Abstract
Prostatakreft (PCA) er en blant de vanligste cancersin vestlige menn. Insidensraten ofPCa er på vei oppover over hele verden. Denne studien omhandler theserum lipidome profilering av pasienter diagnostisert med PCa å identifisere potensielle nye biomarkører. Vi anvendte ESI-MS /MS og GC-MS for identifisering av signifikant endret lipider i kreftpasientserum sammenlignet med kontrollene. Lipidomiske data avslørte 24 lipider er vesentlig endret i kreft patinet serum (n = 18) sammenlignet med normal (n = 18) med ingen historie med PCa. Ved å bruke hierarkisk clustering og prinsipal komponent analyse (PCA) vi kunne klart atskilte kreftpasienter fra kontrollgruppen. Korrelasjon og partisjon analysen sammen med Formell Concept Analysis (FCA) har identifisert at PC (39: 6) og FA (22: 3) kunne klassifisere prøver med høyere sikkerhet. Både lipider, PC (39: 6) og FA (22: 3) kunne påvirke katalogisering av pasienter med 100% sensitivitet (alle 18 kontrollprøver er klassifisert riktig) og 77,7% spesifisitet (18 tumorprøver 4 prøvene er feilklassifisert) med
p
-verdi av 1,612 × 10
-6 i Fischer eksakte test. Videre, utførte vi GC-MS for å betegne fettsyrer endres i PCA pasienter, og funnet at alfa-linolensyre (ALA) nivåene blir endret i PCa. Vi utførte også en
in vitro
proliferasjonsanalyse for å bestemme virkningen av ALA i overlevelse av klassisk humane cellelinjer PCA LNCaP og PC3. Vi herved rapporterer at den endrede lipider PC (39: 6) og FA (22: 3) har et nytt sett av biomarkører i tillegg til de eksisterende diagnostiske tester som kunne gi en betydelig bedre sensitivitet og spesifisitet ved PCA diagnose
. Citation: Duscharla D, Bhumireddy SR, Lakshetti S, Pospisil H, Murthy PVLN, Walther R, et al. (2016) Prostate Cancer Associated Lipid signaturer i Serum Studerte ved ESI-Tandem Mass Spectrometryas potensielle nye biomarkers. PLoS ONE 11 (3): e0150253. doi: 10,1371 /journal.pone.0150253
Redaktør: Mohammad Saleem, Hormel Institute, University of Minnesota, USA
mottatt: 10 juni 2015; Godkjent: 11 februar 2016; Publisert: 09.03.2016
Copyright: © 2016 Duscharla et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. prosjektet er støttet av Institutt for bioteknologi (DBT), Ministry of Science of Technology, India. Gi No: 6242-P- 54 /RGCB /PMD /DBT /RHUN /2015. DD erkjenner Rådet for industriell og teknisk forskning (CSIR), India for CSIR-JRF fellesskap og AcSIR for å registrere deg som graduate student
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Forkortelser: PCA, prostatakreft; ALA, Alpha linolensyre; ESI-MS, Electrospary ionisering massespektrometri; GC-EMS, gasskromatografi med elektron ionisering massespektrometri
Innledning
Til tross for betydelige fremskritt oppnådd i diagnose og behandling av PCA fortsatt er det den nest mest årsaken til kreft-relaterte dødsfall, neste til lungekreft blant menn [1]. Obduksjons undersøkelser har avdekket at 30% av menn over 50 år og 80% av menn over 70 år har bevis for forekomst PCa [2]. Tidlig diagnose og aggressiv behandling er det eneste alternativet å kurere PCa. Biomarkører spiller en viktig og avgjørende rolle i tidlig diagnose av PCa. Inntil nå screening av for PCa innebærer digital endetarms eksamen (DRE) og prostata spesifikt antigen (PSA) blodprøve. Men disse to testene for tiden i bruk for PCa diagnose er sub-optimale fordi PSA er rikelig stilles ved prostatahyperplasi epitel og også skilles ut av epitel uretrale kjertler. PSA uttrykk er ikke spesifikk for vevet eller kjønn, vil det bli utskilt av både godartede og kreftceller i prostata [3]. Avanserte «omics» teknologier har identifisert endret genom, transkriptom og proteom relatert til PCa. Disse studiene har gitt en rekke potensielle genomisk og proteomikk biomarkører for diagnostiske formål. Imidlertid er ingen av disse markørene oversatt til rutinemessige diagnostiske og /eller prognostiske applikasjoner. Følgelig finnes det utallige muligheter for enten enn diagnostisering av pasienter med begrenset mulighet for kreft eller under diagnostisering av pasienter som allerede lider av sykdommen. Dermed mangel på dagens diagnostiske metoder for prostata sykdommer understreker behovet for forbedring på dette området.
