Abstract
Grape seed proantocyanidiner (annonser i Gmail), en biologisk aktiv komponent av drue frø, har vært rapportert å ha et bredt spekter av farmakologiske og biokjemiske egenskaper. Nylig har den hemmende effekten av annonser i Gmail på ulike kreftformer er rapportert, men deres effekt på livmorhalskreft fortsatt uklare. Her, utforsket vi effekten av annonser i Gmail på livmorhalskreft ved hjelp av in vitro- og in vivo-modeller. In vitro behandling av HeLa og Siha celler med annonser i Gmail resulterte i en signifikant inhibering av cellelevedyktighet. Videre undersøkelser indikerte at annonser i Gmail førte til dose-avhengig induksjon av apoptose i cancerceller. Den underliggende mekanisme er forbundet med økt ekspresjon av de pro-apoptotiske protein Bak-1, redusert ekspresjon av anti-apoptotiske protein Bcl-2, er tap av mitokondriemembranpotensialet, og aktiveringen av caspase-3, noe som tyder på at GSPS indusert cervical kreftcelle apoptose gjennom mitokondrie vei. I tillegg er administrasjonen av annonser i Gmail (0,1%, 0,2% og 0,4%, w /v) som et supplement i drikkevannet vesentlig hemmet tumorvekst av HeLa og Siha celler i atymiske nakne mus, og antallet av apoptotiske celler i disse svulstene ble også økt betydelig. Til sammen våre studier vist at annonser i Gmail kan hemme veksten av livmorhalskreft ved å indusere apoptose gjennom mitokondrie vei, noe som gir bevis som indikerer at annonser i Gmail kan være en potensiell chemopreventive og /eller kjemoterapeutiske agent for livmorhalskreft.
Citation : Chen Q, Liu XF, Zheng PS (2014) Grape Seed proantocyanidiner (annonser i Gmail) hemme veksten av livmorhalskreft ved å indusere apoptose mediert av mitokondrie Pathway. PLoS ONE ni (9): e107045. doi: 10,1371 /journal.pone.0107045
Redaktør: Burton B. Yang, University of Toronto, Canada
mottatt: 5 mars 2014; Godkjent: 04.08.2014; Publisert: 04.09.2014
Copyright: © 2014 Chen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er innenfor papir
Finansiering:. Arbeidet ble støttet av et stipend fra National Natural Science Fund for Distinguished Unge Forskere (nr 30725043), en generell bevilgning (nr 81270715) og en ungdom bevilgning (nr 31201118) fra Natural Science Foundation of China National. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
livmorhals~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP er den tredje vanligste kreftformen [1] og den fjerde største årsaken til kreft dødsfall blant kvinner over hele verden [2]. Omtrent 80% av livmorhalskrefttilfellene skjer i utviklingsland, der omtrent 529 000 nye tilfeller oppdages hvert år, med nesten halvparten av disse pasientene dør [3]. I utviklingsland, på grunn av mangel på screening og redusert tilgang til hensiktsmessige terapeutiske fasiliteter og narkotika, forekomst og dødelighet av livmorhalskreft rang andre etter brystkreft [4]. Mange saker har utviklet seg til invasiv livmorhalskreft ved diagnosetidspunktet, og pasientene er ikke lenger kandidater for radikal kirurgisk behandling. Selv om kjemoterapi og strålebehandling er fortsatt de store behandlinger for invasiv livmorhalskreft, er fem års overlevelse begrenset på grunn av begrenset effekt og høy toksisitet av mange kreft narkotika. Derfor er det leting og utvikling av mer effektive og mindre giftige terapeutiske midler som kreves.
