Abstract
Bakgrunn
En ikke-menneskelige primater (NHP) modell av glutenintoleranse ble ansatt for å studere genetiske forstyrrelser forbundet med kosten gluten endringer i tynntarms vev fra gluten-sensitive rhesus makaker (
Macaca mulatta
).
metodikk
stadier av remisjon og tilbakefall ble oppnådd i gluten-sensitive dyr ved administrasjon av glutenfri (GFD) og glutenholdig (GD) dietter, som beskrevet tidligere. Pin-head store biopsier, fremstilt non-invasiv ved pediatrisk endoskop fra tolvfingertarmen, mens på GFD eller GD, ble brukt for utarbeidelse av total RNA og genet profilering, ved hjelp av kommersielle rhesusape Mikromatrise (Agilent Technologies), rettet uttrykk på over 20 000 gener .
hovedfunnene
Når sammenlignet med normale, friske kontroll, gluten-sensitive makaker viste differensial genekspresjon indusert av GD. Mens observerte genet forstyrrelsene ble klassifisert i en av 12 overlappende kategorier – kreft, stoffskifte, fordøyelseskanal funksjon, immunrespons, cellevekst, signaltransduksjon, autoimmunitet, avgiftning av xenobiotics, apoptose, aktin-kollagen deponering, nevronale og ukjent funksjon – Denne studien fokusert på kreftrelaterte gener nettverk som cytokrom P450 familie (avgiftning funksjon) og aktin-kollagen-matriksmetalloproteinaser (MMP) gener.
Konklusjon /Betydning
Et tap på avgiftning funksjon parallelt med nødvendigheten av å forbrenne karsinogener ble avslørt i gluten-sensitive dyr mens på GD. En økning i kreftfremmende faktorer og en samtidig reduksjon i kreftforebyggende faktorer assosiert med endret uttrykk av aktin-kollagen-MMP-genet nettverk ble notert. I tillegg viste gluten-sensitive makaker redusert antall differensielt uttrykte gener, inkludert kreft-assosiert seg ved tilbaketrekking av kosttilskudd gluten. Til sammen tyder disse funnene potensielt utvidet nytten av gluten-sensitive rhesusape i kreftforskning
Citation. Sestak K, Conroy L, Aye PP, Mehra S, Doxiadis GG, Kaushal D (2011) Forbedret xenobiotiske Metabolism og redusert følsomhet for kreft i Gluten-Sensitive Macaques ved Innføring av en glutenfri diett. PLoS ONE 6 (4): e18648. doi: 10,1371 /journal.pone.0018648
Redaktør: Irina Agoulnik, Florida International University, USA
mottatt: 8 oktober 2010; Godkjent: 11 mars 2011; Publisert: 12. april 2011
Copyright: © 2011 Sestak et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health gir R01DK076653 og 3R01DK076653 til KS og basen driftstilskudd av TNPRC RR000164. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
gluten følsomhet er en av de fremtredende trekk ved cøliaki (CD), som er en autoimmun lidelse preget av skadede slimhinnen i tynntarmen på grunn av reaksjoner utløst av kosten gluten, et protein kompleks som finnes i hvete, rug, og bygg [2]. En serie av histopatologiske manifestasjoner ble beskrevet i cøliaki pasienter og også i rhesusape med glutensensitiv enteropati – en nyetablert ikke-human primat modell av gluten følsomhet [1], [3], [4], [5]. Hos mennesker Marsh [6], [7] fordelt CD-forbundet lesjoner, basert på alvorlighetsgrad, inn i fem kategorier. I rhesusape, lesjoner ble beskrevet å være mellom mild intraepitelial og lamina propria lymphocytosis opp til nesten fullstendig utflating og sammensmelting av de små tarmtottene, med kronisk betennelse av det tilsvarende lamina propria [1], [5]. Gluten-følsomme macaque-modellen ble nylig brukt til å demonstrere funksjonelle endringer i intestinal permeabilitet i den fasen av epitel forfall forårsaket av kosten gluten. Det ble funnet at på det stadium av forfall, et gluten-avledet peptid, slik som alfa-2-gliadin 33-mer er i stand til å trenge inn under tarmepitelet inn i lamina propria, i samsvar med resultatene som er beskrevet i celiacs [3], [4], [5], [8]. Forstyrret mønster av tarm tett veikryss og deponering av autoantistoffer rettet mot enzymet som spiller en viktig rolle i gluten fordøyelsen dvs. vev tranglutaminase 2 (TG2) i tolvfingertarmen av aper med gluten enteropati, men ikke hos friske kontroller ble også bemerket [5].
