekten av EGFR-antistoff terapi. Vi først etablert en PNA-PCR-metode som kan beregne hvor stor andel av KRAS mutasjon i total DNA og bevist sin evne på 47 kolorektal kreft prøver bærer KRAS-mutasjoner. Deretter analyserte vi sammenhengen mellom overflod av KRAS-mutasjoner og effekt av EGFR antistoffer i en annen 35 metastatisk kolorektalcancer. Vi beviste at PNA-PCR-analyse kunne beregne overflod av KRAS mutasjon og andelen av mutant-DNA i kreftceller variert mye (10,8% ~98.3%) på de 47 pasientene med kolorektal kreft. Effekten av EGFR antistoff korrelert med overflod av KRAS-mutasjoner: i KRAS mutasjon mindre enn 30% gruppen, sykdomskontrollrate var 44,4% (4/9); sykdommen kontroll frekvensen av 30~80% gruppen var 5,6% (1/18) og 80% gruppen var 12,5% (1/8) (P = 0,038). Oppsummert vår studie viste at PNA-PCR-metoden kan lett gjenkjenne andelen KRAS mutasjon i tumorceller og pasienter med kolorektal kreft med lav overflod av KRAS mutasjon kan ha nytte av EGFR-antistoff terapi
Citation. Yu S, Xiao X, Lu J, Qian X, Liu B, Feng J (2013) pasienter med kolorektal kreft med lav overflod av KRAS mutasjon kan ha nytte av EGFR antistoff terapi. PLoS ONE 8 (7): e68022. doi: 10,1371 /journal.pone.0068022
Redaktør: Ramon Andrade de Mello, Det medisinske fakultet, Universitetet i Porto, Portugal
mottatt: 1 februar 2013; Godkjent: 24 mai 2013; Publisert: 09.07.2013
Copyright: © 2013 Yu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Arbeidet ble støttet av Wu Jieping Medical Foundation (320.6700.09050), https://www.wjpmf.org/. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) monoklonalt antistoff ble godkjent for behandling av metastatisk kolorektalcancer pasienter uten KRAS-mutasjoner. KRAS mutasjoner er beskrevet å forekomme hos omtrent 40% av kolorektal kreft, og de fleste av dem (90%) forekommer i kodon 12 og 13 [1], [2]. Flere fase II og fase III kliniske forsøk har vist seg å være en mangel på respons til anti-EGFR behandling i nærvær av KRAS mutasjoner [3], [4], [5]. Disse resultatene førte til European Medicines Agency og Food and Drug Administration for å begrense anti-EGFR behandling bare til pasienter som bærer villtype KRAS-tumorer i 2009 [6].
Men nyere studier viste at KRAS G13D mutasjon og kodon 12 mutasjoner er faktisk ikke skapt like forutsi kliniske utfall av anti-EGFR terapi med metastatisk kolorektalcancer (mCRC) pasienter [7], [8]. Pasienter som frakter KRAS G13D-mutasjon kan likevel ha nytte av cetuximab behandling [9]. I en multivariat analyse, pasienter med G13D mutasjon svulster behandlet med cetuximab hadde lengre total overlevelse (median, 7,6 måneder vs 5,7 måneder) og lengre progresjonsfri overlevelse (median, 4,0 måneder vs 1,9 måneder) enn andre KRAS muterte tumorer [10]. Flere meta-analyse også fått lignende resultater [7], [11]. Annet enn det, en samlet analyse av tre forsøk viste at spesifikk mutasjon i KRAS kodon 12 hadde også forskjellig innvirkning på behandlingseffekten hos pasienter med kolorektal kreft og svulst som bærer en KRAS G12D mutasjon viste en sterk trend til en mer gunstig utfall sammenligne med andre kodon 12 mutasjoner [12]. Alle disse studiene viste oss at ikke alle KRAS muterte tumorer var resistente mot anti-EGFR terapi. Som forskere fortsatte, det var ikke nok til grovt skille pasienter med KRAS mutasjonsstatus.
Siden svulsten hadde stor heterogenitet, ulike tumorvev kan også ha variable overflod av KRAS muterte tumorceller. Siden hver screening-metoden hadde sin følsomhet, når svulsten KRAS mutasjonen andel redusert til en viss grad, denne tumorprøve kan bli gjenkjent som KRAS villtype. Etter hvert som flere og flere svært følsomme screeningsmetoder er etablert, vil flere tumorprøver bli klassifisert som KRAS mutante de [13], [14]. Vi vet ennå ikke om disse prøvene vil være motstandsdyktig mot EGFR-antistoff terapi. I denne studien hypotese vi overflod av KRAS mutasjon kan også påvirke effektiviteten av anti-EGFR behandling. Egentlig lignende med vår hypotese, i 2011, Zhou et al fant at høy overflod av EGFR mutasjoner hadde høyere objektiv respons enn lav overflod i ikke-småcellet lungekreft behandlet med gefitinib [15].