Diagnostisering kreft basert på serum profilering er et attraktivt konsept. En rekke studier har ansatt proteomikk og genomisk analyse av serumprøver fra kreftpasienter. Bare sparsom informasjon er tilgjengelig på metabolomet endringer spesielt fettsammensetning i serum /plasma forbundet med PCa. Unormal lipidmetabolisme er blitt vist å være assosiert med mange sykdommer som inflammasjon, diabetes, nyresvikt og hjertesvikt så vel som mange kreftformer; således indikerer at lipid metabolitter kan brukes som sykdoms biomarkører [4]. Dessverre, til det beste av vår kunnskap, bare noen få rapporter har blitt funnet analysere lipider fra PCA pasienter i forbindelse med sykdomsprogresjon. En studie rapporterte at apolipoprotein og kolesterol sammen diagnosen eggstokkreft med 97% nøyaktighet [5]. I kolorektal cancer, endret linolsyre (LA), alfa-linolensyre (ALA), arakidonsyre og oljesyre ble vist å være assosiert med kreft progresjon [6]. Men i disse studiene bare noen få klasser av lipidswere analysert på grunn av tekniske begrensninger. To nyere studier har rapportert at thephospholipidalterations er forbundet med PCa [7,8]. Spesielt kreft progresjon avhenger av spredning og invasjon av tumorceller til fjerntliggende organer. Tumorceller gjennomgå funksjonelle og morfologiske endringer, mange av dem starter med cellemembranen slippe sine komponenter i blodet. Lipidomicsapproach har blitt anvendt for å identifisere biomarkører og studere rollen til lipider i sykdomsutviklingen av mange metabolske forstyrrelser slik asobesity [9], aterosklerose [10], hypertensjon [11], diabetes [12], cystisk fibrose [13] og cancere [14] . Nylig Patel et al. har rapportert at en tre lipid signatur (fosfolipider) kan skille PCA pasienter fra normale individer [8]. Derfor søkte vi å undersøke komplette lipidprofil som dekker ulike klasser av lipider inkludert fettsyrer, TGS, DG og fosfolipider i serum fra PCA pasienter. Disse lipide signaturer kan bli anvendt for screening av PCA-pasienter sammen med eksisterende diagnostiske tester med bedre spesifisitet og følsomhet. Videre tror vi at lipidomicapproach vil identifisere lipider og tilhørende veier, som kan spille en rolle ved PCA initiationand progresjon.
Materialer og metoder
Kjemi
Interne standarder (heptadeconoic syre og metyl heptadecanoate), så vel som mettede og umettede fettsyrer som brukes i studiet ble innkjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Analytisk kvalitet Midlene ble anvendt for å fremstille stamløsninger av fettsyrer. Etanol ble kjøpt fra kommersielle Alkoholer, Canada. Metanol brukes i ESI-MS-analyser ble kjøpt fra Merck, Mumbai, India. Diazometan i eter brukes til esterifisering (metylering) av fettsyrer av kjent metode.
kliniske prøver og etikk erklæringen
De serumprøver og påfølgende patologiske data ble samlet etter å ha innhentet pasientens samtykke ved å fylle samtykkeerklæringer som ble utarbeidet og godkjent av institusjonelle etiske komité. Den institusjonelle etikk og bio sikkerhet komiteen av Nizam Institute of Medical Sciences (NIMS) Hospital, Hyderabad, godkjent India denne studien. For lipidomics ble blodprøver samlet inn fra pasienter med høyt serum PSA-verdier og patologisk undersøkelse før enhver kjemoterapi eller kirurgi. Serumprøver separert fra fullblod ble lagret ved -80 ° C inntil de totale lipider ble isolert ved hjelp av oppløsningsmiddelekstraksjon fremgangsmåte.
