Abstract
Bakgrunn
Claudins er membran proteiner som spiller avgjørende roller i tett veikryss (TJ) dannelse og funksjon. Medlemmer av claudin genet familien har vist seg å være abnormt regulert, og til å delta i patogenesen av ulike kreft hos mennesker. I denne studien rapporterer vi at claudin-11 (
CLDN11
) er brakt til taushet i magekreft
via
hypermethylation av sin promoter regionen.
metodikk /hovedfunnene
Nivåer av
CLDN11
metylering og mRNA uttrykk ble målt i primær mage kreft vev, noncancerous mage slimhinner, og cellelinjer av mage opprinnelse ved hjelp av kvantitativ metylering spesifikke PCR (qMSP) og kvantitativ revers transkriptase-PCR (QRT-PCR), respektivt. Analyser av sammenkoblede mage kreft og tilstøtende normale mage vev avslørte hypermethylation av
CLDN11
promoter-regionen i mage kreft, og dette hypermethylation var signifikant korrelert med nedregulering av
CLDN11
uttrykk
vs.
normalt vev.
CLDN11
promoter-regionen ble også hypermethylated i alle magekreftcellelinjer testet i forhold til udødelig normale mage epitelceller. Videre
CLDN11
mRNA uttrykk ble omvendt korrelert med sin metylering nivå. Behandling av
CLDN11
-nonexpressing magekreftceller med 5-aza-2′-deoxycytidine restaurert
CLDN11
uttrykk. Videre siRNA-mediert knockdown av
CLDN11
uttrykk i normale mage epitelceller økt bevegelighet og invasivitet.
Konklusjon /Betydning
Disse dataene tyder på at hypermethylation av
CLDN11
, som fører til downregulated uttrykk, bidrar til magekreftutvikling ved å øke celle motilitet og invasivitet. En videre forståelse av mekanismene bak rollen claudin proteiner i magekreftutvikling vil trolig bidra til identifisering av nye tilnærminger for diagnostisering og behandling av magekreft
Citation. Agarwal R, Mori Y, Cheng Y, Jin Z, Olaru AV, Hamilton JP, et al. (2009) stanse av claudin-11 er assosiert med økt Invasivitet av Gastric kreftceller. PLoS ONE 4 (11): e8002. doi: 10,1371 /journal.pone.0008002
Redaktør: Fatah Kashanchi, George Washington University School of Medicine, USA
mottatt: 03.08.2009; Godkjent: 23 oktober 2009; Publisert: 24.11.2009
Copyright: © 2009 Agarwal et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av USA National Institutes of Health gir CA085069, CA138677 og CA146799 til SJ Meltzer. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP (GC) er fortsatt den nest mest vanlige årsaken til kreft dødsfall globalt. Det er en av de mest dødelige kreftformer og en ledende årsak til kreft dødsfall i utviklingsland, med samlede 5-års overlevelse under 20% [1], [2].
Studier av GCer og deres preneoplastiske forløper lesjonene har identifisert flere genetiske og epigenetiske endringer, inkludert mikro ustabilitet, punktmutasjoner, og tap av heterozygositet (LOH) som påvirker tumorsuppressorgener (TSGs) [3] – [6]. Likevel er den molekylære patogenesen av GC fremdeles ufullstendig forstått.
epigenetiske forandringer er ekstremt viktig i kreftutvikling og progresjon [7]. Transcriptional inaktivering av tumorsuppressorgener via avvik arrangøren hypermethylation av CpG øyer, forårsaker permanent genet stanse, er en stor epigenetisk mekanisme TSG inaktivering.
Tidligere studier har blitt publisert på arrangøren hypermethylation i GCer og deres premaligne forløpere [ ,,,0],8] – [10]. p16INK4a og p15INK4B var blant de første gener vise hypermethylation i GCer [11]. Vår gruppe og andre senere oppdaget hypermethylation av hMLH1 DNA misparringssystemet i GCer stille hyppige mikro ustabilitet (MSI-H) [12] – [14]. Vi viste også at hypermethylation av E-cadherin (CDH1) genet forekommer hyppig i GCer [15].