til tross for omfattende studie av kliniske, immunologiske og histopatologiske egenskaper CD, er relativt lite kjent om effekten av glutenintoleranse på andre sykdommer og deres potensielle forholdet. Mangel på kunnskap er tydelig når man prøver å studere de faktorer som utløser overgangen fra ett stadium av sykdommen til en annen. Underliggende genetisk predisposisjon som bare begynte å bli belyst i gluten-sensitive makaker er en annen viktig del av dette komplekse sykdommen. På grunn av et økende antall kliniske rapporter som tyder på sammenheng mellom CD og tarm T-celle lymfomer, adenokarsinomer, diabetes type 1, autisme eller Downs syndrom [9], [10], [11], [12], [13], [ ,,,0],14], [15], [16], er det viktig å fastslå om observasjoner fra ovenstående undersøkelser kan også bli demonstrert på molekylært nivå. Slik forskning bør gi ny leder for eksisterende behandling av ikke bare CD, men også tidligere nevnte sykdommer. For å studere de valgte genet nettverk i gluten-sensitive primat vert, ble en kvantitativ mikromatrise genteknologi og rhesusape modellen som brukes. Det ble antatt at forstyrrelser i kreft-assosiert genet nettverk vil bli sett i gluten-sensitive dyr på scenen for tilbakefall versus stadium av remisjon. Minimal eller ingen forstyrrelser forårsaket av kosttilskudd gluten endringer ble forventet i normal sunn kontroll og gluten-sensitive dyr på scenen for remission.The primære mål var å vise at gluten-sensitive primater svare på kosten gluten endringer med opp /ned-regulering av utvalgte gener og at slike forstyrrelser kan knyttes til økt risiko for andre sykdommer som kreft. Sekundært mål var å finne ut om tilbaketrekking av kosttilskudd gluten er tilstrekkelig til å reversere disse endringene.
Resultater
Økt nivå av plasma AGA og TG2 antistoffer i gluten-sensitive makaker
Uttak av kosttilskudd gluten løser i gluten-sensitive makaker klinisk, histopatologiske samt immunologiske manifestasjoner av sykdommen, inkludert nedgangen av AGA og TG2 antistoffer i plasma [1], [3]. I humane pasienter, er kombinert nærvær av AGA og TG2 antistoffer anses å være en meget nøyaktig prediktor for CD [2]. I denne studien ble overgangen fra GFD til GD ledsaget av signifikant (p 0,05) økning av både AGA og TG2 antistoffer i gluten-sensitive makaker (figur 1). I samsvar med disse og tidligere rapporter, er GFD periode med baseline nivåer av AGA og TG2 antistoffer angitt her som den fasen av immunologiske remisjon, mens GD periode med betydelig økning av AGA og TG2 antistoffer, er indisert som den fasen av immunologiske tilbakefall. I normale, friske kontroll makaker, forble AGA og TG2 antistoffer ved baseline nivå uavhengig av kosten gluten inntaket.
