Abstract
Bakgrunn
Småcellet lungekreft (SCLC) er en trassig malignitet med forskjellige biologiske egenskaper. Antistoff rettet mot terapi har vært aktivt etterforsket som et nytt legemiddel modalitet.
Metoder
Vi testet uttrykket av IGF-1R og beregnet overlevelse i 61 SCLC pasienter. Vi vurderte også anti-tumor effekter av anti-IGF-1R monoklonalt antistoff Figitumumab (CP) på SCLC, og prøvde to medikamentkombinasjoner for å forbedre CP terapi.
Resultater
Våre kliniske data foreslått at høy IGF-1R uttrykk var korrelert med lav SCLC pasientens overlevelse. Vi demonstrerte effekten av CP var sannsynligvis gjennom IGF-1R blokkering og nedregulering uten IGF-1R auto-fosforylering og PI3K /AKT-aktivering. Imidlertid observerte vi forhøyet MEK /ERK-aktivering ved CP behandling i SCLC-celler, og dette MEK /ERK-aktivering ble forbedret ved ß-arrestin1 knockdown mens dempet ved ß-arrestin2 knockdown. Vi fant både MEK /ERK-hemmer og metformin kan forbedre CP behandling i SCLC celler. Vi illustreres ytterligere additiv effekt av metformin var trolig gjennom å fremme ytterligere IGF-1R nedregulering.
Konklusjon
Våre resultater fremhevet potensialet i anti-IGF-1R terapi og adjuvant behandling strategi med enten MEK /ERK-hemmer eller metformin å målrette SCLC, berettiger videre studier
Citation. Cao H, Dong W, Shen H, Xu J, Zhu L, Liu Q, et al. (2015) kombinatoriske Therapy forsterker effekten av anti-IGF-1R mAb Figitumumab å målrette småcellet lungekreft. PLoS ONE 10 (8): e0135844. doi: 10,1371 /journal.pone.0135844
Redaktør: Andrea Morrione, Thomas Jefferson University, USA
mottatt: 29 april 2015; Godkjent: 27 juli 2015; Publisert: 19 august 2015
Copyright: © 2015 Cao et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. arbeidet ble støttet av Provincial Science and Technology Development Planning i Shandong (2012GG0021836 og 2014WS0342), National Natural Science Foundation of China (81301728), Key Prosjekt of Science Foundation of Shandong Natural provinsen (ZR2013HZ001), og Shandong Provincial Natural Science Fund (ZR2014HQ073). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Småcellet lungekreft (SCLC) er en trassig malignitet med høy tilbakefall og lav fem-års overlevelse etter konvensjonell kjemoterapi og strålebehandling [1]. Behandling av SCLC er utfordrende på grunn av sin raske vekst og utvikling av resistens i løpet av sykdommen. SCLC besitter noen distinkte molekylære og cellulære endringer som fører til dets patogenese, inkludert mutasjoner /delesjoner av enkelte kreftdempere, aktivering av flere onkogener, unormal aktivitet av enkelte utviklingsveier, og opp-regulering av visse reseptor-tyrosinkinaser (RTK’er) [2] . På grunn av de unike patologiske /biologiske funksjoner i SCLC, søker etter ny-rettet behandling er av høy prioritet. Som et raskt voksende medikament modalitet, har antistoff medikamenter mot RTK’er blitt aktivt undersøkt for behandling av SCLC og insulin-lignende vekstfaktor-reseptor (IGF-1R) er en av slike potensielle mål RTK [3-7].
IGF-1R og dets ligander er vanligvis uttrykt i økte mengder ved SCLC, og er rapportert å korrelere med dårlig prognose [8,9]. Det er foreløpig bevis på at IGF-1R signalveien spiller avgjørende roller i mitogenesis, anti-apoptose, malign transformasjon og metastaserende hendelser [10,11]. IGF-1R er nå ansett for å være et attraktivt mål for kreftbehandling og det er noen pågående kliniske studier teste de IGF-1R-målrettede medikamenter. Figitumumab (CP-751, 871, CP), en human anti-IGF-IR monoklonalt antistoff (mAb), viste seg å ha anti-sprednings- og anti-tumorigenisitet effekter på kreftceller og xenopodet mus, og det har blitt vist å være effektive i kombinasjon med andre cytotoksiske midler for å målrette mange krefttyper [12-14]. CP ble undersøkt i en fase II klinisk studie i kombinasjon med etoposid og cisplatin som førstelinjebehandling for omfattende scenen SCLC (NCT00977561). Men dette forsøket ble tidlig avsluttet på 2011 på grunn av treg innmelding av pasienter. For å oppmuntre gjenoppta av klinisk studie er nødvendig den molekylære mekanismen for hvordan CP rettet SCLC. I tillegg, som kombinerer CP med andre rusmidler for å øke sin effektivitet er også avgjørende for å overbevise pasientene å melde inn de kliniske studiene.