En pilot microarray-baserte genom-wide søk utført av vår gruppe, utført for å oppdage nye epigenetiske forstummet gener i magekreftutvikling, identifisert claudin-11 (
CLDN11
), en tight junction (TJ) protein, som et potensielt mål for epigenetisk inaktivering i mage kreft (upubliserte data).
claudin-11 tilhører til familien av claudin proteiner, som inneholder mer enn 23 medlemmer. Medlemmer av familien claudinet blir uttrykt i et høyt vev-spesifikk måte i en rekke normale og neoplastiske vev [16]. Claudins er transmembrane proteiner som spiller viktige roller i TJ dannelse og funksjon. TJS er intercellulære overganger kritiske i paracellulær transport av oppløste stoffer, så vel som å opprettholde celle polaritet. Tumorceller som vanligvis utviser strukturelle og funksjonelle mangler i deres TJS [17].
I de senere årene har en rekke studier har vist avvikende ekspresjon av claudin-proteiner i forskjellige krefttyper [18], [16]. Flere av disse studiene fant feilregulering av claudin protein uttrykk
via
promoter hypermethylation. Hypermethylation-indusert stanse av claudin-7 uttrykk ble tidligere rapportert i bryst [19] og tykktarms [20] karsinomer. Claudin-6 er også epigenetiske forstummet i brystkreft [21], mens Claudins -3 og -4 er epigenetiske regulert i eggstokkreft celler [22], [23].
Den aktuelle studien identifiserer og rapporter til vår kunnskap for første gang, at
CLDN11
promoter regionen er hypermethylated i GC vev og cellelinjer. Videre, mens
CLDN11
mRNA ble uttrykt i alle primære noncancerous gastrisk slimhinnevevet, samt i en immortalisert normal gastrisk epitel cellelinje, ble det brakt til taushet i alle GC vev og cellelinjer undersøkt. Interessant, siRNA-mediert nedregulering av
CLDN11
i
CLDN11
-expressing mage celler ble også assosiert med kreft-relaterte fenotypiske endringer, spesielt økt cellemotilitet og invasivitet.
Materialer og metoder
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP og klinisk vevsprøver
udødeliggjort menneskelige normale mage epitelceller (HFE145) ble hentet fra Dr. Duane T. Smoot (Howard University) og GC cellelinjer AGS, SIIA, MKN28, KATOIII, og SNU-1 ble erholdt fra ATCC. Alle cellelinjer ble dyrket og opprettholdt i RPMI 1640-medium supplert med 10% føtalt bovint serum og 1% antibiotisk-antimykotisk oppløsning (Invitrogen).
koblede primær- gastriske normale og tumorvev ble oppsamlet ved Johns Hopkins Hospital ( JHH). Prøvene var snap-frosset umiddelbart etter reseksjon.
Etikk erklæringen
Johns Hopkins University (JHU) Institutional Review Board (IRB) godkjennelse ble innhentet for alle sakene som inngår i studien. Tilfeller ble hentet fra JHU kirurgisk patologi henhold JHU IRB-godkjent fritak 02-07-19-05e under regel 45 CFR 46,101 (b), som gir avkall på kravene for å få pasienten samtykke.
Rensing og behandling av Genomisk DNA og Total RNA
Genomisk DNA ble ekstrahert fra snap-frosne vevsprøver eller cellelinjer ved hjelp av en DNeasy Blood Tissue Kit (Qiagen, Valencia, CA) i henhold til produsentens protokoll. Total RNA ble ekstrahert med Trizol reagens (Invitrogen). Hentet DNA og RNA ble kvantifisert ved hjelp av en Nanodrop ND-1000 spektrofotometer (Nanodrop, Wilmington, DE).
Kvantitativ Metylering Spesifikke PCR (qMSP) for claudin-11
Genomisk DNA hentet fra 36 pasientprøver som omfatter 18 GC og 18 passet noncancerous mageslimhinne (NS) vev, så vel som fra forskjellige gastriske cellelinjer, ble utsatt for qMSP. qMSP ble utført som beskrevet tidligere, med mindre modifikasjoner [24]. I korte trekk, ble bisulfitt behandling av genomisk DNA utføres ved hjelp av en EpiTect Bisulfite Behandling Kit (Qiagen, Valencia, CA). En MSP amplicon og TaqMan probe for å oppdage helt metylert DNA ble utformet for å inkludere flere CpG steder i 5′-UTR regionen
CLDN11
genet.