I vår tidligere studie, etablerte vi en PNA-PCR (peptid nukleinsyrer-PCR) metode som kan undertrykke forsterkningen av KRAS villtype DNA. I denne studien, må vi først endret denne PNA-PCR-metoden for å sørge for at det kunne helt undertrykke forsterkning av KRAS villtype DNA og bekreftet sin undertrykkelse evne på 47 tumorprøver bærer KRAS-mutasjoner. Da vi kvantifiseres og beregnet andelen av KRAS mutant-DNA i tumorvevet, og funnet at andelen varieres mye. Til slutt sammenlignet vi forholdet mellom KRAS mutasjon overflod og effektiviteten av cetuximab i en annen 35 metastatisk kolorektalcancer.
PNA-PCR-metoden ble etablert før i vårt laboratorium [16], og i denne studien har vi gjort mindre justeringer for å sørge for at det kunne kvantifisere og beregne hvor stor andel av KRAS mutant DNA. Denne metoden kan forsterke KRAS mutant DNA eksklusivt og kunne kvantifisere KRAS muterte DNA samtidig. På samme tid, kan vi også kvantifisere mengden av total DNA (både KRAS mutant og KRAS villtype-DNA) ved regelmessig kvantitativ PCR (PCR uten PNA). Da kunne vi lett regne ut prosentandelen av KRAS mutant DNA i total DNA.
Materialer og metoder
cellelinjer og pasienter
Colon kreft cellelinjer SW480 og SW116 (kjøpt fra BIOK KM, Kina) ble anvendt i denne studien. Cellelinje SW480 inneholder en homozygot KRAS kodon 12 mutasjon (GGT → GTT) og SW116 havner villtype KRAS-genet. Til sammen 47 pasienter med kolorektal kreft «FFPE- eksemplarer som KRAS-status ble vist seg å være mutant enten KRAS kodon 12 eller kodon 13 ble oppnådd fra Drum Tower Hospital fra november 2008 til desember 2010. En annen 35 kolorektal kreftpasienter med KRAS-mutasjon ble samlet fra Jiangsu Cancer Hospital fra 2006 til 2010. til forskjell fra pasienter over alle disse 35 pasientene fikk cetuximab behandling. Informert skriftlig samtykke ble innhentet fra alle pasienter før startet behandling. Alle beslutninger behandling ble gjort av behandlende leger før designe av studien. Studien ble godkjent av institusjonelle etiske komité av sykehus (Ethics Committee of Drum Tower Hospital og etikkomiteen i Jiangsu Cancer Hospital) før denne studien ble gjennomført.
DNA Extraction fra SW480, SW116 og FFPE- Vev
etter manuell macrodissection av FFPE- vev, ble det hematoksylin og eosin-farget deler av FFPE vev anmeldt av tre erfarne patologer å evaluere overflod av tumorceller. Den detaljerte evalueringsmetode har blitt beskrevet før [17]. Prøvens tumorcelle prosentandelen er gjennomsnittet av verdiene oppnådd ved de tre patologer. Genomisk DNA ble isolert fra FFPE-prøver med SW116 og SW480 Recover All total nukleinsyre isolasjon kit (katalog nr. AM1975, Ambion) i henhold til produsentens instruksjoner. En negativ kontroll ble utført for å undersøke muligheten for kontaminering. DNA-konsentrasjoner ble bestemt ved UV (260 nm) spektrofotometer.
PNA-PCR Plus pyrosekvensering
PNA-PCR og pyrosekvensering forholdene er blitt beskrevet tidligere med unntak av PCR Master Mix [16]. I korthet PCR masterblanding inneholdt sluttkonsentrasjoner på reagenser som følger: 1 x SYBR Premiks Ex Taq-Mix (Takara, kode DRR041A), 0,15 umol /L forover og revers primere, 0,5 umol /l PNA og viss mengde DNA. PNA-sekvensen var 5′-CCTACGCCACCAGCTCC-3 «. Den fremre primer-sekvensen var 5»-GCCTGCTGAAAATGACTGAATATAA-3 «og den reverse primeren var 5′-biotin-CGTCAAGGCACTCTTGCCTAC-3». Termocykling ble utført i en Mx3000P (Stratagene) real-time PCR instruksjon og sykkelBetingelsene var som følger: 98 ° C i 30 s og deretter 40 sykluser med 98 ° C i 10 s, 72 ° C i 10 s, 62 ° C i 20 s og 72 ° C i 20 sek. Pyrosekvensering ble utført i pyrosekvensering PSQ96 HS System (Biotage AB). Sekvensen til primeren var 5’pyrosekvensering-TGTGGTAGTTGGAGCT-3 «. Nukleotid dispensasjon ordren var syklisk TACG fra 5 «til 3».