Epidemiologiske studier har vist at inntak av en vegetable- og frukt-baserte dietten reduserer risikoen for kreft betraktelig [5], [ ,,,0],6], som tilbyr lovende nye muligheter for utvikling av mer effektive chemopreventive eller kjemoterapeutiske strategier for ulike kreftformer. Nylig har mange fytokjemikalier med forskjellige kjemiske natur isolert fra frukt og grønnsaker blitt åpenbart å ha potensial Kjemopreventivt og /eller kjemoterapeutiske virkning mot kreft [7], [8], slik som katekiner, bioflavonoider, fyto-østrogener og proantocyanidiner [9], [10]. Druekjerne proantocyanidiner (annonser i Gmail), et polyfenolisk blanding, hovedsakelig inneholder 70% -95% proantocyanidiner, som utgjør dimerer, trimerer, tetramerer og oligomerer /polymerer av monomere katekiner og /eller (-) – epikatekiner [11] – [13] . Annonser i Gmail har vist seg å ha minimal toksisitet in vivo og effektive anticancer virkning på forskjellige humane cancere [14], som for eksempel human prostatakreft [15], human kolorektal kreft [16], [17], human ikke-småcellet lungekreft [ ,,,0],18], [19], bukspyttkjertelkreft [20], og hode og nakke plateepitel kreft [21]. Likevel, i dag, har ingen studier undersøkte effekten av annonser i Gmail på livmorhalskreft.
I denne studien ble annonser i Gmail funnet å være i stand til å hemme livmorhalskreft vekst in vitro og in vivo, og gir overbevisende bevis for den farmakologiske aktivitet av annonser i Gmail mot livmorhalskreft.
Materialer og metoder
Antistoffer, reagenser og kjemikalier
Antistoffer spesifikke for BCL-2, Bak-1 og β-aktin ble kjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi, Inc. (Santa Cruz, California). Sekundære antistoffer konjugert til pepperrotperoksidase ble innkjøpt fra Thermo Fisher Scientific, Inc. (New York, New York). Den Annexin V-konjugert FITC apoptose deteksjon kit ble hentet fra BD Pharmaceuticals (Franklin Lakes, NJ). JC-1 mitokondriemembranen potensial deteksjon kit og caspase-3-aktivitet deteksjon kit ble kjøpt fra NanJing KeyGen Biotech Co., Ltd (Nanjing, Kina), og in situ celledød deteksjon kit ble kjøpt fra Roche Diagnostic Corporation (Indianapolis, I). MTT (3- (4,5-dimetyl-2-yl) -2,5-difenyl tetrazoliumbromid), PI (propidiumjodid) og DAPI (2- (4-amidinofenyl) -6-indolecarbamidine-dihydroklorid) ble oppnådd fra Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). De Annonser i Gmail ble kjøpt fra Jianfeng Natural Product R . D Co., Ltd (Tianjin, Kina)
Cellelinjer og cellekultur
Den menneskelige livmorhalskreft cellelinjer Siha og HeLa ble kjøpt fra American Type Culture Collection (Manassas, Virginia). Cellelinjene ble dyrket som monolag i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) supplert med 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum (Invitrogen, Carlsbad, USA) ved 37 ° C i 5% CO
2. Annonser i Gmail ble oppløst i en liten mengde dimetylsulfoksyd (DMSO, 100 ul) før tilsetning til mediet. Den maksimale konsentrasjon av DMSO i mediet ikke overstige 0,1% (v /v), og celler behandlet med DMSO alene tjente som en bærerkontroll.
MTT-assay for celle-levedyktighet
Effekten av annonser i Gmail på cellelevedyktigheten ble bestemt ved anvendelse av en MTT-assay som tidligere beskrevet [22]. I korthet ble cellene sådd ut i 96-brønners kulturplater ved 5 x 10
3-celler per brønn og inkubert over natten. Celler ble behandlet med annonser i Gmail ved forskjellige konsentrasjoner for 24, 48 eller 72 timer. Ved slutten av stimulerings tid, ble MTT tilsatt til hver brønn. Den resulterende formazan ble deretter oppløst i 100 ul dimetylsulfoksid (DMSO), og absorbansen ble målt ved 540 nm ved anvendelse av en Bio-Rad 3350 mikroplateleser.
Strømningscytometrisk deteksjon av apoptose
effektene av annonser i Gmail på apoptose av livmorhalskreft celler ble analysert ved hjelp av strømningscytometri ved bruk av Annexin V-FITC konjugert apoptose deteksjon kit (BD, Franklin Lakes, NJ). I korthet, etter behandling med annonser i Gmail i 48 timer, ble cellene høstet, vasket med PBS og inkubert med Annexin V-FITC og PI i 10 min i mørket. Deretter ble de fargede celler detektert ved anvendelse av et FACSCalibur strømningscytometer (Becton Dickinson Franklin Lakes, NJ).
cellesyklusanalyse
Cellene ble behandlet med den angitte konsentrasjon av annonser i Gmail i 48 timer, deretter høstet , vasket med kald PBS, og fulgt av fiksering med iskald 70% etanol over natten ved 4 ° C. Etter å ha vasket to ganger med PBS, ble cellene farget med fluorescerende probe oppløsning inneholdende 50 ug /ml PI og 1 mg /ml RNaseA på is i mørket i 30 minutter. Cellesyklus ble analysert ved FACSCalibur strømningscytometer (BD biovitenskap, San Jose, USA) ved hjelp av Cellquest programvare.
