Abstract
Bakgrunn
Signal transdusere og aktivatorer av transkripsjon 3 (STAT3) signalveien spiller viktige roller i onkogenese, angiogenese, immunitet, og tumorcelle invasjon. I denne studien undersøkte vi foreningen av interleukin (IL) -6 /STAT3 signalveien med T-lymfocytter og klinisk implikasjon hos pasienter med magekreft.
Metoder
Sytti en pasienter som gjennomgikk gastrektomi grunn adenokarsinom i ventrikkel ble studert. Blodprøver ble tatt før og etter kirurgiske gastrektomi for å kvantifisere nivåene av IL-6, IL-10 og VEGF ved å bruke et enzymkoblet immunosorbent assay, samt T-lymfocytt undergrupper (CD3
+, CD4
+, CD8
+, CD4
+ /CD8
+) og naturlige dreper (NK) celler ved en strømnings-cytometri. Videre ble uttrykket av IL-6, survivin, STAT3, STAT3 fosforylering (p-STAT3) og VEGF bestemt i human magekreft og tilstøtende normal slimhinne gjennom Western blot og immunhistokjemi.
Resultater
Postoperativ nivåer av IL-6, IL-10 og VEGF i serum var signifikant lavere enn preoperative nivåer. Prosenter av T-celleundergrupper og NK-celler i blodet ble signifikant økt etter postoperative uke 1, sammenlignet med preoperative gruppe, som ble ytterligere forsterket ved en måned etter gastrektomi. I tillegg ble ekspresjon av IL-6, Survivin, STAT3, p-STAT3, og VEGF økning i humane magecancer vev sammenlignet med tilstøtende normal slimhinne. Deres uttrykk var assosiert med TNM stadium av magekreft. Nivået av STAT3 aktivering i kliniske prøver ble korrelert med IL-6-ekspresjon. Alle mage tumorprøver, som uttrykte p-STAT3, også uttrykt IL-6 med svak uttrykk oppdaget i tilstøtende normal slimhinne.
Konklusjon
Økt IL-6-indusert aktivering av STAT3 ble observert i neoplastisk gastrisk vev, som positivt korrelert med tumorprogresjon. Dessuten, ble IL-6 og STAT3 nedstrøms signaler slik som IL-10 og VEGF redusert hos pasienter etter fjerning av magekreft, sammenlignet med pre-operasjon. Derfor kan inhibering av IL-6 /STAT3 signalveien tilveiebringe en ny terapeutisk strategi mot magekreft
relasjon:. Wang Z, Si X, Xu A, X Meng, Gao S, Qi Y, et al . (2013) Aktivering av STAT3 i Human Gastric kreftceller via Interleukin (IL) -6-Type Cytokin Melde korrelerer med kliniske implikasjoner. PLoS ONE 8 (10): e75788. doi: 10,1371 /journal.pone.0075788
Redaktør: Raya Khanin, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, USA
mottatt: 07.10.2012; Akseptert: 21. august 2013, Publisert: 07.10.2013
Copyright: © 2013 Dong et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien , utført i forfatternes laboratorium, ble støttet med tilskudd fra Utdannings Commission of Anhui-provinsen, Kina (Grant No. kj2011Z210) .De finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet .
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP er den nest vanligste årsaken til kreftrelaterte dødsfall, og nesten 1 millioner nye tilfeller diagnostisert verdensbasis hvert år [1]. Den totale overlevelsen er ikke vesentlig forbedret, selv om tidlig diagnose og terapeutiske behandlinger er i utvikling. Dette er delvis på grunn av ufullstendig forståelse av mekanismen bak tumorigenesis og metastasering av magekreft.