pasientgrupper og behandlingsregimer
Vi retrospektivt analysert 35 pasienter med histologisk bekreftet mCRC med KRAS mutasjon fra 2006 til 2010. Alle svulster var kolorektal adenokarsinomer. Pasientene ga informert skriftlig samtykke og ble behandlet med cetuximab eller ceruximab-baserte regimer. Cetuximab ble administrert som monoterapi eller i kombinasjon med kjemoterapi-baserte regimer med samme dose inntil sykdomsprogresjon. Cetuximab ble administrert ved en dose på 250 mg /m
2 (initial dose var 400 mg /m
2). Det var 28 pasienter som fikk cetuximab alene. Det var 4 pasienter som fikk 5-Fu behandling pluss cetuximab behandling etter svikt av 5-Fu terapi. En annen 3 pasienter fikk irinotecan, 5-Fu og cetuximab behandling etter sykdom fremdriften av irinotecan pluss 5-Fu terapi.
klinisk evaluering og tumorrespons Kriterier
Den kliniske responsen ble vurdert hver 2 måneder etter computertomografi (CT) scan av brystet og magen og /eller magnetisk respons scan (MR). De Response evalueringskriterier i solide tumorer (RECIST) versjon 1.0 ble vedtatt for klinisk evaluering. Ifølge RECIST versjon 1.0, ble fullstendig respons (CR) definert som forsvinningen av alle mållesjoner; delvis respons (PR) ble i det minste en 30% reduksjon i summen av de lengste diameter (SLD) av mållesjoner tar som referanse grunnlinjen SLD; progressiv sykdom (PD) var minst en 20% økning i SLD av mållesjoner, tar som referanse den minste SLD registrert siden behandlingen startet; stabil sykdom (SD) var verken tilstrekkelig reduksjon i SLD å kvalifisere for PR heller ikke tilstrekkelig økning i SLD å kvalifisere seg til PD. To onkologer og radiologer verifisert klinisk respons for alle pasienter i en blindet måte.
Statistical Analysis
Pasienter med CR, PR og SD ble definert som pasienter med sykdomskontroll og syke kontrollfrekvensen ble beregnet som antall sykdomskontroll pasient /antallet av alle pasienter. Chi-kvadrat test ble utført for å sammenligne sykdomskontroll frekvensen av ulike grupper i de 35 kolorektal pasienter. The Chi-kvadrat ble utført av SPSS 16.0. En p-verdi på 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Validering av PNA-PCR metoden på cellelinjer
Vi fant ut at når vi lagt 100 ng KRAS vill. -type DNA i PNA-PCR-assay, kan PNA undertrykke amplifikasjon av villtype-DNA. Men dette undertrykkelse var ikke fullstendig og stabil etter gjentatte tester (Fig. 1A). Men når vi har lagt 100 ng KRAS villtype DNA og 0,01 ng KRAS mutant-DNA i PNA-PCR analysen, kunne KRAS villtype DNA være helt og stabilt undertrykt og bare KRAS mutant-DNA ble forsterket etter bekreftelse av pyrosekvensering (fig. 1B), som indikerte at til og med den mutante DNA var sjelden sammenlignet med vill-type, PNA-analysen likevel forsterke mutante DNA-eksklusivt, og denne forsterkning kan bidra til å undertrykke villtype DNA-amplifikasjon fullstendig.
(A) det er villtype PCR-produktene ved tilsetning av 100 ng KRAS villtype DNA i PNA-PCR-analyse. (B) Det er bare KRAS mutant-PCR-produkter ved å tilsette 100 ng vill-type-DNA og 0,01 ng KRAS-mutant-DNA.
For å være sikker på at stabiliteten av analysen, ble redusert vi mengden vill-type-DNA til 10 ng tilsatt i analysen, og fant at PNA kunne fullstendig og stabilt å undertrykke forsterkning av villtype-DNA selv i fravær av KRAS mutant DNA (ingen PCR-produkter, bekreftet ved gelelektroforese og pyrosekvensering, ikke data vist ). Derfor, i følgende eksperiment, vi kontrollerte DNA lagt i analysen ikke mer enn 10 ng.