Western blot analyse
Etter behandling med annonser i Gmail, HeLa og Siha cellene ble høstet, vasket med kald PBS og lysert med iskald lyseringsbuffer supplert med protease-inhibitorer som beskrevet tidligere [23]. For western blot-analyse ble proteinene separert ved SDS-PAGE og overført til PVDF-membraner ved våt overføring. Etter blokkering med 5% fettfri melk, ble membranen inkubert med det primære antistoff ved 4 ° C over natten. Etter vasking, ble membranen inkubert med det passende pepperrot-peroksidase-konjugert sekundært antistoff i 1 time, og proteinbånd ble visualisert ved hjelp av forbedrede Chemiluminescence reagenser (Millipore, Billerica, USA) på røntgenfilm.
Assay for mitokondriemembranpotensialet
endringer i mitokondriemembranpotensialet av livmorhalskreft celler behandlet med annonser i Gmail ble målt ved strømningscytometri ved bruk av det fluorescerende lipofile kationiske sonde JC-1 deteksjon kit ifølge produsentens protokoll. JC-1 selektivt innenfor normale mitokondriene å danne multimerprober J-aggregater som avgir rød fluorescens. JC-1 kan ikke tilslag i mitokondriene med endret mitokondriemembranpotensialet og forblir i cytoplasma i monomere form, fluorescerende grønne. Dermed kan fargen på fargestoff endres fra oransje til grønt, avhengig av mitokondriemembranen potensial, og analyseres ved flowcytometri i FITC kanalen.
Påvisning av caspase-3-aktivitet
aktiviteten av caspase-3 ble bestemt ved anvendelse av apo målet sett i overensstemmelse med produsentens protokoll. I korthet ble cellene behandlet med annonser i Gmail i 48 timer og deretter høstet. Cellelysater ble fremstilt som tidligere beskrevet [23]. Prøver av cellelysatene (150 ug protein per prøve) ble blandet med reaksjonsbuffer og substrat og inkubert i 4 timer ved 37 ° C. Absorbansen ble deretter målt ved 405 nm, og prøve målingene ble beregnet ved å trekke absorbansen tomme prøver.
Dyr og tumor xenograft modell
Kvinne BALB /C hårløse mus (6-7 uker gamle) ble hentet fra SLAC Laboratory Animal Co., Ltd (Shanghai, Kina) og plassert i Animal Resource Facility ved Medical College of Xi’an Jiaotong University som ble holdt ved en konstant temperatur (22 ° C-25 ° C ) og fuktighet (40-50%). Alle dyrene hadde fri tilgang til drikkevann og mat, og fikk human behandling i samsvar med internasjonalt anerkjente prinsipper for forsøksdyr bruk og omsorg (europeiske retningslinjene for fellesskapet EEC direktiv fra 1986, 86/609 /EEC). Dyret protokoll som brukes i denne studien ble godkjent av Animal Care og bruk komité Medical College of Xi’an Jiaotong University.