CLDN11
-spesifikke primere og probe sekvenser brukt var: forover primer 5 «CGCGATTGGTCGGCGCGTTTC 3′; revers primer 5»-GACGAAAACAACAACGCTACT 3 «; TaqMan probe 5’TCGGAGTCGCGGGGTTTAAAGAG 3 «. CpGenome Universal denaturert DNA (Chemicon International, Temecula, CA) tjente som en positiv kontroll, og serielle fortynninger av den ble brukt til å plotte en standardkurve. qMSP med TaqMan probe ble utført på en iQ5 termosykler (BioRad, Hercules, CA) ved hjelp av iQ Supermix (
ibid.
). Femti sykluser med PCR-amplifikasjon som starter med 50 ng av bisulfitt-behandlede genomisk DNA ble utført in triplo, i henhold til produsentens protokoll. Duplex PCR med β-aktin (ACTB) primer og probe sekvenser som inneholder ingen CPGs ble utført for normalisering. De primer og probe sekvenser som ble brukt var som publisert tidligere [24]. Normalisert metylering verdi (NMV) ble definert som følger: NMV = (
CLDN11-S Twitter /
CLDN11-FM
) /(
ACTB-S Twitter /
ACTB -FM
) * 100, der
CLDN11-S Hotell og
CLDN11-FM
representere
CLDN11
metylering nivåer i utvalget og fullt denaturert DNA, henholdsvis, mens
ACTB-S Hotell og
ACTB-FM
tilsvarer
β-aktin
i prøven og fullt denaturert DNA, henholdsvis. Hel-genomet forsterket DNA (WGA) ble brukt som en unmethylated negativ kontroll.
Kvantitativ Reverse Transcription-PCR analyse
CLDN11
RT-PCR fragment ble designet for å overlappe et intron-ekson grense for å utelukke genomisk DNA (
g
DNA) forsterkning. Primer sekvenser ble så publisert tidligere [18]. Ett-trinns QRT-PCR ble utført som beskrevet tidligere [24], ved bruk av en Quantitect SYBRA RT-PCR kit (Qiagen, Valencia, CA) ifølge produsentens protokoll.
CLDN11
uttrykk var normalisert til
β
aktin uttrykk. Total RNA fra HFE145 celler ble benyttet for standardkurven. (
CLDN11-S Twitter /
CLDN11-C
) /(
ACTB-S Twitter /
ACTB-C
), der
CLDN11- S Hotell og
CLDN11-C
representere
CLDN11
mRNA uttrykk nivåer i prøven og kontroll mRNA, henholdsvis, mens
ACTB-S Kjøpe og
ACTB -C
tilsvarer
p-aktin
uttrykk nivåer i prøven og kontroll mRNA, henholdsvis.
5-Aza-2′-Deoxycytidine (5-Aza-dC) Behandling
AGS er en GC cellelinje manifestere hypermethylation av
CLDN11
arrangøren i forbindelse med fraværende
CLDN11
mRNA uttrykk. 5-aza-2′-deoxycitidine (5-aza-dC) behandling av cellene ble utført som beskrevet tidligere [24]. I korte trekk, ble GC-cellelinjen AGS (ATCC katalognummer CRL-1739) sådd ut ved en tetthet på 2 x 10
5 celler /ml i T-75-kolbe. Tjuefire timer senere ble cellene behandlet med 1 pM 5-aza-dC i 72 timer. Media som inneholder 5-aza-DC ble erstattet med nylagde media hver 24. time. Cellene ble deretter høstet for total RNA ekstraksjon. Totalt RNA fra AGS celler før og etter fem-aza-dC behandling ble utsatt for kvantitativ real-time RT-PCR-analyse.
Små interfering RNA Knockdown Eksperimenter
CLDN11
-spesifikke siRNA oligonukleotider ble kjøpt fra Ambion, Inc. (Austin, TX). Den HFE145 cellelinje, som er
CLDN11
positiv, ble valgt for å studere effekten av claudin-11 knockdown på migrering og invasjon egenskaper av gastriske celler. Forsøk ble utført som beskrevet tidligere (Agarwal
et al.