Validering av PNA-PCR metoden på kreftpasienters tumorvev
Totalt 47 kolorektal kreftpasienter ble bekreftet å bære KRAS mutasjon av COLD-PCR /Sanger-sekvensering [17]. Totalt var det 15 G12D, 13 G12V, 13 G13D, 2 G12S, 2G12A, 2G13R og 1G12C KRAS-mutasjoner (en pasient bærer to typer KRAS mutasjoner). Prosentandelen av tumorceller i FFPE-prøver ble oppført i tabell 1. Ikke mer enn 10 ng DNA fra FFPE prøve ble tilsatt til PNA-PCR-analyse og PCR-produktene ble sekvensert ved pyrosekvensering. Som vi forventet, PNA-PCR-analyse forsterket KRAS muterte DNA eksklusivt. Figur 2 viser at det ikke villtype-DNA ble amplifisert i PNA-PCR-analyse.
A tumorvev inneholder en GGT GCT → mutasjon. B svulstvev inneholder en GGT → GAT mutasjon. C svulstvev inneholder en GGC → GAC mutasjon.
Finn og beregne hvor stor andel av Mutant KRAS DNA
Før detektere andelen mutant DNA av svulstvev, vi analysert standardkurven av PNA-PCR-analyse og funnet regresjonslinjen var lineær (helling = -3,25; r = 0,977) i området 0,02 til 10 ng av KRAS mutant-DNA (fig. 3), noe som betyr at denne analysen kunne kvantifisere KRAS mutant DNA.
Varierende mengder av KRAS mutant DNA ble plottet mot Ct-verdiene (terskel syklus). Slope, r verdi og regresjonslinje er vist.
Ikke mer enn 10 ng DNA fra FFPE vev (2 ul) ble satt til PNA-PCR-analyse og regelmessig PCR assay (uten PNA) henholdsvis (alle reaksjonene ble kjørt i triplikat). En prøve totale DNA og KRAS-mutant-DNA kunne leses av standardkurven. DNA-mengde i vanlig PCR-analysen var total-DNA som en rekke DNA kan bli amplifisert likt, og DNA-mengden i PNA-PCR-analysen ble KRAS-mutant-DNA som villtype-en ikke forsterke i denne analysen. Prosentandelen av KRAS mutant-DNA ble beregnet som mengden av KRAS mutant DNA /mengde av total DNA. Prosentandelen av KRAS mutant DNA i tumorceller ble beregnet som prosent av KRAS mutant DNA i total DNA /prosentandelen av tumorceller i tumorvev. Prosentandelen av mutant-DNA i tumorceller varierte fra 10,8% til 98,3% (tabell 1). Totalt var det 10 prøver som inneholdt mutant DNA mindre enn 30%, 27 prøver fra 30% til 80% og 10 prøver mer enn 80%.
Andel KRAS mutasjon i tumorceller og korrelasjon til Response
Pasientens egenskaper og prosentandel av KRAS mutasjon i kreftceller har vært oppført i tabell 2. satsen for delvis respons var 2,9% (1/35), stabil sykdom 14,3% (5/35) og progressiv sykdom 82,9% ( 29/35). Sammenheng mellom andel av KRAS mutasjon i tumorceller og sykdomskontroll ble oppført i tabell 3. Totalt i KRAS mutasjon mindre enn 30% gruppen sykdomskontrollrate var 44,4%; sykdommen kontroll frekvensen av 30~80% gruppen var 5,6% og 80% gruppen var 12,5% (p = 0,038). Det var verdig til å merke seg at i 80% gruppe pasienten som hadde stabil sykdom inneholder en G13D mutasjon. I denne studien var svarprosenten 18,5% (5/27) for KRAS 12 kodon mutasjoner og 12,5% (1/8) for KRAS G13D-mutasjon (tabell 4). Vi observerte ikke at pasienter med KRAS G13D mutasjon hadde bedre responsrate (tabell 4).
Diskusjoner
Denne studien viste at PNA-PCR metode kunne kvantifisere og beregne KRAS mutasjon overflod av tumorceller. Så vidt vi vet, vi først viste at lav overflod av KRAS-mutasjon ( 30%) kan også ha nytte av anti-EGFR behandling i metastatisk kolorektalcancer. Siden tidligere studier kun fokusert på om mutasjonen var positive, vår studie avdekket en ny forsknings konsept av EGFR antistoffer.