Plasma antistoffresponsen mot gliadin og TG2 ble målt i fire gluten-sensitive (FH45, FB97, DJ68 og DE87) og fire normale, friske kontroll (HK31, HT24, HD60 og IA24) rhesusape på tidspunktet for ettergivelse og /eller tilbakefall. Graf viser fold-økning av antistoffer over baseline ved innføring av kosten gluten. Signifikant (p 0,05). Økninger er angitt (*)
Differensial genuttrykk i tolvfingertarmen av gluten-sensitive makaker
I sammenligning med normale, friske kontroll, gluten-sensitive makaker viste et økt antall differensielt uttrykte gener i fasen av tilbakefall, mens på GD (figur 2). Selv om alle tre testede gluten-sensitive dyr viste et lavere antall differensielt uttrykte gener i den fasen av remisjon, FH45 macaque var den eneste som normalisert sin genuttrykk under GFD behandling til en baseline nivå – sammenlignbar med en sunn kontroll HK31 (Figur 2). Dette var ikke fullstendig uventet ettersom tiden som er nødvendig for å oppnå remisjon kan vesentlig skiller seg i mellom forskjellige individer, som det er påvirket av mange fysiologiske og genetiske faktorer [17], [18].
En kommersiell rhesus-spesifikk gen utvalg ble brukt til å måle differensial genuttrykk i åtte tolvfingertarmen prøver fra fire utvalgte studie makaker: Normal sunn kontroll (HK31), andFH45, FB97 og DJ68 gluten sensitive makaker på stadier av remisjon og /eller tilbakefall. Absolutte tall av forstyrrede gener ut av ~20,000 testet per hver prøve er vist.
Kategorier av forskjellig uttrykt gener
Alle gener med differensial nivå av uttrykk ble videre delt inn i 12 overlappende kategorier : 1- kreft, 2- metabolisme, 3- fordøyelseskanalen funksjon, 4- immunrespons, 5- cellevekst, 6- signaltransduksjon, 7- autoimmunitet, allergi, 8- avgiftning av xenobiotika, 9- apoptose, 10- ikke kjent funksjon, 11- actin-kollagen-MMP-genet nettverk, og 12- neuronal funksjon. Tre kategorier lagt nærmere undersøkelse inkludert: kreft, avgiftning av xenobiotics og aktin-kollagen-MMP-genet nettverk. Disse kategoriene ble valgt basert på deres direkte eller indirekte involvert i kreft progresjon eller undertrykkelse (figur 3 og 4). Siden kreft (kategori 1) gener ble representert av to forskjellige underkategorier dvs. kreft-fremme og kreft-undertrykke og begge disse underkategorier inneholdt opp- og ned-regulerte gener, kategori 1 endte opp med mindre distinkt mønster av differensial uttrykk enn kategori 8 eller 11 (figurene 4 og 5). Kategorier 8 og 11 viste forutsigbart mønster av differensiell ekspresjon i alle tre glutensensitiv makaker: Mens genene som er ansvarlige for avgiftning av xenobiotika var overveiende nedregulert i løpet av tilbakefall (figurene 3 og 4 D, E, F), gener av aktin-kollagen-MMP nettverk ble oppregulert (figur 3 og 4A, B, C).
Valgte tre kategorier av forstyrrede gener i tolvfingertarmen av FH45 gluten-sensitive macaque (normalisert mot normal, sunn kontroll macaque HK31) mens du er på gluten diett . Ulike fargenyanser korrespondere med fire kategorier av forstyrrede gener. Lignende mønstre av genet perturbasjon ble identifisert også i FB97 og DJ68 glutensensitive aper (ikke vist)
1 -. Cancer, 2 – metabolisme, 3 – fordøyelseskanalen funksjon, 4 – immunrespons, 5 – cellevekst, 6 – signaltransduksjon, 7 – autoimmunitet, allergi, 8 – avgiftning av xenobiotika, 9 – apoptose, 10 – ukjent funksjon, 11 – aktin-kollagen-MMP-nettverk, og 12 – neuronal funksjon. Relative distribusjoner av oppregulert genet kategorier vises i paneler A (FH45), B (FB97) og C (DJ68) mens nedregulert genene er vist i paneler D (FH45), E (FB97) og F (DJ68).