Metformin, et mye brukt anti-diabetiker narkotika avledet fra fransk lilla, har caloric begrensning handling på celle metabolisme. Nylig metformin fremstår som en kandidat anti-kreft agent. Opphopning bevis tyder på at metformin har anti-kreft effekt i leukemic, hode og nakke plateepitelkarsinom, prostatakreft, brystkreft, lungekreft og andre solide tumorer, selv om dens nøyaktige mekanismer forbli uløst [15-20].
Ondartede celler har vanligvis høyere glukoseopptak hastighet og øket glykolyse til å oppfylle deres metabolske krav av hurtig protein-syntese og celledeling. Dessverre, er hyperglykemi rapportert å være en av de mest forekommet bivirkninger i kliniske studier med anti-IGF-1 R-mAb terapi, som kan ha nytte tumorcellevekst og redusere effekten av medikamentet [21]. Fordi metformin både har hypo-glykemisk og anti-kreft effekt, blir det en lovende kandidat i kombinasjon med anti-IGF-1 R-mAb’er til å målrette SCLC.
I tillegg til den potensielle bruken av metformin, en annen gruppe viste at inhibering av MEK /ERK signalveier fremmet virkningene av CP på spiserørskreft [22]. MEK /ERK-inhibitorer er blitt anvendt alene eller i kombinasjon med andre medikamenter for å behandle flere kreftformer, som sensibiliserende radioterapi og /eller kjemoterapi styrke. Kombinere Selumetinib (AZD6244), en MEK1 /2-hemmer, med konvensjonelle kjemoterapeutika forbedret deres effekt for å målrette ulike tumorxenotransplantater [23]. I en NSCLC modell, bruk av Selumetinib resulterte i redusert VEGF ekspresjon /aktivering, og kobling MEK og VEGFR-inhibitorer ytterligere hemmet tumor angiogenese, vekst og metastase [24]. I tillegg kombinerer OSI-906 (en IGF-1R /insulin hemmer) med MEK 1/2 hemmere (U0126 og selumetinib) viste synergistisk anti-proliferative effekter for å målrette kolorektal kreft celler [25]. Gitt deres suksess i flere kreftformer, er det verdt å undersøke om MEK /ERK-hemmere kan forbedre CP-basert terapi i SCLC.
Heri, vi undersøkte de molekylære mekanismer av antitumor effekten av CP i SCLC og viste at kombinere CP med enten MEK /ERK-hemmer U0126 eller metformin kan forsterke den terapeutiske effekten av CP å målrette SCLC.
Materialer og metoder
Pasienter og prøver
i denne studien var gjennomført retrospektivt på påfølgende pasienter med primær SCLC som hadde gjennomgått en kirurgisk fjerning mellom januar 2007 og desember 2010 i Shandong Provincial Hospital. Denne undersøkelsen ble gjennomgått og godkjent av etisk komité Shandong Provincial Hospital, og skriftlig informert samtykke ble gitt av deltakere. Kriteriene inkludert histologisk diagnose av SCLC, kirurgisk reseksjon av primær lesjon og ingen kjemoterapi eller strålebehandling før operasjonen. Pasienter som døde innen en måned etter operasjonen, eller med positiv kirurgisk margin ble ekskludert. Til slutt ble 61 arkivformalinfiksert parafin-embedded tumorprøver innhentet.
Staging ble fastsatt basert på den syvende utgaven tumor-node-metastaser (TNM) klassifikasjon for lungekreft [26]. Følgende informasjon inkludert alder, kjønn, røykestatus svulst plassering, tumor størrelse, patologisk, og TNM stadium ble samlet. Alle pasientene ble behandlet i henhold til National Comprehensive Cancer Network (NCCN) retningslinjer. Pasientene ble fulgt opp hver 3. måned i løpet av ett år etter operasjonen, hver 6. måned i 3 år, og hvert år etterpå.