Valg av pasienter og prøveinnsamling
For de foreliggende studien serumprøver ble oppsamlet fra 18 pasienter med forhøyede PSA nivåer diagnostisert med PCa fra NIMS sykehus prøve arkiv for forskningsformål. Alle pasienter som er valgt for denne studien ikke gjennomgår noen behandling og /eller operasjon før innsamling av blodprøver. For bekreftelse av PCA ble diagnosen for hver pasient etablert av histopatologi av prostata biopsier. Hver pasient informasjon, inkludert deres alder, serum PSA verdi og patologisk diagnose som for eksempel svulst klasse og Gleason scoreis gitt i tabell 1. For kontrollgruppen ble 18 serumprøver fra mannlige kontroller hentet fra instituttet dispensary hvor pasientene hadde sin rutinesjekk for velvære eller for diagnostisering av andre sykdommer. Vi hadde satt et kriterium inkludert alder målrettet med noen historie med diagnostisering av PCA samle inn disse kontrollprøver. Serumprøver ble tatt fra både tumor og kontrollgruppen individer på samme måte. Fra hver enkelt, ble 5 ml helblod oppsamlet i en vakutainer rør inneholdende trinatriumcitrat. Rørene ble tillatt å stå i 10 minutter for å koagulere, og deretter sentrifugert ved 3000 RPM for å samle serum. Den klare væsken fra overflaten ble samlet inn og lagret som separate alikvoter ved -80 ° C inntil bruk.
De kliniske parametre av svulster Gleason score og PSA-verdier er gitt.
Isolasjon /utvinning av totale lipider fra serumprøver
Totalt lipider fra prostatakreft og normale serumprøver ble hentet som tidligere rapportert av Bligh og Dyerwith mindre modifikasjoner [15]. I korthet, lipider ble ekstrahert fra serumprøver ved å erstatte kloroform med diklormetan (DCM) [16,17]. En 30 ul aliquot av serum ble tilsatt withan intern standard (1,5 ul 50 uM methyl heptadecanoate for positive ion ESI-MS-analyse eller heptadeconoic syre for negative ion ESI-MS-analyse), og tilsatt 190 pl MeOH. De mixturewasvortexed i 30 sek og deretter 380 ul av DCM ble tilsatt til blandingen og igjen vortex-blandet i 30 sek. Til slutt, for å forbedre separasjonseffektiviteten av to faser, 120 ul vann ble tilsatt og blandet ved virvling i 15 sek. Deretter ble blandingen tillatt å ekvilibrere ved romtemperatur i 10 minutter og underkastet sentrifugering ved 8000g i 10 min ved 10 ° C for separering av fasene. Det øvre lag ble forsiktig fjernet. Den nedre lipidrike DCM laget ble oppsamlet i en separat 1,5 ml mikro- tubeandthe Oppløsningsmidlet ble fordampet i centrivap under vakuum ved 4 ° C. Til slutt ble de tørkede lipidekstrakter rekonstituert i 100 pl buffer (ACN /IPA /H
2O i 65: 30: 5 v /v /v) før den utsettes for å lede ESI-MS-analyse. For GC-MS-analyse av det tørkede lipidet ekstraktet ble videre underkastet metylering ved hjelp av diazometan.