Signal svinger og aktivator av transkripsjon 3 (STAT3) er en transkripsjonsfaktor, som kan aktiveres ved tyrosinfosforylering som respons på vekst faktorer og cytokiner (for eksempel interleukin [IL] -6). IL-6, som opprinnelig ble karakterisert som en B-celledifferensieringsinduserende cytokin, er et cytokin som spiller en viktig rolle i et mangfold av biologiske funksjoner, inkludert inflammasjon, plasmacytom genese, immunglobulin-produksjon ved å mediere cellevekst, celleformering, og celleoverlevelse [ ,,,0],2-4]. Avhengig av celletypen, har IL-6 evnen til å virke gjennom forskjellige klassiske protein-kinase-reaksjonsveier, inkludert mitogen aktivert proteinkinase (MAPK) og phoshatidylinositol-trifosfat-kinase (PI 3-kinase) [5]. IL-6 bindes til IL-6 reseptor (IL-6R), som assosierer med gp130, og derfor aktiverer transkripsjonsfaktorene STAT1 og STAT3, via Janus-assosiert kinase (JAK), noe som fører til alvorlige uventede konsekvenser i neoplastisk vekst [6, 7]. Ved aktivering STAT3 hurtig translocates inn i kjernen, og binder til gjenkjenningssekvensen i promotoren av målgener (for eksempel cyklin D1, Bcl-2, Bcl-xL, matriks-metalloproteinaser og vaskulær endotelial vekstfaktor [VEGF]), for derved å øke deres transkripsjon [8-10]. Alle de nevnte genene er involvert i regulering av celle overlevelse, angiogenese, immununndragelser, og betennelse i tumor microenvionment.
STAT3 aktivisering bidrar til vekst stimulering, anti-apoptose, og angiogenese, som er signifikant assosiert med betennelse, immunitet, og onkogenese [7,11,12]. Følgelig er konstitutiv aktivering av STAT3 ansvarlig for en rekke humane kreftformer, inkludert eggstokk-kreft, brystkreft, leukemi, prostatacancer, hode- og nakkekreft og kreft i bukspyttkjertelen [13-17]. Blokade av JAK /STAT3 signal kan hemme veksten av humane cancere [17]. Nylig STAT3 har vist seg å spille en sentral rolle i opprettholdelsen av magekreftceller overlevelse [18-22]. Konstitutiv aktivering av STAT3 er prediktive for dårlig prognose i human magekreft [23-25]. Men fortsatt gjenstår det ukjent hvor aktiveres STAT3 via interleukin (IL) -6-type cytokin signale forbinder med T-lymfocytter endring i utviklingen av menneskets magekreft. Hensikten med denne studien var å finne ut om IL-6 /STAT3 signalveien forbinder med T-lymfocytter endringer, og korrelerer med utviklingen av menneskets magekreft.
Materialer og Metoder
Pasienter, Experimental design og behandling
Denne undersøkelsen er i samsvar med regelverket fastsatt av Anhui Medical University Etisk Komité, som følger protokollen skissert i WMA Helsinkideklarasjonen-Etiske prinsipper for medisinsk forskning som omfatter mennesker. Alle pasienter ble undersøkt og behandlet for formålet med studien på Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei, Kina, og undertegnet et informert samtykkeskjema. De menneskelige etiske retningslinjer i klinisk forskningsprosjekt No. kj2011Z210 (Tilskudd fra Pedagogisk-kommisjonen i Anhui-provinsen, Kina, PI: Dr. Zhengguang Wang) ble diskutert og godkjent av Human Etisk komité i First Affiliated Hospital Anhui Medical University mars 25, 2011. Alle inkluderte pasienter gjennomgikk total eller subtotal gastrektomi. Etter operasjonen hver pasient fikk fire sykluser eller flere av cellegift (kjemoterapi-regimer: FOLFOX4 program).
Kvalifiserte pasienter ble voksne (18 år til 75 år) med biopsi-bekreftet adenokarsinom i ventrikkel, som tidligere hadde fullført minst fire sykluser med kjemoterapi. I henhold til en tilfeldig prosedyre (1: 1 forhold) inn i forskning, alle pasientene hadde normal lever-, nyre- og benmargsfunksjon (beskrevet som hvite blodceller ≥3.5 x 10
9 celler /L, blodplater ≥80 x 10
9 celler /L, total bilirubin ≤ 2 × øvre normal, hemoglobin ≥9.0 g /dL og kreatinin ≤170 mikromol /l), og status ECOG funksjons mellom 0-2. Pasienter ble ekskludert for alvorlige lidelser, perifer neuropati (NCI-CTC1 nivå og over), graviditet eller amming. Pasienter som hadde verifisert fjernmetastaser ble ekskludert.