For å fastslå effekten av annonser i Gmail mot livmorhalskreft vekst in vivo, to svulst xenograft modeller ble brukt. Modell 1: Mus ble tilfeldig delt inn i fire grupper med seks mus pr gruppe, gruppe 1, kontroll; Gruppe 2, annonser i Gmail (0,1%, vekt /volum); Gruppe 3, annonser i Gmail (0,2%, vekt /volum); Gruppe 4, annonser i Gmail (0,4%, w /v), og musene mottok annonser i Gmail i minst 10 dager før implantasjon av tumorceller. Modell 2: Mus ble tilfeldig delt inn i to grupper med seks mus pr gruppe, gruppe 1, kontroll; Gruppe 2, annonser i Gmail (0,4%, w /v), og musene begynte å motta annonser i Gmail på den 12. dag etter implanteringen av tumorceller. Eksponensielt voksende HeLa og Siha-celler (2 x 10
6 i 100 ul PBS) ble injisert subkutant i høyre flanke av hver mus, respektivt. Annonser i Gmail ble oppløst i destillert vann, og den mottok musene annonser i Gmail ved å drikke vann fritt. Kontrollmusene mottok destillert vann. Den tumorvekst ble overvåket regelmessig med vernier calipers gjennom hele eksperimentet, og volumene av svulster ble beregnet ved hjelp av følgende formel: Volum = (lengde × bredde
2) /2. Ved avslutning av forsøket ble musene avlivet ved halshugging under 25% uretan-narkose, og tumormassen ble høstet og veiet. En del av tumorvevet ble parafin-innleiret og den andre del ble frosset i flytende nitrogen for videre analyse.
Histopatologisk undersøkelse
parafinsnitt av tumor-xenografter ble deparaffinized i xylen og rehydratisert ved synkende konsentrasjoner av etanol i henhold til rutinemessige fremgangsmåter og ble farget med hematoksylin og eosin (H 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Annonser i Gmail hemmet levedyktigheten til livmorhalskreftceller in vitro
effekten av annonser i Gmail på levedyktigheten til livmorhalskreftceller ble først vurdert ved hjelp av en MTT analyse. Cervical cancer cellelinjer, inkludert HeLa og Siha-celler, ble behandlet med forskjellige doser av annonser i Gmail (0, 20, 40, 60, 80 og 100 ug /ml) i 24, 48 eller 72 timer. Som vist på fig. 1A, behandling av HeLa-celler med annonser i Gmail resulterte i en betydelig reduksjon i levedyktighet av cellene på en doseavhengig måte (
p
0,05). Spesielt ble en signifikant hemmende effekt observert ved 48 timer etter GSP behandling (5-85% reduksjon,
p
0,05). Videre er effekten ble også tidsavhengig (60 ug /ml annonser i Gmail, 25-90% reduksjon,
p
0,05). Tilsvarende hemmende effekter ble observert på Siha celler behandlet med annonser i Gmail (Fig. 1B). Alle disse resultatene indikerte at annonser i Gmail kunne effektivt hemmer levedyktigheten av cervikale kreftceller.
(A) HeLa og (B) Siha celler ble behandlet med varierende doser av annonser i Gmail, og den relative levedyktigheten til cellene ble bestemt ved MTT-analysen ved 24 timer, 48 timer og 72 timer. Resultatene ble uttrykt som prosentandel av kontrollceller som middelverdi ± SD oppnådd fra 3 adskilte eksperimenter. (C) Vekst inhibering og morfologiske forandringer av HeLa og Siha celler behandlet med annonser i Gmail i 48 timer sammenlignet med kontrollceller (ikke-annonser i Gmail-behandlet). Cellene ble fotografert med invertert kontrastmikroskopi (forstørrelse, 40 x).
I tillegg ble cellelevedyktigheten til Siha og HeLa-celler etter behandling annonser i Gmail også observert under et fasekontrastmikroskop. Som vist på fig. 1C, etter 48 timer med annonser i Gmail behandling, tettheten av begge cellelinjene ble signifikant redusert på en dose-avhengig måte. Annonser i Gmail behandling også bemerkelsesverdig endret morfologi av livmorhalskreftceller. Etter annonser i Gmail behandling, de HeLa-celler og Siha redusert i størrelse, tilbaketrukket fra sine naboer, mistet sin flate og polygonal form, og til slutt løsrevet fra kulturskålen, noe som tyder på at GSPS inhiberte livmorhalskreft cellelevedyktigheten ved å indusere celledød.