elektrospray ionisering Massespektrometri (ESI-MS) -analyse
Eksperimentene ble utført ved bruk av en kvadrupol time-of- flight massespektrometer (QSTAR XL, Applied Biosystems /MDS Sciex, Foster City, CA, USA) utstyrt med en ESI kilde, anskaffe data ved hjelp Analytiker QS programvare (Applied Biosystems). Alle prøvene ble innført i kilden ved strømnings injeksjon (10 ul loop) under anvendelse av metanol som den mobile fase ved en strømningshastighet på 0,03 ml /min. Prøvene ble analysert under positive og negative ESI-betingelser. De typiske positive ion ESI Betingelsene var: kapillær spenning, 5 kV; declustering potensialer (DP1), 60 V; DP2, 10 V; fokus potensial, 250 V. Den typiske negative ion ESI forholdene var: kapillær spenning, -4,5 kV; DP1, 60 V; DP2, 10 V; fokus potensial, ble 250 V. full scan massespektra registrert over massen spekter av
m /z
50-2000 bruke en time-of flight (TOF) analysator med en oppløsning på 10 000 Full bredde Half Maximum. Nitrogen ble anvendt som gardin gass og kollisjonen gass, mens luft ble anvendt som forstøver. For struktur identifikasjon, ble kollisjons-indusert dissosiasjon (CID) spektra registreres ved å velge forløperion av interesse å bruke kvadrupol, slik at de kan fragment i kollisjonen celle, og skille produktioner av TOF analysator. De kollisjonsenergier som ble brukt var mellom 5 til 25 eV. De eksperimentelle betingelser anvendt for prøvene er den samme som for referansestandarder. Alle spektra rapportert var gjennomsnitt på 25 til 30 skanninger. Elementær preparatene ifølge alle forløperioner samt produktioner oppnådd fra de nøyaktige masseverdiene ved hjelp av Analyst programvaren.
GC-analyse EIMS
GC-EIMS analyser ble utført ved anvendelse av et Agilent 6890 gasskromatograf (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) utstyrt med en 5973N masseselektiv detektor (MSD). HP-5MS kapillærkolonne (30 m x 250 um, i.d.: 0,25 mikrometer filmtykkelse) ble benyttet for kromatografisk separasjon av fettsyre metylester (FAME) derivater. 1 pl av prøven prøve ble injisert i GC-MS-instrument i splitless-modus typen injeksjon. GC-ovnen ble programmert til å øke fra 50 ° C til 280 ° C ved en hastighet på 10 ° C /min rampe og begynnelses- og slutt-temperaturen ble holdt i 2 minutter og 5 minutter henholdsvis. Total driftstid var 30 min. Helium ble anvendt som bærergass ved en konstant strømningshastighet på 1 ml /min. Innløpet og GC-MS innvendig temperatur ble holdt ved 250 ° C og 280 ° C respektivt. EI kilde og kvadrupol analysator ble holdt ved 230 ° C og 150 ° C respektivt. Databehandling ble gjort ved hjelp av MSD ChemStation programvare (Agilent Technologies, USA). Den massespektrometer ble operert i begge full scan og valgte ion overvåking (SIM) modus. Den massespektrometer ble skannet fra
m /z
29-600 full scan modus for analyse.
metylering av fettsyrer for GC-EIMS analyse
Utvinning metode for total lipider fra serumprøve var samme som beskrevet ovenfor, bortsett fra det siste trinnet rekonstituering. For GC-MS-analyse, ble tørket serum lipidekstrakter direkte underkastes metylering ved å bruke diazometan reagens, hvorved de ikke-flyktige fettsyrer som er tilstede i serumprøver ble omdannet til flyktige Slike fettsyremetylestere. Eksempel ampuller inneholdende tørkede lipid ekstrakter ble tilsatt 1 ml av nyfremstilt diazometan i eteroppløsning. Ampullene ble raskt virvlet i 10 sekunder og fikk stå ved romtemperatur i 10 min. Prøvene ble konsentrert til 50 pl ved bruk av ScanVac. Standard-fettsyrer i etanol (0,3 ml av 5 mM) kastes metylering ved å bruke den ovennevnte fremgangsmåten etter fordampning av etanol. For identifisering av forbindelser, ble de samme forsøksbetingelser opprettholdes for prøvene og referansestandarder.