Klinisk Monitoring
Responses av kurativ behandling ble evaluert av immunforsvar på, før og etter hver behandling. Kreft pasientens livskvalitet scorer ut av 60 poeng, hvor en dårlig livskvalitet var mindre enn 20 poeng, og dårlig for 21 til 30 minutter, vanligvis for 31 til 40 poeng, bra for 51 til 60 minutter.
serum~~POS=TRUNC prøver~~POS=HEADCOMP
tilleggs~~POS=TRUNC serum (5 ml) ble samlet opp før behandling og postoperative uke 1, så vel som etter en måned. Serum ble sentrifugert ved 2000 rpm per minutt i 10 minutter, og det øvre fluidum (serum) ble oppsamlet.
Bestemmelse av serum cytokiner
Alle blodprøver uten EDTA ble sentrifugert umiddelbart, og deretter supernatanter ble alle lagret ved -80 ° C inntil analyse. Serumkonsentrasjon av humant IL-10, IL-6 og VEGF ble kvantifisert ved en enzym-bundet immunosorbant analyse (ELISA) i henhold til produsentens instruksjoner. Pakkene av IL-10, IL-6 og VEGF ble gitt av R 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Demografiske karakteristika for pasienter
Åtte pasienter ble rekruttert til studien, og 10 tilfeller ble tatt ut på grunn av svikt i å følge opp og død. Som vist i tabell 1, førti seks pasientene var menn og tjuefem var kvinner. Ved T verdi, ble 8 tilfeller inkludert i T1, 12 tilfeller i T2, 7 tilfeller i T3, og 54 tilfeller i T4. Histopatologiske observasjoner viste 62 tilfeller utstilt regional lymfeknute invasjonen og 9 tilfeller hade ingen lymfeknutemetastase. Ifølge TNM staging, ble 5 pasienter klassifisert som stadium I, 7 pasienter som stadium II, 8 pasienter som stadium III og 51 pasienter som stadium IV.
N
Andel
SexMale4664.8Female2535.2Age (år) 501521.1≥505678.9Primary svulst siteGastric cardia3346.5Gastric antrum1723.9Gastric body1926.8Gastric fundus22.8Diameter svulst 5 cm2433.8≥5 cm4766.2AdenocarcinomaModerately differentiated2332.4Poorly differentiated4867.6T stageT189.9T21214.8T378.6T45466.7TNM stageI57.0II79.9III811.3IV5171.8Lymph node metastasisPresent6287.3Absent912.7Length av postoperativ behandling. 3w5374.6≥3w1825.4Extent av gastrectomyTotal gastrectomy4969.0Subtotal gastrectomy2231.0Table 1. Demografiske karakteristikker av de 71 mage pasienter
CSV ned CSV
Analyse av Serumprøver kvantifisere IL-6, IL-10 og VEGF
i denne studien, 71 pasienter var kvalifisert. Før og ved slutten av hver operasjon, ble pasientenes serumprøvene kvantifisert for cytokinnivåer. I denne studien nivåene av IL-6, IL-10 og VEGF ble kvantifisert for å bestemme noen signifikant forskjell mellom cytokin-konsentrasjoner i serum preoperativt og postoperativt. Tabell 2 viste signifikant reduksjon av cytokin konsentrasjon av IL-6, IL-10 og VEGF i postoperative serumprøver, sammenlignet med preoperative nivåer (p 0,05). Nivåene av disse cytokinene ble ytterligere redusert i postoperativ måned 1 sammenlignet med de i postoperative uke 1 (tabell 2). Disse resultatene tyder på at nivåene av IL-6, IL-10 og VEGF blir mindre etter gastrektomi.