, 2005). Celler dyrket i 6-brønners plater ble transfektert med siRNA tomannsboliger ved hjelp LipofectAMINE 2000 (Invitrogen), etter produsentens anvisninger. Mock-transfections og uspesifikke siRNA tomannsboliger ble brukt som negative kontroller. Cellene ble behandlet i 48 til 72 timer for å tillate maksimal knockdown, hvoretter de ble høstet enten for Western blot-analyse eller brukes for migrering og invasjon analyser.
Western blot-analyse av claudin-11 i Gastric Cellelinjer
Sammenflytende cellekulturer ble vasket med HBSS (Invitrogen) og helcellelysater ble gjort ved hjelp av lyseringsbuffer: 62,5 mmol /L Tris-HCl (pH 6,8), 10% glycerol, og 2% SDS. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved anvendelse av en bicinchoninic syre (BCA) assay kit (Pierce, Rockford, IL). Tyve mikrogram av totalt protein ble separert ved 10% til 20% SDS-PAGE på Tris-glysingeler (Invitrogen) og overført til polyvinylidendifluorid-membraner (Millipore Corp., Bedford, MA). Membranene ble blokkert med 5% fettfri tørrmelk, vasket i TBST-buffer, og probet med et anti-claudin-11-antistoff (Zymed, San Francisco, CA). Blottene ble deretter vasket og inkubert i pepperrot-peroksidase-konjugert sekundært antistoff (anti-kanin-IgG: 1:10,000; Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). For deteksjon, ble chemiluminescence utført ved hjelp av en forbedret kjemiluminescens (Amersham Pharmacia Biotech).
Cell Invasion og migrasjon analysen
Invasivitet av siRNA-transfekterte celler ble bestemt ved hjelp av Matrigel-belagte invasjon kammerinnsatser (24-brønns-format med 8-um porer, BD Biosciences) ved bruk av et modifisert Boyden kammer analyse [25]. Celler ble dyrket til tilnærmet 80% konfluens, og serum-sultet over natten. På dagen for analysen ble cellene trypsinert og levedyktige celletelling tatt. Ca. 50.000 celler ble sådd ut på toppen av hver av hvert filter i serumfritt medium. Et like stort volum av det samme medium inneholdende 20% FCS ble plassert i det nedre kammer (
d.v.s..
, I brønnen under filter) for å virke som et kjemotiltrekkende. Analyseplatene ble inkubert ved 37 ° C i opp til 48 timer. Celler som ikke vandrer eller invadere gjennom porene i Transwell inserts ble manuelt fjernes med en bomullspinne. Celler tilstede på bunnen av membranen ble fiksert i kald metanol i 10 minutter og deretter farget med 0,01% krystallfiolett i 20% etanol. Etter 10 minutters inkubasjon ble filtrene vasket grundig i vann og suspendert i 200 ul av 5% eddiksyre og 5% metanol. Kolorimetriske målinger ble tatt på OD
595. Forsøkene ble gjentatt minst tre ganger, med tre paralleller i hvert eksperiment. For å vurdere cellemigrasjon, ble analysene utføres hovedsakelig som ovenfor, bortsett fra at cellene ble sådd ut på toppen av ubestrøket (Matrigel fritt) innsatser.
Statistical Analysis
statistiske analysene ble utført ved hjelp av Student t -test (SPSS, versjon 16), med
p
. 0,05 anses statistisk signifikant
Resultater og diskusjon
Vi testet først vår hypotese at
CLDN11
promoter er hypermethylated og at dette hypermethylation korrelerer inverst med
CLDN11
mRNA uttrykk i grunnskolen GC vev. Sammenkoblede primære mage normale og tumorvev ble samlet ved Johns Hopkins Hospital (JHH). Prøvene ble tatt umiddelbart etter reseksjon og snap-frosset inntil bruk. Kun saker som oppnås med informert samtykke som er godkjent av Institutional Review Board (IRB) ble inkludert i dette prosjektet. Genomisk DNA ble erholdt fra de 36 kliniske prøver, omfattende 18 GC og 18 passet noncancerous gastrisk slimhinne (NS) vev.