Database søk
De nøyaktige masseverdier for alle de oppdaget topper (
m /z
) i både positive og negative former for ESI-MS-analyse av ekstraktene ble tatt i betraktning, og de ble søkt i metabolitten databaser med en masse toleranse på 5-10 ppm. Databasene inkluderer Lipid Maps, Metlin (https://metlin.scripps.edu/index.php) og Human metabolomet Database (HMDB) (https://www.hmdb.ca./spectra/ms/search) [18 ]. Database treff (med mindre ppm-verdier) sammen med isotop fordelingsmønstre ble brukt for topp identifisering. Noen av de viktige metabolitter ble ytterligere bekreftet ved MS /MS-analyse. MS /MS-spektra ble sammenlignet med data som er tilgjengelige i litteraturen, så vel som den American Oil Chemists Society (AOCS) lipid-bibliotek (https://lipidlibrary.aocs.org/ms/ms16/index.htm) [7]. Noen lipider ble også bekreftet fra GC-MS-data ved å sammenligne enten retensjonstider av standarder eller EI massespektra tilgjengelig i AOCS lipid bibliotek.
Statistiske og bioinformatikk analyse
t-test ble utført for å sammenligne konsentrasjonene av lipid identifiserte arter mellom kreftpasient og kontroll (uten PCA) grupper. Lipid signaturer som viser forskjeller med mer enn 1,5 ganger økning eller reduksjon med observert
p
verdi 0.05were anses som forskjellig regulert lipider blant PCA pasienter. Ytterligere en FN-overvåket analyse ble utført for å identifisere de beste lipid signaturer som kan diskriminere normale og kreftutvalgsgrupper. Hierarkisk clustering analyse (HCA), prinsipal komponent analyse (PCA), har korrelasjons plott og partisjon analyse er anvendt for kvantifisering data innhentet. I tillegg, basert på overflod av lipider enkeltvis og /eller i kombinasjoner, ble formelt begrep analyse (FCA) som brukes for å forutsi klassifisering av prøver. FCA metode er egnet for å finne ut betydelige forbindelser mellom endrede lipider og kliniske data for pasienten matematisk ved grafisk illustrasjon [19]. Disse illustrasjonene couldenvisagetheoretical hierarki på tvers av prøver og data således fremstilt kan bli brukt for å finne ut data avhengighet mellom prøve attributter (kliniske data og endrede serumlipider). Nylig er FCA vanligvis brukes for teoretisk clustering å identifisere kombinatoriske biomarkører og samtidig regulering av gener, proteiner og metabolitter [20,21]. I denne studien ble FCA metoden brukes til å identifisere noen sammenheng mellom overflod av serumlipider og klassifisering (tumor og kontrollgrupper) av prøvene. I FCA analyse teoretiske rister ble bygget basert på lav eller høy overflod av lipider å forstå avhengigheten av serumlipider overflod med PCa og normale prøver. De rister ble trukket i kombinasjoner eller enkelt lipid arter klassifisert utvalgsgrupper med ulike særegenheter.
Celleproliferering analysen
Den menneskelige PCA cellelinjer LNCaP (androgen avhengige celler) og PC3 (androgen uavhengige celler) ble oppnådd fra ATCC og holdes i normal vekstmedium (RPMI-1640 (Sigma) supplementert med 10% føtalt bovint serum (FBS) sammen med 100 enheter /ml penicillin og streptomycin). Begge cellelinjene ble dyrket i fuktet inkubator ved 37 ° C med en konstant tilførsel av 5% CO
2. Mycoplasma forurensning av celler i kultur ble kontrollert av regelmessig testing med spesifikke primere i RT-PCR. For å bestemme virkningen av alfa-linolensyre på proliferasjon av PCA-cellelinjer, ble LNCaP og PC3-celler sådd ut i 12 brønners plater (1,0 x 10
6-celler per brønn) i komplett medium. Celler ble tillatt å vokse i 24 timer slik at de kan festes på brønnoverflaten. Deretter ble cellene behandlet med indikerte konsentrasjoner av ALA (0-25 uM) eller bærerkontroll (løsningsmiddel i hvilket ALA fremstilles). For å måle celletall, ble cellene høstet ved indikerte tidsintervaller og celle levedyktighet ble beregnet ved hjelp av grevinne (Invitrogen) i celle levedyktighet analysator (Invitrogen). Både tid avhengig samt konsentrasjonsavhengig effekt av ALA på cellelevedyktigheten ble bestemt i proliferasjonsanalyser. Effekten av ALA på celle morfologi ble bestemt av tenkelig cellene i henhold mikroskop (Olympus Xi72, Japan).