Den første sluttpunktet var total overlevelse (OS), definert som tiden fra drift til dødsdato, dato tapt for oppfølging eller dato for siste oppfølging. Den andre endepunktet var sykdomsspesifikk overlevelse (DSS), og svikt ble definert som død av lungekreft eller behandlingsrelaterte komplikasjoner. Tilleggs endepunkt inkluderte sykdomsfri overlevelse (DFS), definert som tidsintervallet mellom datoen for den definitive reseksjon og påvisning av første tilbakefall av sykdommen, metastaser, eller dato for siste oppfølging.
Immunhistokjemisk (IHC) Analyse av vevsprøver
Immunohistochemistry (IHC) for IGF-1R og Ki-67 ble utført. Detaljer om IHC analyse er blitt beskrevet tidligere [27]. IGF-1 R-ekspresjon ble scoret ved å bestemme intensiteten og prosentandelen av positive celler. Intensitet ble scoret som negative (0), svak (1), moderat (2), eller sterk (3). Utvidelsen av positive celler ble scoret i seks kategorier: ingen farging (0), 1-5 (1), 5-25 (2), 25-50 (3), 50-75 (4), og 75-100% (+5) positive celler. En immunoreaktivitet score (IRS) ble beregnet ved å multiplisere den fargeintensitet og forlengelse, noe som resulterer i en skala fra 0 til 15. IRS ble delt i to grupper: negativ eller lav fargings (IRS 0-5) og positiv eller høy farging ( IRS 6-15). Ki-67 farging ble scoret som prosentandelen av positive atom flekker celler og nivået cutoff inndeles i henhold til prosenter av nukleær farging som 50% positive.
Reagenser
IGF-1Rß, fosfo IGF-1R (Tyr1135 /1136), fosfor-P44 /42 MAPK (Thr202 /Tyr204) og fosfor-Akt (Ser473) mAbs ble kjøpt fra Cell Signaling Technology. Anti-ß-arrestin1 og anti-ß-arrestin2 mAbs var fra Abcam. Anti-GAPDH mAb var fra Santa Cruz. Human IGF-1 og metformin ble innkjøpt fra Sigma. Figitumumab ble levert av Pfizer.
Cell Kultur
H446, H526 og SKBR3 celler ble kjøpt fra ATCC. H446 og H526 ble opprettholdt i RPMI-H1640-medium supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS). SKBR3 ble opprettholdt i DMEM supplert med 10% FBS.
Transfeksjon
sirnas mot SS-arrestin-en og ß-arrestin-2 ble oppnådd fra GenePharma (Shanghai, Kina). Transient transfeksjon av sirnas (30nm) ble utført ved anvendelse av Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) i følge produsentens protokoll.
Western blotting-analysen
Proteinprøver ble oppløst i litium-dodecylsulfat-prøvebuffer (Invitrogen) og like mengder av prøvene ble separert ved hjelp av SDS /PAGE. Detaljer om Western blotting-analyse er blitt beskrevet tidligere [22].
Densitometry Analyse
Band intensiteten ble kvantifisert ved ImageJ og resultatene ble normalisert til de tilsvarende laste kontrollene.
Celleviabilitet analysen
Celleproliferering ble målt med MTT (Sigma Chemical). Celler ble inkubert i 96-brønners plater, og etter passende behandling tidsrom, ble cellenes levedyktighet testet i henhold til produsentens protokoll. Triplicates ble utført for hver behandling.
Statistical Analysis
Forskjeller i pasientkarakteristika per gruppe og co-uttrykk markører ble beregnet ved Fishers eksakte test. Overlevelseskurver ble beregnet i henhold til Kaplan-Meier-metoden og sammenlignet ved log-rank test. Å identifisere prognostiske faktorer for OS og DFS, ble univariate Cox regresjonsanalyser utført. Student t-test eller ANOVA ble utført for å korrigere for multiple sammenligninger, som bevilget. Alle statistiske tester var tosidig og ble gjort ved hjelp av SPSS programvare 19,0 (SPSS Inc., Chicago, IL).