CLDN11
arrangøren metylering nivåer i disse prøvene ble analysert ved hjelp av kvantitativ real-time metylering spesifikke PCR (qMSP). Figur 1A viser den normaliserte verdi metyleringen (NMV),
d.v.s..
, Forholdet mellom metylert verdien av
CLDN11
promoter region i hver prøve til en fullt metylert kontroll DNA.
CLDN11
NM
Vs
var signifikant høyere i GC eksemplarer enn i sine matchende NS vev (
P
0,001). For å vurdere om
CLDN11
promoter hypermethylation i GCer var forbundet med å stanse all
CLDN11
uttrykk,
CLDN11
mRNA nivåer ble målt ved hjelp av kvantitativ real-time (QRT-PCR) i RNA hentet fra de 36 prøvene som brukes for metylering analyse. Som vist i figur 1B, normaliserte uttrykk verdier (Nevs) på
CLDN11
i GC-prøver var betydelig lavere enn i sammenkoblet NS prøver (
P
0,001). Denne informasjonen fastslår at
CLDN11
arrangøren hypermethylation korrelerer med redusert eller taushet
CLDN11
mRNA uttrykk i grunnskolen GCer.
Denne figuren illustrerer arrangøren metylering og mRNA uttrykk nivåer av
CLDN11
i paret magekreft (GC) og noncancerous mage mucosal (NS) vev. A) Kvantitativ metylering spesifikke PCR (qMSP) for
CLDN11
i grunnskolen vev. Genomisk DNA ekstrahert fra 18 GC og 18 matchede NS vev ble utsatt for qMSP analyse ved hjelp MSP amplicon og TaqMan probe utformet for å inkludere flere CpG steder i 5′-UTR regionen
CLDN11
genet. CpGenome Universal denaturert DNA (Chemicon International, Temecula, CA) ble anvendt som en fullstendig denaturert positiv kontroll. Duplex PCR med β-aktin (ACTB) primer og probe sekvenser som inneholder ingen CPGs ble utført for normalisering. Normalisert metylering verdi (NMV) ble definert som følger: NMV = (
CLDN11-S Twitter /
CLDN11-FM
) /(
ACTB-S Twitter /
ACTB -FM
) * 100, der
CLDN11-S Hotell og
CLDN11-FM
representere
CLDN11
metylering nivåer i utvalget og fullt denaturert DNA, henholdsvis, mens
ACTB-S Hotell og
ACTB-FM
tilsvarer
β-aktin
i prøven og fullt denaturert DNA, henholdsvis. Dette endimensjonal spredningsplott viser betydelig høy
CLDN11
arrangøren metylering nivåer i GC eksemplarer sammenlignet med NS prøver (
P
0,001
). Hel-genomet forsterket DNA (WGA) brukes som en unmethylated negativ kontroll viste ingen forsterkning.
P
verdi ble beregnet ved hjelp av paret t-test. B)
CLDN11
mRNA uttrykk i mage vev. Total RNA ekstrahert fra 18 sammenkoblede NS og GC prøvene ble utsatt for
CLDN11
spesifikke RT-PCR.
CLDN11
mRNA uttrykk var normalisert til
β
aktin mRNA uttrykk i hver prøve.
P
verdi ble beregnet ved hjelp av paret t-test. Denne tomten viser at
CLDN11
mRNA uttrykk nivåer var signifikant lavere for ikke-detekterbare i GC prøver, mens de fleste av de tilsvarende NS prøvene hadde påvisbare
CLDN11
mRNA nivåer (
P
0,001
). C) 2D-spredningsplott av arrangøren metylering og mRNA uttrykk verdier i GC vev.
CLDN11
mRNA uttrykk lyddemping er assosiert med arrangøren hypermethylation i GC pasienter. Denne to-dimensjonale spredningsplott viser NEV verdier (Y-aksen) og NMV verdier (X-aksen) i de 18 sammenkoblede NS og GC prøver.
Neste, vi evaluert
CLDN11
promoter metylering og uttrykk i mage cellelinjer. Udødeliggjort menneskelige normale mage epitelceller (HFE145) og GC cellelinjer AGS, SIIA, MKN28, KATOIII, og SNU-en ble studert. Alle GC cellelinjer som ble testet (AGS, SIIA, MKN28, KATOIII, og SNU-1) viste promoter hypermethylation, mens ingen metylering ble observert i udødeliggjort normale HFE145 celler (Figur 2A).