Resultater
De serumprøver fra normal (kontroll) og kreftpasienter ble behandlet likt som beskrevet i den eksperimentelle delen. Prøve prøver ble deretter utsatt for direkte høyoppløselige ESI-MS-analyse i henhold til positive og negative ion moduser.
Positiv ion ESI-MS analyse
Den positive ion ESI massespektra utstilt ioner i området av
m /z
100-1000 grunn av forskjellige metabolitter (figur 1A). Som prøve aliquoter ble analysert ved direkte ESI-MS-metoden, som unngår kromatografi og avsaltingstrinn, Na
+ og K
+ -ioner som er tilstede i serum forbli i prøve alikvoter. Dermed kunne de oppdagede ioner bli protonert, sodiated og /eller potassiated molekyler, dvs. [M + H]
+, [M + NA]
+ og /eller [M + K]
+ ioner hhv. Derfor ble de oppdaget ioner i positiv ion modus søkte i databasene for alle mulige ion artene som er nevnt ovenfor.
Databasen søkeresultatene viser at thedetected topper i ESI massespektra inkluderer [M + H]
+ ioner av fosfatidylcholiner (PC), sfingomyeliner (SMS), og fosfatidyletanolamin (PE); [M + K]
+ ioner av fettsyrer (FAS), diglyserider (DG), triglycerider (TGS) og fosfatidsyre (PA); [M + Na]
+ ioner av DG. Noen av de viktigste metabolittene ble bekreftet ved å sammenligne sine MS /MS-data med den tilsvarende standard som er tilgjengelige i databasene. Kollisjonsenergien som brukes for MS /MS-eksperimenter var 28 eV for PE, 30 eV for PC og 20 eV for SMS. Hvor de forløper ioneintensitetene var lavere, var ca 100-150 skanner kombinert (i MCA-modus) for å oppnå sin MS /MS-spektra. MS /MS-spektra for [M + H]
+ ioner av PC og PE og [M-H] – ion av FA er presentert i fig 2A-2C. MS /MS-spektra for [M + H]
+ -ioner fosfatidylcholin molekyler danne produktet ion ved
m /z
184 som tilsvarer den polare hodegruppe [22]. ESI-MS /MS-spektret av PC (37: 3) er vist i figur 2A som et eksempel. Spekteret viste ion på
m /z
184, den karakteristiske ion av PC, og ion på
m /z
615 som gir informasjon om de acylenheter festet til glyserol . Den ion ved m /z 104 i den lave massen regionen tilsvarer kolin gruppen. MS /MS-spektret av PE (42: 4) er vist i figur 2B, noe som viste den karakteristiske produkt ion på grunn av tap av 141 Da (etanolaminfosfat) fra [M + H]
+ ion, og denne ion kjent for å være spesifikke for PE [23,24]. Det andre produktet ion i spekteret dukket opp på
m /z
279 gir informasjon om en av acyldelen av PE som FA (18: 3). MS /MS-spektrum for [M-H]
– ion av FA (20: 4), er vist i figur 2C. Dette spekteret matchet godt med MS /MS spekteret av standard FA (20: 4) tilgjengelig i Metline database
Negative Ion ESI-MS analyse
Den negative ion ESI. massespektra av lipidekstrakter viste [MH]
– ioner av forskjellige klasser av lipid arter (figur 1B). I likhet med positive ion ESI data ble de nøyaktige masseverdiene av de detekterte toppene søkte mot databaser for topp identifikasjoner. Basert på database søkeresultatene, ble de detekterte topper i spektrene funnet å være den [M-H]
– ioner av fettsyrer (FAS), DG og fosfatidinsyre (PA). Noen av fettsyrene ble ytterligere bekreftet ved MS /MS-eksperimenter på [M-H]
– ioner. De kollisjonsenergier som ble brukt var 25-30 eV for fettsyrene. MS /MS-spektret av FA 20: 4 er vist i figur 2D som et typisk eksempel og spekteret viste karakteristiske produktioner på grunn av tap av H
2O (18 Da) og CO
2 (44 Da) fra [MH]
– ioner i tillegg til produktet ion på
m /z
59 som tilsvarer acetat ion (CH
3COO
-). [25]
Differensial analyse Kvantifisering av lipider