I denne studien var det 7 pasienter behandlet med både cetuximab og kjemoterapi. Men alle disse 7 pasientene fikk cetuximab etter svikt i original kjemoterapi. Derfor har vi en tendens til å tro at pasientenes respons på behandlingen bidro hovedsakelig til cetuximab. Selv om det var studier vist at pasienter med KRAS G13D mutasjon viste en sterk trend til en mer gunstig utfall sammenligne med kodon 12 mutasjoner, vi klarte å observere dette i vår studie potensielt grunn av begrenset antall pasienter i denne studien.
Våre resultater viste at prosentandelen av KRAS mutant-DNA i tumorceller varierte fra 10,8% til 98,3%, og denne fordeling var kontinuerlige. Som vi forventet, pasienter bærer lav overflod ( 30%) av KRAS mutasjon hadde høyere sykdomskontrollrate til cetuximab enn andre grupper (44,4% for 30% gruppe vs 5,6% for 30~80% gruppen og 12,5% for 80% gruppen, P = 0,038). Hvis vi utelatt en sykdomskontroll pasient som bar en G13D mutasjon i . 80% gruppe, trenden at lav overflod hadde høyere sykdomskontrollrate var mer opplagt
Selv om direkte Sanger-sekvensering ble ansett som en klassisk metode for screening KRAS mutasjoner, flere og flere meget sensitive metoder som COLD-PCR, ARMS, mutant-beriket PCR, konkurranse forsterkning av differensielt smelte amplikonene (CADMA) [18], [19], [20], [21] ble brukt til skjermen KRAS-mutasjoner. Disse metodene hjalp oss å finne flere KRAS muterte prøver. Men om disse prøvene kan ha nytte av anti-EGFR terapi er fortsatt ukjent. Vår studie viste at disse prøvene med lav overflod av KRAS-mutasjoner kan ha nytte av EGFR antistoffer.
Hvorfor har svulst med lav overflod av KRAS mutasjon har en tendens til responsen på EGFR antistoff terapi? En mulig forklaring var at kreftceller hadde stor heterogenitet. Når KRAS mutante tumorceller ble mindretall har de fleste av KRAS villtype tumorceller kan også bli drept av EGFR-antistoff-behandling og i denne prosess kreftpasienter kunne vise en forholdsvis lang tid for stabil sykdom eller til og med delvis respons. Men som terapi fortsetter, blir mer og mer KRAS villtype tumor utryddet, overflod av KRAS-mutasjon blir høyere og pasienter har en tendens til å ha en progresjon sykdom og bli resistente mot EGFR antistoffer.
Disse kan også forklare hvorfor EGFR antistoff behandling er i utgangspunktet effektiv for de fleste KRAS villtype kreftpasienter og deretter losts sin effektivitet som terapi fortsetter. En fersk artikkel publisert i
Natur
fant at 60% av pasientene som utviklet resistens mot EGFR antistoff behandling viste kjøp av fritids KRAS-mutasjoner [22]. Vi har en tendens til å tro at denne «sekundære» KRAS mutasjon faktisk eksisterer i primær tumorvev. Siden kreftceller som inneholder denne mutasjonen var for få, kan vi ikke oppdage dem før behandling. Imidlertid, som terapi fortsatte, andelen av tumorceller justert under terapitrykk. I denne situasjonen tapt anti-EGFR-terapi dens effektivitet og «sekundær» KRAS mutasjoner kan også lett kan oppdages.
Enda viktigere, Misale et al har også funnet at KRAS mutante alleler kunne påvises i blodet av anti- EGFR behandling pasienter så tidlig som 10 måneder før radiografisk dokumentasjon av sykdomsprogresjon [22]. Med andre ord, selv KRAS mutante alleler eksisterer, pasienter kan fortsatt ha en relativt lang tid (10 måneder) av stabil sykdom. Denne artikkelen resultat sammenfaller med våre funn og viser at eksistensen av KRAS-mutasjoner betyr ikke en komplett motstand.
Selv om noen forskere hadde betalt oppmerksomhet til å skille lav og høy overflod av EGFR mutasjon nylig [15], vår fordel var mer opplagt som vår metode kan enkelt og nøyaktig beregne den nøyaktige prosentandel av KRAS muterte alleler. Dette nøyaktig beregning kunne reflektere andelen av KRAS mutasjon mer objektivt og hjelpe andre laboratorie bekrefte vår konklusjon lettere.
I sammendraget, vår studie viste at PNA-PCR-metoden kan lett gjenkjenne andelen KRAS mutasjon i kreftceller . Kolorektal kreftpasienter med lav overflod av KRAS mutasjon kan ha nytte av EGFR antistoffer og videre forskning er nødvendig på et større antall pasienter.