Annonser i Gmail indusert cellesyklus arrest i livmorhalskreftceller
for å fjerne om livmorhalskreft celleviabilitet hemming av annonser i Gmail er involvert i endring i cellesyklusprogresjon, ble utført analysen cellesyklusen. HeLa og Siha-celler ble behandlet med forskjellige doser av annonser i Gmail i 48 timer, ble fordelingen av celler i forskjellige faser av cellesyklusen analysert ved flow-cytometer. Som vist på fig. 2A og B, ved behandling av HeLa-celler med annonser i Gmail resulterte i en signifikant akkumulering av celler i G2 /M-fase ved høyere konsentrasjoner (40 ug /ml og 80 ug /ml,
p
0,01). På samme måte som HeLa-celle resultater, en betydelig arrest av cellene i G2 /M-fasen av cellesyklusen ble også observert i Siha celler ved 40 og 80 ug /ml konsentrasjon av annonser i Gmail (fig. 2C og D,
p
0,01). Sammen utgjør disse funnene antydet at annonser i Gmail kan indusere arrestasjonen av cellesyklus i G
2 /M fase, som kan være assosiert med hemmende effekt av annonser i Gmail på livmorhalskreftcelle.
HeLa og Siha cellene behandlet med forskjellige doser av annonser i Gmail i 48 timer og høstet. Cellesyklusfordelingen ble analysert ved flow-cytometri. (A, C) De representative cellesyklus histogrammer av HeLa og Siha. (B) Behandling av HeLa-celler med annonser i Gmail resulterte i akkumulering av celler i G
2 /M-fasen. (D) behandling av Siha celler med annonser i Gmail resulterte i akkumulering av celler i G
2 /M-fasen. Resultatene ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD, *
p
0,05
vs
kontroll.; **
p
. . 0,01
vs
kontroll
Annonser i Gmail indusert apoptose av livmorhalskreftceller
For å finne ut om annonser i Gmail indusert apoptose av livmorhalskreftceller, observerte vi den morfologiske endring av cellekjernen ved hjelp av DAPI farging (fig. 3A). En rekke av HeLa og Siha celler behandlet med forskjellige doser av annonser i Gmail i 48 timer ble funnet å vise klassiske apoptotiske endringer, for eksempel kromatin kondensasjon, karyopyknosis og apoptotisk legeme formasjonen. Men ubehandlet kontroll Siha og HeLa celler vises sjelden disse funksjonene, noe som tyder på at GSP-behandling kan indusere apoptose av livmorhalskreftceller.
HeLa og Siha celler ble behandlet med varierende doser av annonser i Gmail for 48 timer og deretter høstet for analyse av apoptose. (A) De morfologiske forandringer av kjerner ble undersøkt ved fluorescensmikroskopi ved bruk av DAPI farging. Pilen viser atom kondens og en apoptotisk kropp (forstørrelse, 40 ×). Strømningscytometri-analyse av Annexin V-FITC /PI dobbel-farget HeLa (B) og (C) Siha celler. Den lave høyre (LR) kvadrant av histogrammene indikerer begynnelsen av apoptotiske celler, og øverst til høyre (UR) kvadrant indikerer slutten av apoptotiske celler. Behandlingen av HeLa (B) og Siha (C) celler med GSPS fører til signifikante økninger i prosentandelen av apoptotiske celler (inkludert tidlig og sent stadium). Verdier er uttrykt som gjennomsnitt ± SD av tre eksperimenter i to eksemplarer, *
p
0,05
vs
kontroll.; **
p
. . 0,01
vs
kontroll
For ytterligere kvantitativ analyse av apoptose indusert av annonser i Gmail, celler behandlet med forskjellige doser av annonser i Gmail var analysert ved hjelp av strømningscytometri ved bruk av Annexin V-FITC /PI dobbel farging. Apoptotiske celler kan bli skrevet inn i tidlig stadium apoptose (Annexin V
+ og PI
-) og sent stadium apoptose (Annexin V
+ og PI