De relative Forekomsten av toppene oppdaget i kontroll- og pasientprøvene ble normalisert basert på intern standard peak intensiteter. De normaliserte verdiene ble utsatt for bestemmelse av differensielt regulert lipid signaturer med minst 1,5 ganger økning eller reduksjon i kreftpasienter sammenlignet med kontrollgruppen. ANOVA-testen ble utført for statistisk signifikans ( 0,05) av endrede lipider tvers PCA pasientene. HRMS data for de differensielt regulert lipid art med tilsvarende brette forskjeller er oppsummert i tabell 2. Alle identifiserte lipider ble inndelt i syv forskjellige klasser PC, PA, PE, TG, DG, SPL og FA. Bortsett fra fettsyrer, resterende seks klasser av lipider var høyere i pasientserumprøver liknet med kontrollprøver. Blant de enkelte klassene, ble TGS forhøyet i PCA pasienter sammenlignet med friske individer.
De identifiserte metabolitter i lipid ekstrakter av serumprøver.
hierarkisk clustering og partisjon analyse
Den hierarkiske clustering av prøver basert på endrede serumlipider er presentert i figur 3. på varme kart, er prøver med høyere uttrykk farget rødt mens prøver med lavere uttrykk er farget grønt. Kolonnene representerer prøver og radene viser endrede lipider i kreftpasienter serum sammenlignet med friske individer. Avstandene mellom klasene er målt ved dendrogrammer mellom klyngene. Fra den observerte varmekart to distinkte klynger dele tumor og normale prøver med bare mindre unntak. Likevel, hierarkisk clustering avslørte at 17 av 18 tumorprøver (rød) dannet en diskret klynge. Ved kontroller, 14 prøver (grønn) gruppert sammen mens de resterende fire prøvene ble en del av tumorprøver klyngen. I to-dimensjonale clustering, også gjorde vi et forsøk på å identifisere noen bestemt lipid klasse danner en klynge som hovedsakelig bestemme tumor og kontrollgrupper. De observerte dendrogrammer bekrefter at ingen drue er dannet med ett lipid klasse (FA, PE, PA, DG, PC og TG) (figur 3). Basert på de observerte klynger, ble hjelpe PCA og partisjon analyse utført. Fra den oppnådde relative overflod av lipider, et spredningsplott med første tre hovedkomponenter viser en god fordeling mellom kreftpasienter og kontroller (figur 4A). Fra PCA-analyse er det klart synlig at alle tumorer dannet en unik komponent (blå), bare en tumorprøve ble en del av kontrollgruppen komponent (rød) basert på 24 identifiserte lipider. Imidlertid, som rapportert av Lukk et al. bare en enkelt differensial biomarkør mellom kreft og normale grupper er ikke tilfredsstillende for å klassifisere kliniske prøver med 100% spesifisitet og sensitivitet [26]. Derfor har partisjon analyse utført for å bestemme mulige lipid underskrifter for klassifisering av prøver i respektive merket gruppe. Partition analyse av de relative overflod verdier fremhevet to lipider, FA (22: 3) og PC (39: 6), som kan klassifisere prøver med høyere spesifisitet (Fisher test med
p
-verdi 1.612e-06). Under denne partisjonen funksjonen hvis FA (22: 3) er ≥ 0.045 ppm og PC (39: 6) er ≥ 0,145 ppm, 100% sensitivitet (18 kontrollprøver klassifisert riktig PCA) og 77,7% spesifisitet (18 tumorprøver 4 prøver er feilklassifisert) kunne bli oppnådd i klassifiseringen av kreftpasienter fra den tilsvarende normalgruppen (figur 4B). Partition analyseresultater har også indikert at de andre identifiserte lipider i kombinasjoner kan klassifisere alle prøvene på riktig måte. Fra disse resultatene er det åpenbart at mer enn ett lipid av samme klasse eller en annen klasse kan skille tumor og kontrollprøver med høyere spesifisitet og sensitivitet.