Kostholds gluten abstinens påvirker relative fordelingen av perturbed genet kategorier i gluten-sensitive makaker. I tre utvalgte kategorier [1 (kreft), 8 (avgiftning av xenobiotics), og 11 (aktin-kollagen-MMP-nettverket)], inkludert disse endringene redusert antall «kreftfremmende» hendelser som nedregulering av kategori 8 gener og oppregulering av kategori 11 gener. Data generert med FB97 og DJ68 makaker under den fasen av remisjon og tilbakefall er vist. FH45 macaque hadde bare noen få gener forstyrrelser under den fasen av remisjon mens du er på glutenfri diett, er dermed relative genet teller ikke vist for dette dyret.
Effekt av kosttilskudd gluten uttak på differensial genuttrykk
Selv om det var likheter i genuttrykk av tre gluten-sensitive makaker i løpet av tilbakefall stadiet (figur 4), var det også forskjeller i løpet synd scenen (figur 5). Den mest sannsynlige forklaringen på forskjellene er at til tross for at alle tre gluten-sensitive dyr var i immunologisk remisjon ved biopsi prosedyre, de FB97 og DJ68 macaques «differensial genekspresjon var ennå ikke i utgangspunktet, til tross for å ha brukt 10 uker på GFD. Dette var tydeligere ved DJ68 enn i FB97, mens fullstendig grunnlinje, og ingen forstyrrelser ble sett i FH45 macaque under remisjonstrinnet, mens på GFD (figur 2). Forutsigbart, innføring av kosttilskudd gluten resultert i økning av forstyrrede gener i tre testede gluten-sensitive dyr med DJ68 være høyest (figur 2 og 5).
cytokrom P450 familie genet nettverket er nedregulert i gluten-sensitive makaker ved innføring av kosttilskudd gluten
Basert på observasjoner med cøliaki pasienter som viser betydelig nedregulering av CYP3A4 genet, et medlem av P450-familien, samt en økt forekomst av adenokarsinom og lymfom av tynntarmen, det ble spådd at gluten-sensitive makaker ville vise nedregulering av P450 familie gener mens GD. De var ventet å ha relativt normalt uttrykk av disse genene mens på GFD. Differential uttrykk for P450 genet nettverk i alle tre gluten-sensitive makaker fulgt ovenfor prediksjon. P450 genet nettverk av FH45 dyr er vist for illustrasjon (figur 6): Seks av sju forstyrrede gener i P450 nettverket ble nedregulert på scenen for tilbakefall i motsetning til bare to på scenen i remisjon. Det faktum at en (CYP4B1) genet var oppregulert i FH45 under den fasen av tilbakefall illustrerer det komplekse forholdet mellom faktorer assosiert med glutenintoleranse. Siden CYP4B1 metaboliserer kreftfremkallende, er spesielt viktig i nærvær av flere kreftfremmende faktorer dens funksjon.
Innføring av kost gluten (tilbakefall stadium) nedregulerer flere av genene i P450 nettverk mens kost gluten uttak (remisjon scenen) normaliserer sitt uttrykk mot baseline nivå: Expression in FH45 gluten-sensitive macaque viser 5 av 6 opprørt gener blir mer nedregulert i løpet av tilbakefall scenen enn i remisjon scenen. Rød betegner opp-regulering av et gen mens grønne betegner nedregulering, med det standard nivå av ekspresjon bestemt ved HK31 normale, friske kontroll macaque. Intensiteten av fargen representerer størrelsen av endringen i ekspresjon. De heltrukne linjene betyr at genets proteinprodukt direkte påvirker målgenet proteinnivåer, mens stiplede linjene betyr at genets proteinprodukt indirekte endrer målgenet største proteinnivåer gjennom involvering av et mellom gen.