CLDN11
mRNA-nivåer ble vurdert ved hjelp av QRT-PCR på RNA renset fra cellelinjene, mens claudin-11-protein-ekspresjon ble analysert ved Western blotting. Som vist i figur 2B, alle 5 kreft linjer viste ingen påvisbare uttrykk for
CLDN11
mRNA eller protein, mens HFE145 celler manifestert høye
CLDN11
uttrykk nivåer. Dette funnet fastslår at
CLDN11
er coordinately hypermethylated og nedregulert i GC cellelinjer i forhold til normale mage epitelceller (NGECs).
Denne figuren illustrerer claudin-11 promoter metylering, mRNA uttrykk nivåer og protein uttrykk i mage cellelinjer. A) Kvantitativ metylering spesifikke PCR (qMSP) for
CLDN11
. Genomisk DNA isolert fra udødeliggjorte humane normale mage epitelceller (HFE145) og GC cellelinjer AGS, SIIA, MKN28, KATOIII, og SNU-en er hentet fra ATCC ble analysert ved qMSP. Denne figuren illustrerer at promoter-regionen i
CLDN11
genet er hypermethylated i alle GC cellelinjer i forhold til HFE145 celler. B)
CLDN11
mRNA uttrykk i mage cellelinjer. Total RNA fra forskjellige gastriske cellelinjer ble underkastet kvantitativ sanntids RT-PCR-analyse. Som det kan ses på denne figuren, HFE145 celler uttrykte svært høye nivåer av
CLDN11
mRNA, mens alle fem cancercellelinjene som ble testet hadde svært lav eller upåviselig
CLDN11
mRNA-ekspresjon. C) Western blot-analyse av claudin-11 ekspresjon i gastriske cellelinjer. Totale cellelysater erholdt fra forskjellige gastriske cellelinjer ble probet med anti-claudin-11-antistoff. Denne figuren illustrerer at mens immortalisert normal gastrisk epitelcellelinje, HFE145, uttrykt rikelig claudin-11-proteinet, kunne det ikke påvises i forskjellige GC cellelinjer. Anti-β-actin antistoff ble brukt som en lasting kontroll.
For ytterligere å validere stanse av
CLDN11
uttrykk ved hypermethylation, vi behandlet GC cellelinje AGS med demethylating agent, 5-aza-2-deoksycytidin (5-aza-dC, 1 uM), for varierende tidsintervaller. Totalt RNA hentet før
vs.
Etter behandling ble utsatt for QRT-PCR for
CLDN11
. Som det kan ses på figur 3, ved hvert tidspunkt,
CLDN11
mRNA ble re-uttrykkes ved behandling med 5-aza-dC, som bekrefter at
CLDN11
er slått av ved promoter hypermethylation i AGS GC-celler.
AGS er en GC cellelinje manifestere hypermethylation av
CLDN11
arrangøren i forbindelse med fraværende
CLDN11
mRNA uttrykk. Disse cellene ble behandlet med 5-aza-dC, en global demethylating middel. Total RNA fra AGS celler før og etter fem-aza-dC behandling ble utsatt for kvantitativ real-time RT-PCR-analyse for
CLDN11
mRNA uttrykk.
Y-aksen
representerer den gjennomsnittlige ganger endring i ekspresjonsnivåene av
CLDN11
mRNA etter 5-aza-dC behandling ved forskjellige tidspunkter, sammenlignet med de ubehandlede celler. AGS-celler, når de ble behandlet med 5-aza-dC, viste en tidsavhengig økning i
CLDN11
mRNA-ekspresjon opptil 72 timer med behandling. Denne restaureringen av
CLDN11
uttrykk etter 5-aza-dC behandling støtter vår hypotese om at claudin-11 er brakt til taushet av arrangøren hypermethylation i GC-celler.