Variabel
n
IL-6 (ng /L)
IL-10 (ng /ml )
VEGF (ng/L)
Preoperative23498.9±90.7983.6±212.08347.8±1937.4Postoperative-week123380.2±87.5
*779.7±166.7
*7011.3±2044.8Postoperative-month125312.9±80.2
**731.9±144.6
*6275.5±2029.6
*Table 2. Sammenligning av serum cytokin nivåer av IL-6, IL-10 og VEGF i mage kreftpasienter.
Dataene er gjennomsnitt ± SD. Sammenlignet med preoperative gruppe,
* * P 0,01,
* P 0,05. CSV Last ned CSV
Analyse av T-Cell Delsett i pasienter og kontroller
De prosenter av T-celle undergrupper ble analysert i blod av en kohort av magekreftpasienter før og etter gastrektomi ved hjelp av flowcytometri. Vi har funnet at prosentandelene av T-celleundergrupper (CD3
+, CD4
+), og CD4
+ /CD8
+ forholdet, så vel som NK-celler ble signifikant økt etter postoperative uke 1, noe som ble ytterligere forsterket i postoperativ-måned 1 sammenlignet med de før gastrektomi (tabell 3). Imidlertid ble andelen av CD8
+ redusert på en måned etter fjerning av magekreft (tabell 3). Disse resultatene tyder på at immuntilstand er forbedret etter fjerning av magekreft.
Variabel
n
CD3
+ (%)
CD4
+ (%)
CD8
+ (%)
CD4
+/CD8
+
NK
Preoperative2350.5±6.431.6±7.227.8±7.31.1±0.626.9±8.1Postoperative-week12354.3±7.636.8±8.1
*24.3±8.41.5±0.9
*30.4±9.3Postoperative-month12562.6±5.4
**42.1±6.3
**22.5±7.9
*1.9±0.8
**34.2±7.9
**Table 3. Sammenligning av T-lymfocytter undergrupper under forskjellig tid i magekreftpasienter.
Data er gjennomsnitt ± SD. Sammenlignet med preoperative gruppe,
** P 0,01,
* P 0,05. CSV Last ned CSV
Expression og cellulær distribusjon av IL-6, Survivin STAT3, og VEGF i mage kreft vev
Uttrykket og cellulær distribusjon av IL-6, Survivin, STAT3 og VEGF i mage vev og tilstøtende normal slimhinne av pasienter med gastrektomi ble undersøkt ved hjelp av immunhistokjemisk farging. Det ble funnet at den expreesion av STAT3 ble øket i foci av magekreft vev sammenlignet med dens svak ekspresjon av STAT3 i tilstøtende normal slimhinne (figur 1). Den STAT3 farging ble hovedsakelig lokalisert i kjernen av magekreftceller. Tilsvarende ekspresjon av IL-6, overlevende og VEGF ble også sterkt øket i mage cancer vev sammenlignet med de i tilstøtende normal slimhinne (figur 1).
Uttrykket og lokalisering av STAT3, IL-6, VEGF, og survivin i magekreftceller ble bestemt ved hjelp av immunhistokjemisk farging. Det var svakt eller negativt ekspresjonen av STAT3 i tilstøtende normal slimhinne. Men det var sterkt uttrykk av fosforylert STAT3 i mage kreft vev. Den STAT3 farging ble hovedsakelig lokalisert i kjernen av tumor epitelceller som ble indikert av en rekke gulaktige granuler. STAT3 overekspresjon var assosiert med med økt ekspresjon av IL-6, overlevende, og VEGF samt med økt kar tetthet (Original forstørrelse av A1-A3 og B1-B3, x 400, A4 og B4, x 200) ..
for ytterligere con fi rm økt uttrykk for STAT3, p-STAT3, IL-6, survivin og VEGF i mage kreft vev, vi også utført western blotting for å bestemme sine nivåer med anti-STAT3, anti-fosforylert STAT3 (Tyr705), anti-IL-6, anti-survivin, anti-VEGF-antistoff, respektivt. Som forventet, ble et enkelt bånd observert ved anvendelse av hvert antistoff (figur 2A), og proteinnivåer av IL-6, Survivin, STAT3, p-STAT3 og VEGF i humane magecancer vev var alle betydelig høyere enn de som er i tilstøtende normal slimhinne vev (alle P 0,001, figur 2B). Disse resultater impliserer at IL-6 /STAT3 signaler blir aktivert i magekreft vev.