Actin-kollagen-MMP-genet nettverket er forskjellig uttrykt i gluten-sensitive makaker på innføring av kosttilskudd gluten
Dette nettverket regulerer uttrykket av aktin og kollagen som er viktige for sårlegingsprosessen og dannelse av arrvev. En opp-regulering av disse genene var forventet som et mulig kompenserende mekanisme for å reparere vevsskade forårsaket av kronisk betennelsesprosessen og /eller auto-immun reaksjon i tynntarmen. Selv FH45 og DJ68 gluten-sensitive dyr viste flere av disse genene blir oppregulert på scenen for tilbakefall (ikke vist), forskjellen med den fasen av remisjon var ikke så fremtredende som det var i tilfelle FB97 der nesten hele nettverket ble opprørt under scenen for tilbakefall (figur 7). Mens aktin og kollagen differensial genuttrykk var i samsvar med forventet oppregulering og /eller vev dannelse arr, metalloproteinaser de to nøkkel matrise MMP3 og MMP9 ble nedregulert, motsier de ovennevnte «formasjon arrvev» hypotesen.
innføring av kosttilskudd gluten (tilbakefall scenen) opp-regulerer de fleste av aktin og kollagen gener mens MMP3 og MMP9 er nedregulert. Data generert med FB97 gluten-sensitive macaque under den fasen av remisjon og tilbakefall er vist. Rød betegner opp-regulering av et gen mens grønne betegner nedregulering, med det standard nivå av ekspresjon bestemt ved HK31 normale, friske kontroll macaque. Intensiteten av fargen representerer størrelsen av endringen i ekspresjon. De heltrukne linjene betyr at genets proteinprodukt direkte påvirker målgenet proteinnivåer, der som stiplede linjene betyr at genets proteinprodukt indirekte endrer målgenet største proteinnivåer gjennom involvering av et mellom gen.
Flere sykdomsassosierte gener grupper er forskjellig uttrykt i gluten-sensitive makaker
i tillegg til 12 kategorier av forstyrrede gener identifisert i denne studien i gluten-sensitive makaker (figur 4), var det av interesse å identifisere gener som ville knytte denne tilstanden med andre sykdommer enn kreft, som i økende grad rapportert i kliniske studier med cøliakere [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16] . Alle tre testede gluten sensitive makaker viste differensial uttrykk for flere gener som kan knyttes til ikke bare CD, men også med autisme, matallergi, Down syndrom, Alzheimers sykdom, Revmatoid artritt, Parkinsons sykdom og muskeldystrofi (Figur 8). Selv om betydningen av disse funnene må undersøkes nærmere, gir det potensielt ny retning for framtidig forskning om utvikling av ikke-menneskelige primater modeller av ovennevnte sykdommer.
Valgte kategorier (a. Cøliaki, f. Generell gluten følsomhet eller betennelse og c. annen sykdom) av oppregulert gener i tolvfingertarmen av DJ68 og FB97 gluten-sensitive makaker (normalisert mot normal, sunn kontroll macaque HK31) mens du er på glutenholdig kosthold. Ulike fargenyanser korrespondere med ulike kategorier av forstyrrede gener.
aTGM2 = vev transglutaminase 2 funksjoner som cøliaki autoantigen;
bIL17B = IL-17 cytokin rapportert å være produsert i cøliakere, men ikke hos andre pasienter gluten-sensitive;
cMICB = NKG2D ligand foreslo å megle transformasjon av TCR-avhengige CD8 + CTL til TCR-uavhengig (NK-aktig) effektor IELs i cøliaki pasienter;
dIFNg = interferon-gamma blir produsert av T-celler og fremmer gluten peptid fluks over tarmepitelet;
eITGAE dvs. CD103 antigen ble foreslått å megle cøliaki spesifikke autoimmun reaksjon i tynntarmen.
Mamu II
sammensetningen av gluten-sensitive makaker
Selv om alle fire gluten-sensitive makaker tildelt for denne studien hadde antistoffer i løpet av tilbakefall scenen mot ikke bare gliadin, men også TG2 (autoantigen), deres
Mamu II product: (
DQA1
,
DQB1 Hotell og
DRB
) allel sammensetning viste seg å ikke være ensartet (tabell 1). Dette muligens indikerer at glutenintoleranse er i rhesusape enten a) assosiert med mer enn en
MHC II
allel på grunn av en høyere mangfold og et bredere repertoar av
Mamu II
enn
HLA II product: [19], [20] eller b) gluten-følsomhet er hos aper ikke genetisk knyttet til
Mamu II
. Ytterligere studier er for tiden i gang med større antall gluten-sensitive makaker å belyse dette spørsmålet.