+), som er vist henholdsvis i nedre høyre (LR) og øvre høyre (UR) kvadranter av FACS histogrammer (fig. 3B og D, venstre panel). resultater apoptose (inkludert tidlig stadium og sent stadium) i begge cellelinjene er videre oppsummert i figur 3 C og E. prosent av totale apoptotiske celler i HeLa-celler var 1,5% i kontrollceller (tidlig stadium: 0,69% og sent stadium: 0,81%), 3,1% i celler behandlet med 20 pg /ml annonser i Gmail (tidlig-stadium: 0,95% og sent stadium: 2,15%) 17,51% i celler behandlet med 40 ug /ml (tidlig-stadium: 4,21% og sent stadium: 13,30%) og 25,6% i celler behandlet med 80 mikrogram /ml (tidlig stadium: 8.33% og sent stadium: 17.27%). På samme måte som i Siha celler var 1,37% i kontrollceller (tidlig stadium: 0.63% og sene stadier: 0,74%), 3,08% i celler behandlet med 20 mikrogram /ml annonser i Gmail (tidlig stadium: 1,43% og sent stadium : 1,65%), 3,56% i celler behandlet med 40 mikrogram /ml (tidlig stadium: 1,62% og sent stadium: 1,94%) og 9,56% i celler behandlet med 80 mikrogram /ml (tidlig stadium: 3,25% og sent -trinns: 6,31%). Alle disse resultatene indikerte at GSPS betydelig indusert apoptose (inkludert tidlig og sent stadium apoptose,
p
0,01) av livmorhalskreftceller
Annonser i Gmail indusert apoptose av livmorhalskreftceller gjennom. nedregulering av Bcl-2 og oppregulering av Bak-1
Både Bcl-2 og Bak-1-proteiner spiller avgjørende roller i regulering av apoptose [25], [26]. Således ble ekspresjon av Bcl-2 og Bak-1 undersøkt ved western-blotting for å bestemme om disse to proteinene er involvert i induksjon av livmorhalskreft celle apoptose av annonser i Gmail. De representative blottene til HeLa og Siha celler er vist i fig. 4A og C, henholdsvis, og den relative ekspresjon av disse proteiner ble videre beregnet ved normalisering p-aktin uttrykk, og er oppsummert i figur 4 B og D, henholdsvis. Resultatene viste at ekspresjon av Bcl-2 i HeLa-celler behandlet med annonser i Gmail i 48 timer ble signifikant redusert på en doseavhengig måte (figur 4B,
p
. 0,05). Motsatt, uttrykket av Bak-en betydelig høyere (figur 4B,
p
. 0,05). Lignende resultater ble også funnet med Siha celler (figur 4D,
p
. 0,05). Derfor annonser i Gmail induserte apoptose av cervikale kreftceller gjennom nedregulering av Bcl-2 og oppregulering av Bak-1.
Cellene ble behandlet med varierende doser av annonser i Gmail i 48 timer og deretter høstet . Cellelysater ble fremstilt og utsatt for Western blot-analyse. (A) Behandling av HeLa-celler med annonser i Gmail resulterte i en doseavhengig reduksjon av Bcl-2-ekspresjon og en økning i Bak-1-ekspresjon. (B) Den relative ekspresjon av Bcl-2 og Bak-1 proteiner i HeLa-celler ble beregnet på grunnlag av β-actin ekspresjon, som ble benyttet som kontroll lasting. (C) annonser i Gmail betydelig redusert ekspresjon av Bcl-2 og økt ekspresjon av Bak-1 i Siha celler. (D) Den relative ekspresjonsnivåer av nivåer av BCL-2 og Bak-1 i Siha celler er oppsummert. Representative blot er vist fra tre uavhengige eksperimenter, og verdiene er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. *
p
0,05
vs
kontroll.; **
p
. . 0,01
vs
kontroll
Annonser i Gmail indusert tap av mitokondriemembranen potensial i livmorhalskreftceller og aktivert caspase-3 protein
det er velkjent at den intracellulære translokasjon av Bcl-2 og Bak-1 kan indusere tap av mitokondriemembranpotensialet, som er knyttet til initiering og aktivering av den apoptotiske prosess i celler [27], [28 ]. For å utforske virkningen av annonser i Gmail på mitokondriemembranpotensialet, ble integriteten av mitokondriemembranen av celler bestemt ved farging med JC-1, et kationisk lipofilt fargestoff. Som vist på fig. 5A og C, HeLa og Siha celler behandlet med annonser i Gmail i 48 timer ble analysert ved FACS. Den gjennomsnittlige prosentandelen av grønn fluorescens-positive HeLa-celler som var 3,10% ved 0,00 pg /ml, 5,27% ved 20 ug /ml, 6,90% ved 40 ug /ml og 10,83% ved 80 ug /ml (fig. 5B), mens den av de Siha cellene var 0,45% ved 0,00 pg /ml, 1,55% ved 20 ug /ml, 8,35% ved 40 ug /ml og 35,47% ved 80 ug /ml (fig. 5D). Resultatene viste en signifikant økning i grønne fluorescens-positive celler med økende doser av annonser i Gmail (
p
0,01), noe som tyder på at annonser i Gmail kan indusere cervikale kreftceller til å miste mitokondriemembranpotensialet. Derfor annonser i Gmail induserte apoptose av cervikale kreftceller ved avbrudd av mitokondriemembranpotensialet.