Protein nivåer av IL-6, Survivin, p-STAT3, STAT3, og VEGF i normal gastrisk og tumorvev ble bestemt ved anvendelse av western blotting. Beta-aktin var en lasting kontroll. Relativ protein ekspresjon av IL-6 (A), VEGF (B), som overlever (C), p-STAT3 (D) var normalisert til av den tilsvarende beta-aktin-nivå. Positive immunreaktive bandene var quanti fi sert densitometrically og uttrykt som IL-6, Survivin, p-STAT3, STAT3, og VEGF i enheter optisk tetthet, henholdsvis. * P. 0,01 tumorvev versus normale mage vev ved enveis ANOVA med post-hoc Tukey tester
IL-6 /STAT3 aktivering korrelert med TNM stadium i magekreft
som vist i tabell 4, ble den økt ekspresjon av STAT3 ved immunhistokjemi signifikant korrelert med TNM stadium av magekreft. Tilsvarende prosentandel av IL-6, overlevende, og VEGF-ekspresjon ble betydelig økt i høyere TNM stadium i forhold til lav TNM stadium av magekreft (tabell 4). Disse resultatene viser at aktivering av IL-6 /STAT3 veien er forbundet med TNM stadium av magekreft.
STAT3
P
verdi
Survivin
P
verdi
IL-6
P
verdi
VEGF
P
verdi product: + –
+
– product: +
– product: + –
Normal mage tissue4 (13,3%) 269 (30%) 213 ( 10%) 272 (6,7%) 28Gastric kreftvev I2 (40%) 34 (80%) 11 (20%) 43 (60%) 2II5 (71,4%) 2P 0,057 (100%) 0P 0,054 (57,1%) 3P 0,055 (71,4%) 2P 0.01III7 (87,5) 16 (75%) 27 (87,5%) 17 (87,5%) 1IV46 (90,2%) 551 (100%) 047 (92,2%) 444 (86,2%) 7Table 4. Sammenheng mellom STAT3, survivin, IL-6, VEGF uttrykk og TNM stadier i mage kreftpasienter.
CSV ned CSV
Diskusjoner
IL-6 og nedstrøms signaler, for eksempel STAT3, spille viktige roller i ferd med i fl inflammasjon og immunitet avvikende, så vel som karsinogenese [28-30]. STAT3 aktiveres i noen få sekunder eller timer, og deretter deaktiveres for å opprettholde homeostase under normale omstendigheter. Men STAT3 aktivering fortsetter, noe som utløser onkogen transkripsjon etter unormale tilstander [25,31]. Samle bevis indikerer økt uttrykk og aktivering av STAT3 i menneskets magekreft [18-25,32]. Det er fortsatt uklart om økt IL-6 /STAT3 aktivering korrelerer med avvikende immunitet i progresjon og invasjonen av magekreft. I den foreliggende undersøkelse, observerte vi nivåene av IL-6, IL-10 og VEGF i serum ble signifikant redusert etter fjerning av magekreft. Dette kan føre til økte prosentandeler av CD3
+ og CD4
+ T-lymfocytter, samt NK-celler. I tillegg ble IL-6 /STAT3 signaler inkluderende overlevende og VEGF betydelig utvidet i magekarsinom vev sammenlignet med tilstøtende normal slimhinne. Total, våre funn gir det første bevis på at øket IL-6 /STAT3 aktivering korrelerer med avvikende immunitet, som fører til progresjon og invasjonen av magekreft.
IL-6 har blitt vist å forbedre invasjon av magekreftcellene gjennom vedvarende aktivering av STAT3 [33,34]. Dette er i overensstemmelse med våre funn at IL-6-ekspresjon ble merkbart forbundet med STAT3, og de ble både over-uttrykkes i human magekreft. Svak ekspresjon av både IL-6 og STAT3 ble funnet i tilstøtende normal slimhinne. Økt VEGF og Survivin ekspresjon på grunn av høyt aktivering av IL-6 /STAT3, bidrar gastrisk kreft celler til å vokse raskere og for å fremme fjernmetastaser [22,35-37]. Fjerning av magekreft fører til reduksjon av IL-6 og VEGF. Dette tyder på at tumormikromiljøet spiller også en viktig rolle i aktivering av IL-6 /STAT3 vei, som danner en ond sirkel for å fremme tumorgenese og invasjon.