Medlemmer av claudin protein familien har vært implisert i regulering av celle adhesjon, invasjon og migrering av kreftceller [25] – [27]. Derfor vi neste undersøkt om
CLDN11
påvirkninger cellemotilitet eller invasivitet. HFE145 celler som uttrykker rikelig
CLDN11
, ble valgt for å studere effekter av
CLDN11
knockdown på invasive og trekkende egenskaper av mage epitelceller. Forbigående siRNA transfections ble utført ved hjelp av
CLDN11-
spesifikke siRNA tomannsboliger. Transfeksjon med
CLDN11
-spesifikke siRNA tomannsboliger effektivt undertrykt claudin-11 protein nivåer av 90%, mens uttrykk forble uendret i mock- eller kontrollere siRNA-behandlede celler (figur 4A). Celle motilitet og invasjons analyser ble utført på siRNA-transfekterte celler ved anvendelse av et modifisert Boyden-kammer assay system [25]. Interessant, som vist i figurene 4B og 4C, inhibering av
CLDN11
ekspresjon i HFE145 celler økt betydelig trekk og invasive potensialer til disse cellene, respektivt.
HFE145 cellelinje, som er claudin- 11 positive ble valgt for å studere rollen til claudin-11 knockdown på migrering og invasjon egenskaper av gastriske celler. Cellene ble transfektert med
CLDN11
spesifikke siRNA oligos. Mock transfections og uspesifikke siRNA tomannsboliger ble brukt som negative kontroller. A) Western blot-analyse av siRNA mediert claudin-11 knock-down i HFE145 celler. HFE145 celler ble transfektert med
CLDN11
– spesifikke og uspesifikke kontroll siRNA tomannsboliger, som beskrevet i materialer og metoder. Etter 48 til 72 timer, ble de totale cellelysatene fremstilt og analysert for claudin-11-ekspresjon. Transfeksjon av claudin-spesifikk siRNA oligonukleotidene resulterte i 90% reduksjon i ekspresjon av proteinet, mens nivåene av claudin-proteinet i kontrollcellene ikke ble signifikant endret. B) Boyden kammer celle invasjon analysen. Invasivitet av siRNA-transfekterte celler ble bestemt ved å bruke matrigel belagte invasjon kammer, ved hjelp av et modifisert Boyden kammer analysen. Forsøkene ble gjentatt minst tre ganger, med tre paralleller i hvert eksperiment. De data som er representert her er den gjennomsnittlige gangers endring i invasjonen av siRNA-transfekterte celler sammenliknet med modelltransfeksjoner. Som vist i denne figuren, siRNA knockdown av claudin-11 fører til en økning i celle invasjon av HFE145 celler. C) To-kammer-celle migrasjon analysen. Virkningene av claudin-11 knockdown på migrering av HFE145 celler ble sammenlignet ved måling av antall celler som migrerer gjennom de ubelagte filtrene (i stedet for Matrigel-belagte filter). Barene i denne figuren representerer gjennomsnittet ganger endring i migrasjon av siRNA-transfektert celler sammenlignet med modell transfektert kontrollceller. Som det kan sees i denne figur, er en reduksjon i claudin-11 proteinnivåer assosiert med økt bevegelighet av cellene.
Den aktuelle studium bekrefter derfor hypotesen om at
CLDN11
, et stramt knutepunkt protein, er brakt til taushet i GC via promoter hypermethylation, og disse dataene støtter involvering av
CLDN11
i kontrollen av GC celle invasjon og migrasjon.
Arrangøren hypermethylation er kjent for å være assosiert med transcriptional stanse av visse gener. DNA metylering kan påvirke binding av transkripsjonsfaktorer som bindende områder inneholder CpG dinukleotider. Bruke TFSEARCH program, skannet vi
CLDN11
sekvens funnet å være hypermethylated i mage kreft vev og cellelinjer,
dvs.
., Den qMSP amplicon (-104 til fire baser i forhold til transkripsjonsstartsetet for
CLDN11
). Denne skanningen identifisert mulige bindingssteder for SP1 og GATA-en og GATA-2. Tidligere studier har vist at hypermethylation av promoter DNA bidrar til å stanse all
CLDN3 Hotell og
CLDN4
i eggstokkene cellelinjer, delvis
via
metylering-indusert forstyrrelse av binding av SP1 til dens kognat bindingssete (22, 23). I tillegg er medlemmer av familien Gata vist seg å være positive regulatorer av
CLDN11
transkripsjon [28]. Videre studier er nå garantert å vurdere om hypermethylation av disse områdene forstyrrer bindingen av transkripsjonsfaktorer, og hvordan slike forstyrrelser kan påvirke
CLDN11
gentranskripsjon.