Diskusjoner
En gluten-sensitive rhesusape modellen ble brukt til å studere differensial genekspresjon indusert av GD. I tillegg ble potensielt forhold mellom gluten følsomhet og kreft undersøkes. Selv om det er økende antall kliniske rapporter som tyder på en slik sammenheng i cøliaki pasienter, studier som fokuserer på molekylære mekanismer som knytter disse forholdene er fraværende. Som beskrevet i tidligere rapporter, til administrering av GFD eller GD glutensensitiv rhesusape er forbundet med fravær eller nærvær av serien av det kliniske, histopatologiske, metabolske og immunologiske symptomer, kollektivt referert til som stadier av remisjon eller tilbakefall, henholdsvis [1] , [3], [4], [5]. I samsvar med våre nylige studier, gluten-sensitive og kontroll makaker ble valgt ut fra den større kohort av 500 kandidat dyr basert på tilstedeværelse av plasma AGA og TG2 antistoffer [5]. Siden kombinert nærvær av AGA og TG2 antistoffer anses hos mennesker som svært pålitelig prediktor for CD [2], [21], er det viktig å understreke at alle fire gluten-sensitive makaker i denne studien hadde både AGA og TG2 antistoffer. I motsetning til våre tidligere arbeid [1], [5], histopatologiske tegn ble ikke brukt som prediktorer for glutenintoleranse siden slimhinneskader ikke var gjenstand for denne studien.
Siden det er en økende bevis tyder forening mellom CD, tarm kreft og andre sykdommer, tok vi nytte av rhesusape modell av glutenintoleranse å belyse A) dersom særlige forhold kan oppdages på genuttrykk nivå, og B) om endringer i kosten gluten inntak innflytelse valgt genuttrykk. Mot dette formål, vi hovedsakelig benyttet en rhesus-spesifikk microarray kan måle uttrykket av over 20.000 gener i en vevsprøve. Differentially forstyrrede gener ble klassifisert i 12 overlappende kategorier, inkludert tre hovedkategorier av interesse: kreft, avgiftning funksjon, og aktin-kollagen-MMP-gener. I tillegg differensielt uttrykte gener som tidligere var rapportert å være forbundet med forskjellige andre sykdommer ble også identifisert (figur 8).
Tarm cytokrom P450-gener som CYP3A4 deltar i metabolismen av xenobiotika for å redusere deres bivirkninger. Imidlertid er uttrykk for CYP3A4 i cøliaki pasienter betydelig redusert sammenlignet med friske voksne [22], [23]. Videre viser CD-pasienter økt forekomst av intestinal T-cellelymfom og adenokarsinom [17], [18]. Derfor kan de reduserte nivåene av cytokrom P450 øke biotilgjengeligheten av xenobiotika i celiacs, og dermed øke forekomsten av xenobiotiske-indusert kreft progresjon. For å finne ut om hypotesen ovenfor kan tenkes i studier med gluten-sensitive rhesusape, ble uttrykket av cytokrom P450-gener sammen med andre «kreft-assosiert» gener målt i tolvfingertarmen biopsier oppnådd ved stadier av remisjon og tilbakefall. Det ble spådd at mangel på cytokrom P450 genuttrykk reverseres ved tilbaketrekking av kosttilskudd gluten – ved å plassere gluten-sensitive makaker på GFD. Resultatene fra denne studien viser tydelig at nedregulering av cytokrom P450-genet nettverk oppstår i gluten-sensitive makaker mens på GD. Det ble også observert at slik nedregulering blir forbedres ved GFD behandling selv om fullstendig reversering til et nivå sammenlignbart med normal frisk person ble oppnådd bare i en av tre glutensensitiv aper testet av mikromatriser. Det er sannsynlig fra genererte resultater som hvis glutensensitiv makaker ville være holdt på GFD for en lengre periode, gjenværende to dyr ville fortsette å reversere cytokrom P450 nedregulering. Cytokrom P450-gen nettverk nedregule Parallelt med generell opp-regulering av aktin-kollagen-MMP-genet nettverk. I samsvar med våre funn, ble det rapportert at opp-regulering av aktin og collagen under samtidig nedregulering av MMP3 og MMP9 oppstår som et tiltak for å forebygge kreft formasjonen i eksperimentelt-behandlede mus [24]. Etter dette ble det observert i FB97 macaque i løpet av tilbakefall, er det sannsynlig at genet forstyrrelser i aktin-kollagen-MMP nettverket som er indikativ for en beskyttende medfødt respons mot kreft invasjon i det minste noen av de glutensensitiv primater (figurene 3 og 7).