Cancer immunesurveillance er en viktig prosess for å eliminere tumorceller [38]. Dette blir bekreftet at økt antall T lympocytes i tumorvev er signifikant korrelert med lavere frekvens av metastaser, tilbakefall og lang overlevelse, til tross for kontroversielle rapporter eksisterer [27,39] [34]. Imidlertid tumorer har en evne til å unnslippe immunesurveillance. IL-10 er en av de immunosuppressive cytokiner, som er forhøyet i blod ved avansert magekreft [40-42]. Dette fører til manglende evne til å eliminere tumorceller i svulsten mikromiljø. Faktisk, mage kreftceller selv kan utskille IL-10, noe som kan forklare dens reduksjon i pasienter etter fjerning av magekreft, sammenlignet med før bruk i den foreliggende undersøkelsen. IL-10 har en dobbel virkning på T-lymfocytter og NK-celler [42-44]. Dette er i overensstemmelse med våre funn at antallet av T-lymfocytter og NK-celler er økt i sirkulasjonssystemet av pasienter etter fjerning av magekreft sammenlignet med pre-operasjon. Våre studier støtter også tanken om at mage kreftpasienter etter postoperative uke 1 fortsatt har en ubalanse i sine T-celle undergrupper, men tilnærmet normal etter postoperativ-måned 1. Med uttrykket av IL-10 og infiltrasjon av T-lymfocytter ( f.eks CD3
+, CD4
+, CD8
+) samt deres korrelasjon innenfor tumorvev er ikke kjent, må vurderes nærmere.
Det er vist at STAT3 aktivering i tumorceller kan formidle en immunrespons ved å hemme aktiviteten av immunceller gjennom inflammatoriske cytokiner trolig slipper fra invadere svulstvev [12,45]. Våre data indikerer at Stat3 signalveier spiller en viktig rolle i å fremskynde immunologisk toleranse. De fleste av de tidligere studier har rapportert at STAT3 aktivering i aggressive ondartede sykdommer og andre karsinomer er en negativ prognostisk faktor. Våre resultater har også vist at en mer aggressiv klinisk oppførsel av magekreft med aktivert STAT3, for eksempel hyppigere stort fartøy invasjon, og lavere priser for komplett resectability. Rollene til STAT3 i immunresponser, tumorvekst og reduksjon av T-celle-infiltrasjon i kreftceller tyder på en ny mekanisme for cellulær faktor [45,46]. Aktivering av STAT3 var en markør for positiv klinisk oppførsel. Disse funnene tyder på at STAT3 kan fungere som en regulator av gastrisk kreft på grunn av sin forbindelse med IL-6. Med disse dataene i tankene, og andre nye studier på STAT3 signalveien, er det verdt å utforske en roman STAT3 målrettet behandling for magekreft [47-49].
I konklusjonen, IL-6-indusert aktivering av STAT3 er observert i neoplastisk gastrisk vev, som positivt korrelert med tumorprogresjon. Dessuten, ble IL-6 og STAT3 nedstrøms signaler slik som IL-10 og VEGF redusert hos pasienter etter fjerning av magekreft, sammenlignet med pre-drift, denne var forbundet med utvinning av T-lymfocytter og NK-celler i perifere sirkulasjonen i disse pasientene. Derfor kan hemming av IL-6 /STAT3 signalveien gir en ny terapeutisk strategi mot magekreft.
Takk
Vi takker alle pasienter og deres familier. Vi takker også alle medlemmer av vårt laboratorium for deres tekniske assistanse, verdifulle kommentarer og oppmuntring. Vi takker Dr. David J. Blake fra Fort Lewis College for kritisk lesning av dette manuskriptet.