HeLa (A) og Siha (C) celler ble behandlet med de angitte doser av annonser i Gmail i 48 timer og deretter høstet, farget med JC-1 fargestoff, og endelig analysert ved flow-cytometri. Annonser i Gmail resulterte i et betydelig tap av mitokondriemembranen potensial i HeLa (B) og Siha celler (D). Caspase-3 aktivitet i HeLa-celler og Siha ble målt ved anvendelse av en kolorimetrisk proteinanalyse, og behandling av HeLa (E) og Siha (F) celler med annonser i Gmail resulterte i en doseavhengig økning i aktiviteten av caspase-3. GFP: Grønn fluorescens positive. Data er presentert som gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter, *
p
0,05
vs
kontroll.; **
p
0,01
vs
kontroll
På grunn av tapet av mitokondriemembranen potensial, er cytokrom c slippes ut i cytosol, som aktiverer.. procaspase 9 i apoptosome og fører til spaltning av caspase-3 [29]. Deretter spaltes aktiv caspase-3 kan spalte et bredt spekter av target-proteiner, og til slutt føre til apoptotisk celledød. For å undersøke hvorvidt den apoptose indusert av annonser i Gmail er involvert i kaskaden aktivering, ble aktivitetene til caspase-3 bestemt ved en kolorimetrisk assay. Resultatene viste at behandling av både HeLa og Siha celler med annonser i Gmail for 48 timer resulterte i signifikant økning av caspase-3 aktivitet på en doseavhengig måte (fig. 5E og F), noe som tyder på at apoptose av livmorhalskreft-celler indusert av Annonser i Gmail skjedd gjennom aktivering av caspase-3 bane.
Annonser i Gmail hemmet initiering og progresjon av livmorhalskreft in vivo
Fordi annonser i Gmail kan indusere apoptose av livmorhalskreftceller in vitro, var det nødvendig å teste om annonser i Gmail kan hemme initiering og tumorvekst av livmorhalskreftceller in vivo. For å teste effekten av annonser i Gmail på initiering og progresjon av menneskelige livmorhalskreftceller, ble nakne mus matet annonser i Gmail i 10 dager før inokulering med livmorhalskreftceller. Veksten av svulster ble overvåket i form av tumorvolumet hver tredje dag. Ved avslutning av forsøket ble tumorene skåret ut etter ble musene avlivet, og de våte vekt av tumorene ble bestemt.
Først må vi funnet at tumordannelse ved å HeLa-celler i kontrollgruppen fant sted ved 12 dager etter vaksinasjon; Men svulstdannelse i annonser i Gmail behandlingsgruppen (annonser i Gmail, 0,2% og 0,4%) forekom omtrent 15 dager etter vaksinasjonen. Lignende resultater ble observert i Siha celler, noe som tyder på at annonser i Gmail hemmet initiering av livmorhalskreft. Sekund, veksten av HeLa og Siha tumorxenotransplantater i mus behandlet med annonser i Gmail var betydelig tregere enn for kontrollene (Fig. 6A og B), som foreslo at annonser i Gmail hemmet veksten av livmorhalskreft transplantater i nakne mus. Til syvende og sist, den gjennomsnittlige våtvekt av tumorxenografter dannet av HeLa-celler etter behandling annonser i Gmail var betydelig mindre enn den til kontrollgruppen (
p
0,01, Figur 6C og E.). Tilsvarende administrering av annonser i Gmail resulterte også i signifikant reduksjon i den våte vekten av Siha tumorxenografter (
p
. 0,01, figur 6D og F). I tillegg ble det histopatologisk undersøkelse av tumorxenografter utført under lysmikroskop. Som vist på fig. 6G og H, ble det observert tydelige morfologiske endringer i annonser i Gmail behandlede gruppene. Sammenlignet med kontrollgruppen, tumor vev av annonser i Gmail behandlede grupper, spesielt 0,4% annonser i Gmail gruppe, presentert utbredt karyopyknosis, apoptotisk legeme formasjon og celle avbrudd, noe som tyder på at annonser i Gmail førte til apoptotiske og nekrotiske døden cervikale kreftceller. Sammen er disse resultatene antydet at annonser i Gmail kan hemme initiering og vekst av livmorhalskreft xenografter, viser en chemopreventive effekt mot livmorhalskreft.