Resultater
IGF-1R uttrykk nivå korrelerer negativt med overlevelse av SCLC pasienter
Vi først undersøkt om IGF-1R uttrykk nivå kunne forutsi overlevelse av SCLC pasienter. Totalt 61 pasienter ble inkludert i vår studie, inkludert 39 menn og 22 kvinner, med en gjennomsnittsalder på 57,21 år (30-75 år). Median oppfølgingstid var 40 måneder, alt fra 5 til 81 måneder. De viktigste kliniske kjennetegn ved pasientene ble oppført i tabell 1 og representanten immunhistokjemisk farging ble vist i figur 1a. I korrelerende analyse mellom IGF-1R uttrykk og kliniske parametre, IGF-1R uttrykk var signifikant assosiert med tumorstørrelse, N-status, scene, og Ki-67 (tabell 1).
(a) immunhistokjemisk farging av IGF-1R og Ki-67 (x400) i SCLC pasientprøver i henhold til uttrykket nivå av IGF-1R. (B) Total overlevelse /sykdomsspesifikk overlevelse i SCLC henhold til lav- og høy-IGF-1R uttrykk. (C) Sykdomsfri overlevelse i SCLC henhold til lav- og høy-IGF-1R uttrykk
Vi har evaluert den prognostiske verdien av IGF-1R uttrykk knyttet til tre endepunktene. Total overlevelse (OS ), sykdomsspesifikk overlevelse (DSS), og sykdomsfri overlevelse (DFS). Vi fant at alle dødsfall ble SCLC-relatert, slik at DSS hadde samme resultat som OS. Kaplan-Meier-kurver av de to pasientgrupper for OS /DSS er vist i fig 1b. OS /DSS var signifikant lavere hos pasienter med IGF-1R-lav tumorer enn de med IGF-1R-høy-tumorer (P = 0,031). Lignende resultater ble også oppnådd for DFS-analyse (p = 0,048) (figur 1c). Våre resultater viste den potensielle anvendelse av IGF-1R som en markør for dårlig prognose for SCLC. Videre har vi brukt Cox regresjonsmodeller for å bestemme de uavhengige prediktorer for OS /DSS og DFS (tabell 2). Sex, scene, og IGF-1R ekspresjon var signifikante for OS /DSS (p = 0,006, 0,039, 0,037) i univariate Cox analyse, mens bare IGF-1R ekspresjon ble funnet å være en uavhengig prediktor i den multivariate Cox analyse (p = 0,037). For DFS, sex, scene, og IGF-1R uttrykk var statistisk signifikant i univariate Cox analyse (p = 0,002, 0,023, 0,048), mens noen parametere var signifikant i den multivariate Cox analyse. Totalt sett, våre kliniske data antydet at IGF-1R uttrykk nivå negativt korrelert med overlevelsen av pasienter, noe som tyder på at IGF-1R-targeting terapi, slik som CP, har potensielle terapeutiske verdier.
Antitumor effekter av CP i SCLC-cellelinjer
Siden IGF-1R er sannsynlig å spille en viktig rolle i SCLC, hemning av IGF-1R av CP, som konkurrerer med IGF å binde reseptoren, kan være nyttig for å behandle SCLC. Vi valgte H446 og h526, typiske SCLC cellelinjer, for å undersøke effektene av CP. Som vist i figur 2a, IGF-1 stimulering resulterte i IGF-1R auto-fosforylering og aktivering av nedstrøms PI3K /AKT og MEK /ERK signalveier i H446 og H526-celler, mens SKBR3, en brystcancer cellelinje kjent for å uttrykke lav mengde av IGF-1R, gjorde ikke svar godt.
(a) Cellene ble sultet i 12 timer og stimulert med 6.5nM IGF-1 for 10min. p-IGF-1R, t-IGF-1R, p-ERK, t-ERK, p-AKT, t-AKT og GAPDH ble påvist ved WB. (B) Celler ble behandlet med 0.065nM, 0.65nM, og 6.5nM av CP i 48 timer med tilstedeværelse eller fravær av serum. Celleviabilitet ble testet gjennom MTT. Antall levedyktige celler etter CP behandling ble presentert som prosent av ubehandlede celler. Vi gjorde hvert forsøk for tre ganger, og data ble representert som gjennomsnitt ± SEM. Statistisk analyse: * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001
Vi undersøkte følsomheten SCLC cellelinjer til CP behandling.. Som vist i figur 2b, etter behandling med 0.65nM CP, H446 og H526 cellelevedyktigheten sammenlignet med ubehandlede kontrollceller var 84,2% vs. 48,6% og 75,1% vs. 63,9% i serum-tilsatt medium og serumfritt medium (SFM ), henholdsvis, mens SKBR3 celleviabilitet ikke endre mye på CP behandling. Dette innebærer at effekten av CP er IGF-1R avhengig. Den SFM gruppe var ment for å skjerme konkurranse av IGF-1 som inneholdes i normalt serum medium. CP ble opprinnelig utviklet for å konkurrere med IGF1 for IGF-1R for å forhindre reseptoraktivering, og den anti-proliferativ effekt i serum-tilsatt medium støttet denne teorien. Men anti-proliferativ effekt i SFM forhold antydet at CP kan enten ytterligere undertrykke noen basale IGF-1R aktivitet som var umulig å oppdage ved Western blot, eller det kan ha andre anti-spredning /apoptose effekter uavhengig av IGF-1R auto-fosforylering /aktivering.