Kreftceller vanligvis utviser strukturelle og funksjonelle mangler i deres TJS [17]. Disse manglene er knyttet til et tap av polaritet og differensiering. En annen viktig bindeledd mellom TJs og kreft er et tap av TJ integritet, med påfølgende lekkasje eller transport av pro-tumorigene stoffer (for eksempel vekstfaktorer eller næringsstoffer) i å utvikle svulst celle primordia, fremme tumorvekst [29]. I tillegg kan tap av polaritet, differensiering og klebende egenskaper assosiert med nedsatt TJ funksjon i kreft være kritisk i å skaffe en metastatisk fenotype [30]. Studier har antydet at uregelmessigheter i TJ-assosierte proteiner kan representere epitel-mesenchymale overgang (EMT), og dermed endre invasivitet og motilitet av kreftceller.
modulasjoner i uttrykket av TJ-assosierte proteiner, spesielt claudin proteiner, har blitt vist i en rekke kreftformer. Nyere studier av oss og andre har vist endringer i claudin protein regulering i ulike epiteliale kreft [18]. Medlemmer av familien claudin-genet blir uttrykt i et høyt vev-spesifikk, så vel som en meget utviklingsstadiet spesifikk, måte. I tillegg, avhengig av krefttype, kan ekspresjon av claudin proteiner enten være oppregulert eller nedregulert i kreftceller. For eksempel er flere claudin proteiner oppregulert i tykktarm, eggstokkene, bukspyttkjertelen og prostatakreft, mens noen er nedregulert i brystkreft og hode og nakke kreft [16], [18]
Studier har tidligere rapportert endringer i uttrykk profiler av medlemmer av familien claudin å være forbundet med GC. Serie analyse av genuttrykk (SAGE) identifisert
CLDN18
genet som nedregulert i GCer innehar en intestinal fenotype [31].
CLDN23
genet er også nedregulert i intestinal-type GCer [32]. Omvendt, Cunningham
et al.
Rapportert
CLDN4
uttrykk økes i intestinal metaplasi og mage epitelial dysplasi, identifisere dette genet som en markør for GC forstadier [33]. I denne studien har vi funnet
CLDN11
uttrykk som skal nedregulert eller brakt til taushet i GC
via
hypermethylation av sin promoter regionen. Videre fant vi at i motsetning til
CLDN18 Hotell og
CLDN23
,
CLDN11
uttrykk ble nedregulert i GC pasientprøver samt i cellelinjer, uavhengig av diffuse
vs .
intestinal subtype.
claudin-11, også kjent som oligodendrocytt-spesifikt protein, ble først identifisert til å være spesielt uttrykt i trange forbindelses tråder av oligodendrocytter i hjernen og i Sertoli-celler fra rotter og mus [ ,,,0],34], [35]. Tap av claudin-11-ekspresjon, noe som fører til avbrudd av den TJ barrieren, er assosiert med nevrologiske og reproduktive underskudd [36]. En fersk studie rapporterte overekspresjon og mislocalization av
CLDN11
fra blod-testikkelbarrieren i Sertolicellene å bli assosiert med testikkelkreft intraepitelial neoplasi hos menn [37]. Data i studien slår fast at
CLDN11
er uttrykt i normale mage vev og udødelig NGECs. Men dens komplette funksjoner i normal mage samt i magekreft fortsatt uklare.
I et forsøk på å utforske mulige involvering av
CLDN11
i GC, studerte vi fenotypiske endringer knyttet til å stanse all
CLDN11
uttrykk i
CLDN11-
uttrykker mage epitelceller (HFE145). Veldig interessant, siRNA-mediert knockdown av
CLDN11
resulterte i økt cellemotilitet og invasjon.
Tidligere studier har rapportert kreftspesifikke fenotypiske endringer skal forbundet med modulasjoner i claudin uttrykk i ulike krefttyper . Overekspresjon av claudin-3 og claudin-4 proteiner i eggstokkreft cellelinjer resultater i økt invasjon av disse cellene [25].