Mus var
sc
inokulert i høyre flanke med 2 × 10
6 tumorceller. (A og B) Gjennomsnittlig tumorvolum i hver gruppe ble målt på en jevnlig basis. Ved avslutning av forsøket, ble tumormassen høstes (C og D), og den våte vekten av tumoren ble nedtegnet (E og F). (G og H) Den histopatologisk undersøkelse av tumorxenotransplantater ble utført under lysmikroskop, (forstørrelse, 40 ×). Verdier er uttrykt som gjennomsnitt ± SD, og den statistiske signifikans av forskjeller ble analysert ved en-veis ANOVA etterfulgt av Tukey-testen. *
p
0,05
vs
kontroll.; **
p
. . 0,01
vs
kontroll
kjemoterapeutiske effekten av annonser i Gmail på livmorhalskreft xenografter
For å evaluere den terapeutiske effekten av annonser i Gmail på de etablerte tumorer, ble musene behandlet med annonser i Gmail (0,4%, w /v) på 12
th dag etter implantering, etter at tumorene hadde allerede dannet. Veksten av svulster ble overvåket regelmessig, og vi fant at behandling med annonser i Gmail føre til en betydelig reduksjon i tumorvekst rate. Som vist på fig. 7A og B, tumorvolumer av annonser i Gmail-behandlede mus ble betydelig redusert sammenliknet med kontrollmusene, noe som tyder på at annonser i Gmail kunne hemme veksten av HeLa og Siha tumorxenografter. Dessuten, ved avslutningen av eksperimentet, måling av tumor våt vekt viste at den våte vekten av tumorer i annonser i Gmail-behandlede gruppen ble betydelig redusert sammenlignet med kontrollgruppen (Fig. 7C og D,
p
0,01), og histopatologisk undersøkelse fant også at den morfologiske endring av tumorxenografter i annonser i Gmail-behandlede gruppen var også bemerkelsesverdig sammenlignet med (figur 7E og F) kontrollgruppen.. Derfor er disse resultatene viste videre den hemmende effekten av annonser i Gmail mot livmorhalskreft progresjon.
I GSP-behandlede gruppen ble musene administrert annonser i Gmail (0,4%) på 12
th dagen etter implantasjon av tumorceller. (A og B) Tumor volum ble det registrert 3 dager, og administrasjonen av annonser i Gmail hemmet veksten av HeLa (A) og Siha (B) tumorxenotransplantater. (C og D) tumormasse ble høstet på slutten av forsøket, og den våte vekten av tumoren ble målt. Administreringen av annonser i Gmail førte til en betydelig reduksjon av den våte tumorvekten. (E og F) Den åpenbare morfologiske forandring av apoptotisk celledød ble observert i tumorvevet av annonser i Gmail-behandlede gruppen, men ikke i kontrollgruppen, (forstørrelse, 40 x). Verdier er uttrykt som gjennomsnitt ± SD, **
p
. . 0,01
vs
kontroll
Annonser i Gmail indusert celle apoptose av livmorhalskreft xenografter in vivo
Motstand mot apoptose er en av de viktigste karakteristiske trekk ved ondartede svulster. For å bestemme hvorvidt annonser i Gmail hemme livmorhalskreft progresjon ved å indusere apoptotisk celledød av kreftceller, evaluerte vi apoptose ved hjelp av TUNEL assay på tumorvev dannet av Siha og HeLa-celler, med eller uten annonser i Gmail behandling i modell 1. Analyseresultatene er vist i figur . 8A og kvantitativt oppsummert i fig. 8B. Prosentandelen av TUNEL-positive celler i tumorvev fra HeLa-celler ble behandlet med 0,4% annonser i Gmail var omtrent tre ganger høyere enn den for kontrollen, og at av Siha celler behandlet med 0,4% annonser i Gmail ble fordoblet høyere enn den for kontrollen. Som vist på fig.