CP indusert IGF-1R endocytose /nedregulering med økt ERK-aktivering, men ikke for IGF-1R og PI3K /AKT
Som noen mAbs kan indusere rettet mot reseptoren endocytose og ned- regulering, undersøkte vi om CP har liknende effekter. Som vist i figur 3a, kan CP nedregulerer IGF-1R på en tidsavhengig måte som ligner på IGF-1-indusert reseptor endocytose /degradering. Interessant, sammenlignet med IGF-1, CP senkes kontinuerlig IGF-1R ekspresjon mens IGF-1R begynte å uttrykke tilbake etter 48 timer av IGF-1 stimulering (figur 3a), noe som tyder på en potent og langvarig effekt av CP på IGF-1R nedreguler .
(a) H446 og H526-celler ble serum-sultet i 12 timer og behandlet med enten 0.65nM CP eller 6.5nM IGF-1. IGF-1R og GAPDH ble oppdaget via WB. Intensiteten av IGF-1R ble kvantifisert ved densitometri, normalisert til GAPDH, og vist som en prosentandel av den intensitet ved 0h. (B) Cellene ble sultet i 12 timer og behandlet med 6.5nM IGF-1 eller 0.65nM CP for en rekke tidspunkter. Cellelysater ble analysert via WB for p-IGF-1R, t-IGF-1R, p-AKT, t-IGF-1R, p-ERK, t-ERK og GAPDH. (C) Cellene ble sultet i 12 timer og behandlet med 6.5nM IGF-1 eller 6.5nM IGF-1 pluss 0.65nM CP for en rekke tidspunkter. Cellelysater ble analysert via WB for p-IGF-1R, t-IGF-1R, p-AKT, t-IGF-1R, p-ERK, t-ERK og GAPDH. (D) Cellene ble behandlet med U0126 (0, 0,5, 1, 2, 3, 5, 8, 10 pM) i 60 min, og deretter inkubert med eller uten 0.65nM CP i 48 timer. Celleviabilitet ble testet via MTT. Cellelysater ble fremstilt med forskjellige konsentrasjoner av U0126 med eller uten CP, p-ERK og t-ERK ble analysert ved WB. (E) Slå ned av ß-arr1 og ß-arr2 av siRNA i H446 celler. (F) H446 celler ble slått ned for enten ß-arr1 eller ß-arr2. Cellene ble så sultet i 12 timer, behandlet med 0.65nM CP eller 6.5nM IGF-1 i 24 timer. Celler transfektert med egge siRNA som kontroll. IGF-1R og GAPDH ble oppdaget via WB. (G) H446 celler ble slått ned for enten ß-arr1 eller ß-arr2. Cellene ble så sultet i 12 timer, behandlet med 0.65nM CP eller 6.5nM IGF-1 i 10 minutter. Celler transfektert med egge siRNA som kontroll. p-IGF-1R, p-ERK og GAPDH ble detektert via WB. Vi gjorde hvert forsøk for tre ganger, og data ble representert som gjennomsnitt ± SEM. Statistisk analyse:. * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001
vekstfaktor-indusert reseptor endocytose er kritisk for RTK signaloverføring og hemming av endocytose kan dempe nedstrøms signal trasé [28]. Fordi CP ser ut til å ha en lignende effekt som IGF-1 på IGF-1R endocytose og nedbrytning, undersøkte vi om CP behandling kunne forandre nedstrøms signalveier. Som vist i figur 3b, etter celle sult, kan IGF-1 aktiverer IGF-1R signalveien på en tidsavhengig måte, med pakt og ekstra fordel nådde en topp etter 10 minutter av stimulering. Men CP klarte å indusere auto-fosforylering av IGF-1R eller aktivere PI3K /AKT (fig 3b). Aktivering av ERK var noe høyere, særlig etter 60min av CP-behandling, men det var fortsatt mye svakere enn den som aktiveres av IGF-1 (figur 3b). Videre undersøkte vi effekten av CP på IGF-1-avhengige nedstrøms signalering. Som vist i figur 3c, kan tilsetning av CP dempe fosforylering av IGF-1 R, AKT og ERK singling stimulert av IGF-1. Våre data antydet at CP kan nedregulerer IGF-1R i H446 og H526 celler, som er trolig gjennom mAb-indusert reseptor endocytose /degradering, og den går gjennom endocytose reseptor kunne ikke signifikant aktivere nedstrøms signalveier sammenlignet med IGF-1. Denne nesten «stille» reseptor nedregule fenomenet kan delvis forklare anti-tumor effekter av CP.