til tross for forutsigbare mønstre av differensial genuttrykk i nevnte kategori 8 (avgiftning) og 11 (aktin-kollagen-MMP) gener, kategori 1 (kreft) ikke følger et slikt mønster, på grunn av høy kompleksitet genet interaksjoner i denne kategorien, med flere kreftfremmende og -suppressing gener blir samtidig påvirket av kosttilskudd gluten endringer. Tatt sammen med kategori 8 og 11 genuttrykk resultater imidlertid våre resultater viser at tilbakefall stadiet av glutenintoleranse i rhesusape fremmer tumorigenesis og det kan delvis reverseres ved tilbaketrekking av kosttilskudd gluten.
Mange spørsmål gjenstår . Noen av disse er på grunn av vår ufullstendig kunnskap om rhesusape klasse II alleler er assosiert med glutenintoleranse på en måte analogt til menneskelige cøliaki pasienter dvs.
DQ2 /8
alleler [2], [18], [25] [26]. Vår nåværende modellen bare kan betegnes som «gluten følsomhet» modellen, husk at det er minst to kategorier av glutenintoleranse hos primater: første som er
Mamu II
-avhengig (CD-lignende), mens andre er
Mamu II
-uavhengig (matallergi-lignende). Våre resultater som involverer genetisk analyse av 50 + rhesusape med og uten gluten følsomhet tilsier at en
Mamu II
-associated predisposisjon for denne tilstanden eksisterer i rhesusaper [Sestak et al., Upublisert]. Relativt høy variasjon i differensial genet distribusjon i denne studien kan derfor forklares med ulike
Mamu II
bakgrunn i utvalgte gluten-sensitive dyr (tabell 1). For å forbedre den rhesus modell av gluten følsomhet og for å gjøre det mer aktuelt som et CD-modell, valg av glutensensitiv makaker vil trenge å bli utført i fremtiden også i sammenheng med
MamuII
pre-screening . Våre resultater tyder på at CD, matvareallergi og andre sykdomstilstand assosierte gener inkludert kreftrelatert de er forskjellig uttrykt i gluten-sensitive makaker. Til slutt, resultatene som er rapportert her viser at over genet forstyrrelser bedres og selv opphevet av kosten gluten trekning. Disse resultatene kan brukes som en plattform for fremtidige studier som tar sikte på klarlegging av forholdet mellom CD og kreft.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Godkjenning for alle veterinær prosedyrer i denne studien hadde blitt hentet fra Tulane University Animal Care og bruk Committee (Protocol # 3508), Animal Welfare Assurance A-4499-01. Dyr i dette prosjektet var under full omsorg for veterinærer i Tulane National Primate Research Center i samsvar med standarder innlemmet i Guide til Care og bruk av forsøksdyr (NIH) 78-23 (revidert 1996). Alle veterinær prosedyrer ble utført bare med bedøvet dyr. Dyrevelferd og skritt ble tatt for å bøte lidelse i tråd med anbefalingene fra Weatherall rapporten.