Hemming av ERK-aktivering ytterligere forbedrer den terapeutiske effekten av CP å målrette SCLC celler
Vi forsøkt å kombinere CP med andre rusmidler for å øke sin effekt mot SCLC. Vi la merke til at det var noen basal MEK /ERK-aktivering i H446 og H526 celler etter celle sult og perk nivået ble enda litt økt etter CP behandling (figur 3b). Gitt at CP-indusert ERK-aktivering kan ligge til grunn for den mekanisme av SCLC celleoverlevelse og medikamentresistens under CP terapi, undersøkte vi effekten av å kombinere CP med U0126, en spesifikk MEK /ERK-inhibitor for å inhibere den nedstrøms ERK-aktivering, på H446 cellelinjen . Som vist i figur 3d, celleviabilitet holdt avtagende med økende konsentrasjon av U0126, hvilket antyder en viktig rolle for MEK /ERK-signalering i SCLC. Videre var det en additiv effekt av U0126 pluss CP behandling, sammenlignet med enten U0126 bare eller CP bare, noe som tyder på en potensiell fordel for å hemme ERK under CP terapi. Og western blot resultatet viste hemmende effekt på U0126 MEK /ERK-signalering. Disse funnene er i tråd med Zinn.
et al
., Som erklærte at lav forbehandling p-ERK nivå kan være en indikasjon på følsomhet for IGF-1R lite molekyl hemmere i SCLC [29].
knockdown av ß-arrestin2 spesifikt hemmer MEK /ERK-aktivering i CP-behandlede SCLC celler
Vi har vist at CP kan indusere IGF-1R nedbrytning og ERK-aktivering. Vi prøver da å undersøke mekanismene for denne IGF-1R auto-fosforylering Uavhengig ERK-aktivering. Som en av de viktigste effektene av CP var å indusere IGF-1R endocytose /degradering, bestemte vi oss for å fokusere på beta arrestins (SS-arr), en viktig familie av proteiner som er involvert i IGF-1R ubiquitinering og endocytose [30]. Det er to SS-arrestin isoformer, ß-arr1 og 2, og de har blitt foreslått å være funksjonelt overflødig [31,32]. Vi brukte siRNA til knockdown bestemt ß-arrestin (ß-arr1 KD eller ß-arr2 KD) i H446-celler (figur 3e), med egge siRNA som kontroll. Vi først undersøkt deres effekt på IGF-1R degradering. KD av ß-arr1, men ikke ß-arr2, reddet IGF-1-indusert reseptor nedbrytning; Men KD av verken ß-arr1 eller ß-arr2 kunne hemme CP-indusert IGF-1R nedbrytning (Fig 3f). Vi studerte videre effekten av beta arrestins KD på ERK-aktivering. Overraskende, når vi slått ned ß-arr1 i H446 celler, perk nivået ble dramatisk økt i både IGF-1 og CP-behandlede grupper (Fig 3g), noe som tyder på en hemmende rolle ß-arr1 under ERK-aktivering. I motsetning til dette, i ß-arr2 KD celler aktivering av ERK var lavere i begge IGF-1 og TF-behandlede celler sammenlignet med kontrollceller. Våre data antydet at ß-arr2 var kritisk for ERK-aktivering, og kombinasjonen av CP med ß-arr2 KD dramatisk redusert den ekstra fordel under deteksjonsnivået av Western blot og indikerer potensiell terapeutisk verdi for å kombinere CP med ß-arr2 inhibitor til behandling av SCLC . Våre resultater er også i samsvar med publisert litteratur, hvor beta arrestins ble anmeldt til stillas tyrosin kinase og kan føre til aktivering av ERK i G protein-koblede reseptorer (GPCR) [33].
Metformin hemmer SCLC via IGF-1R signalveien
Neste vi spurte om vi kunne bruke CP sammen med en annen potensiell anti-kreft narkotika, metformin, for å forbedre sin effektivitet. Vi prøvde først å bekrefte anti-tumor effekt av metformin i SCLC ved å behandle H446 og H526 celler med metformin alene eller sammen med IGF-1 (figur 4a). Fordi IGF-1 stimulering svekket de anti-proliferative effekten av metformin, spekulerte vi at metformin og CP kan ha additiv anti-tumor effekter. Vi vurderte også konsekvens av metformin på IGF-1R signalveien, og som vist i figur 4b, ble IGF-1-stimulert IGF-1R fosforylering og nedstrøms PI3K /AKT og MEK /ERK-aktivering ble redusert etter behandling av celler med metformin. Også, i likhet med tidligere resultater, KD for ß-arr1 promo ERK-aktivering mens KD av ß-arr2 svekkede ERK-aktivering, og disse effektene forekom med både IGF-1 bare og IGF-1 + metformin-forhold i H446-cellelinjen (fig 4c) . Videre metformin også kunne nedregulerer IGF-1R på en tidsavhengig måte i H446-celler (figur 4d). Total, selv om de nøyaktige mekanismene for metformin anti-kreft effekt var unnvikende, våre data antydet at det fungerer delvis gjennom å hemme IGF-1R signalveien.
(a) H446 og H526 celler ble behandlet 48t med metformin (3 mm ) alene, IGF-1 (6.5nM) alene, eller IGF-1 + metformin. Celleviabilitet ble testet via MTT. Antall levedyktige celler etter behandling er presentert som prosent av ubehandlede celler. (B) Etter 12h sult, ble H446 og H526 celler behandlet med eller uten 3mM metformin i 1 time. Cellene ble deretter behandlet med 6.5nM IGF-1 for en rekke tidspunkter. Cellelysater ble analysert via WB for p-IGF-1R, t-IGF-1R, p-AKT, t-IGF-1R, p-ERK, t-ERK og GAPDH. (C) ß-arr1 og ß-arr2 KD H446 celler ble sultet i 12 timer og behandlet med eller uten 3mM metformin i 1 time. Cellene ble deretter stimulert med 6.5nM IGF-1 i 10 minutter. Cellelysater ble analysert for p-IGF-1R, p-ERK og GAPDH gjennom WB. (D) Cellene ble inkubering med 3mM metformin for en rekke av tidspunkter, og nivået av total IGF-1R ble detektert via WB. Vi gjorde hvert forsøk for tre ganger, og data ble representert som gjennomsnitt ± SEM. Statistisk analyse: * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001
Additive effekter av CP med metformin å målrette SCLC
Fordi effekten av metformin. og CP var ganske like når det gjelder reseptor nedregulering og IGF-1R signalveien hemming, vi spurte om det er noen additive anti-tumor effekt ved kombinasjon av metformin med CP. Vi testet H446 cellelevedyktighet (MTT måle) etter behandling med CP CP alene eller sammen med metformin, og forsøket ble utført både med og uten serum. I likhet med tidligere resultater, CP hadde mer dramatiske anti-proliferative effekter hos sultet betingelser sammenlignet med serumholdig betingelser (figur 5a). Intriguingly, metformin fremmet CP største virkninger mot SCLC-celler både i serum-inneholdende (82,6% vs. 64,5%) og SFM (49,4% vs. 40,7%) forhold.