Dyr og dietter
Fire gluten-sensitive (FH45, DJ68, DE87 og FB97) og fire normal , sunn kontroll (HK31, HT24, HD60 og IA24) rhesusape (
Macaca mulatta
) av indiske underarter, 2-9 år, simian retrovirus-frie, av begge kjønn ble brukt i denne studien. Siden forekomsten av gluten følsomhet hos aper er lik den for mennesker, ble glutensensitiv dyr som er valgt fra større kohort av 500 kandidater, som beskrevet i detalj andre steder [5]. Gluten-sensitive makaker ble skilles fra normale, sunne seg ved tilstedeværelse av både anti-gliadin (AGA) og anti-vev transglutaminase 2 (TG2) serum antistoff. Alle glutensensitiv dyr ble holdt i minst 10 uker på glutenfri diett (GFD), etterfulgt av 10 uker med regelmessig, glutenholdig chow (GD) (PMI Nutrition Intl., St. Louis, MO), for å oppnå stadium av remisjon og tilbakefall. Overgangen av GFD til GD ble karakterisert ved signifikant (p 0,05) økning av AGA og anti-TG2 serum antistoff over grunnlinjen (figur 1). Ved normale, friske kontrolldyrene var antistoffnivåer alltid i baseline uavhengig av kosten gluten inntak.
Tynntarmen og perifer blodprøve samling
To ml perifert blod ble samlet på scenen for remisjon og /eller tilbakefall fra alle dyr som beskrevet [5]. I tillegg ble prøve av distal tolvfingertarmen (fem pin-head store biopsier) samlet på scenen i remisjon og tilbakefall fra tre gluten-sensitive dyr med høyest nivå av antistoffer øker (figur 1) ved pediatrisk endoskop som beskrevet [5]. Ved sunn kontroll dyr (HK31), ble endoskopi prosedyren også utført to ganger parallelt med prosedyrer gjort i gluten-sensitive dyr til tross for at ingen tilbakefall stadium preget av betydelig antistoff økning var til stede i HK31 i forbindelse med innføring av kosttilskudd gluten (figur 1 ). Alle innsamlede biopsiprøver ble umiddelbart plassert i fem ml RNA-senere-løsning (Qiagen, Valencia, CA) for å bevare RNA. Blod ble behandlet for å ekstrahere plasma, som ble lagret ved -20 ° C og testet ved indirekte ELISA for tilstedeværelse av anti-gliadin og anti-TG2-antistoffer [1].
RNA-isolering, cDNA-syntese
Total RNA ble ekstrahert fra tarm biopsier bruker Qiagen’sRNeasy pluss micro kit, etter instruksjoner om produsenten. En tapp-head-størrelse biopsi av fem oppsamlet var tilstrekkelig til å isolere den nødvendige mengden av RNA ved bruk av RNeasy kit.NanoDrop spektrofotometer (Thermo Scientific, Wilmington, DE) ble brukt for å måle den RNA-konsentrasjon og renhet. Totalt RNA ble brukt til å utføre cDNA-syntese og cyanin fargestoff merking som tidligere beskrevet [27], ved bruk av Agilent lav RNA inngang Linear Amplification-Labeling Kit (LRILAK). Det merket cDNA ble brukt til å utføre over natten hybridisering til Agilent rhesusape hele genomet microarray, i henhold til produsentens instruksjoner [28].
microarray prosedyren og genuttrykk
En kommersielt tilgjengelig oligonukleotid rhesusape hele genom Microarray omfatter ~20,000 målgener (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) ble brukt. Arrays ble skrevet ut med 4 × 44 k format (Agilent Technologies). Platene ble vasket i henhold til produsentens instruksjoner og deretter avbildes bruker GenePix Pro 6.1 software. Enkeltmålinger ble registrert i minst to dubletter. Den resulterende.
gal
filene ble analysert ved SpotfireDecisionSite, microarray analyse modul (TIBCO-Spotfire, Boston MA) som tidligere beskrevet [28]. Etter fjerning av upålitelige flekker, ble data normalisert ved hjelp av en lokalt Weighted spredningsplott Smoothing (LOWESS) algoritme og de resulterende forholdene mellom forandring i gen-ekspresjon ble tatt opp med en logaritmen til to skala [28]. Hvert sett av differensielt uttrykte gener inneholdt både «oppregulert» og «nedregulert» seg.