(a) H446-celler ble forbehandlet med 3mM Metformin i 1 time, og deretter 0.65nM CP ble tilsatt under nærvær eller fravær av serum. MTT ble utført for å teste cellelevedyktigheten etter 48 timer inkubering. Antall levedyktige celler etter behandling er presentert som prosent av ubehandlede celler. (B) Etter 12 timer sult, ble cellene behandlet med eller uten 3mM av metformin i 1 time, og deretter behandlet med 0.65nM CP i 10 minutter. Cellelysater ble analysert for p-IGF-1R, t-IGF-1R, p-ERK, t-ERK og GAPDH via WB. (C) 3 mM metformin ble tilsatt til cellene i 1 time, deretter 0.65nM CP ble tilsatt til en serie tidspunkter. Ekspresjonsnivået av IGF-1R og GAPDH ble påvist gjennom WB. (D) ß-arr1 KD H446-celler ble behandlet med 3 mM metformin i 1 time, og deretter inkubert med 0.65nM CP i 24 timer. Nivåene av IGF-1R og GAPDH ble oppdaget via WB. Vi gjorde hvert forsøk for tre ganger, og data ble representert som gjennomsnitt ± SEM. Statistisk analyse:. * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001
Vi undersøkte mekanismen for denne additiv anti-kreft effekt. Fordi CP alene stimulert ekstra fordel, og vi har vist noen additive virkninger av rusmidler med MEK /ERK-hemmer, kan metformin fungere på samme måte for å hjelpe slå av ERK-aktivering. Men selv om CP alene fortsatt økt Perk nivå, og kombinerer CP med metformin kunne ikke hindre det (fig 5b). Derfor våre resultater antydet at medikamentet additive effekt av metformin er forskjellig fra den til MEK /ERK-inhibitor. Vi deretter undersøkt om metformin hadde noen additive effekter på reseptor nedregulering. Som vist i figur 5c, er tidsavhengig IGF-1R nedbrytning sees i både CP alene og TF + metformin-grupper, og metformin ytterligere kan forbedre CP-indusert reseptor nedregulering. Også, i likhet med tidligere resultater, ß-arr1 KD kan delvis redde IGF-1 pluss metformin indusert IGF-1R nedregulering, men ikke for CP pluss metformin (Fig 5d), mens ß-arr2 KD kunne redde verken (data ikke vist). Samlet våre resultater antydet en additiv terapeutiske effekten av CP med metformin å målrette SCLC. Dette kombinatoriske terapeutiske effekten kan være gjennom induksjon av ytterligere IGF-1R nedregulering, og våre data tydet på at denne prosessen ble regulert uavhengig av ß-arrestins.
Diskusjoner
Antistoff narkotika er nylig vært mye brukt i kreftbehandling. Selv om CP viste noen oppmuntrende resultater i kliniske fase II-studier for å behandle flere kreftformer, utfallet av klinisk fase III studie var skuffende. En av de viktigste ulempene med CP var mangel på effekt. En annen fersk klinisk studie for å teste CP ble tidlig avsluttet grunnet treg innmelding av pasienter. Derfor, for tiden er det behov for å vurdere om CP har nok terapeutiske verdier å gjenoppta den kliniske utprøvingen, og i så fall, hvordan vi kan stimulere til innmelding av pasienter. I denne studien undersøkte vi mekanismen av CP og evaluert potensialet i kombinasjonsbehandling for å målrette SCLC.
Vi har undersøkt på tvers av ulike SCLC pasient vev og i samsvar med verdifulle resultater, fant vi pasienter med høyere IGF-1R uttrykk svulster hadde en dårligere overlevelse (fig 1b), noe som tyder på en potensiell terapeutisk verdi av CP å målrette SCLC. I likhet med SCLC pasientens vev, H446 og H526-celler har forholdsvis høy ekspresjon av IGF-1 R (figur 2a), og CP behandling kan hemme formeringen av H446 og H526-celler i både serum-tilsatt og serumfrie betingelser (figur 2b). Den anti-proliferativ effekt i serumfrie forhold var overraskende fordi den IGF-1R var generelt ufosforylerte og inaktivt uten serum, og den viktigste effekten av CP ble antatt å konkurrere med IGF-1 til å binde /hemmer IGF-1R. Vår resultat antydet at ved siden av som en IGF-1 konkurrent, kan CP også hemme SCLC via en mekanisme som er uavhengig av IGF-1R auto-fosforylering. Vi har funnet CP kunne indusere IGF-1R endocytose /ned-regulering, som var mer potent enn det indusert av IGF-1, og CP-indusert gjennom endocytose IGF-1R holdt ufosforylerte og inaktive (figur 3b). Derfor kan en mulig forklaring være den går gjennom endocytose ufosforylerte IGF-1R kan utløse andre signalveier som fremmer anti-proliferative /apoptose effekter. Imidlertid bør denne hypotesen valideres i fremtidige studier.
Selv om CP ikke kunne aktivere PI3K /AKT som er nedstrøms av IGF-1R signalveien, viste vi at CP kan fremme ERK-aktivering, som ble formidlet via ß -arrestin2 mens hemmet av ß-arrestin1.