På varmekart pasienter som var vist horisontalt, mens lipider vertikalt. I den øvre fargelinjen kreftpasienter er merket med rødt, er kontrollene vises i grønt. I side farge bar hver farge representerer en bestemt klasse av lipider. De dendrogrammer representerer avstanden mellom klyngene
(A) Principal Component Analysis (PCA). Scatter tomt på de tre viktigste komponentene i PCA fra den relative overflod av lipid data innhentet fra kreft og normal enkeltpersoner. De blå baller indicatePCa pasienter, mens røde ballene viser ikke cancerous enkeltpersoner. (B) Formell Concept Analysis til å visualisere sortering av prøver basert på den relative overflod av PC (39: 6) og FC (22: 3) ved PCA (røde firkanter) sammenlignet med kontroll (svarte firkanter). Dette dataavhengig visualisering har blitt utført for å vise partisjon effektiviteten av lipider individuelt og /eller i kombinasjon for å identifisere signatur lipider av biomarkør potensial.
For bedre å forstå variasjonen av lipider som endret i PCA pasienter, en korrelasjonsanalyse ble utført på en parvis måte til å visualisere avhengighet mellom overflod nivåer av identifiserte lipider og serumprøver. Korrelasjonsanalyse tillater identifisering av co-regulert lipider og identifiserer relasjoner mellom prøvene i en studie. De resulterende korrelasjon varme kart av log-transformeres overflod nivåer av lipider ved hjelp av Pearson korrelasjonskoeffisienter tydelig differensiert stort antall kreftpasienter med bare ett unntak (fig 5). I tillegg til å sample-sample korrelasjon, har korrelasjonen mellom lipider som bestemmer deres co-regulering identifisert en stor klynge av lipider inneholder 3 PE, 2 PCer, 3 TGS og en DG. Spesielt både PC og PE gruppert sammen viser god co-regulering av deres serum overflod (Fig 6).
Clustering på korrelasjonskoeffisientene viser tydelig prøver gruppe (tumor eller normal) basert på overflod nivåer av differensial lipider.
Gasskromatografi med elektron ionisering massespektrometri (GC-EMS) analyserer
fettsyrer kan analyseres ved GC-MS etter derivatisering (f.eks forestring silylering etc. ). I det foreliggende arbeid ble det fettsyrer metyleres ved diazometan og fames ble utsatt for GC-MS-analyser i henhold til elektron-ionisering (EI) betingelser. EI massespektra av Slike fettsyremetylestere er tilgjengelig i AOCS lipid biblioteket (https://lipidlibrary.aocs.org/ms/ms16/index.htm). Spektrene finnes karakteristisk struktur veiledende fragmentioner. Spektrene er også tilgjengelig i kommersielle EI biblioteker (Wiley og NIST) samt i de tidligere publiserte rapporter [27]. Derfor er det lett å identifisere fames i GC-MS-analyse ved å søke målet spektra mot EI biblioteket. Vi har brukt EI bibliotek og /eller standarder for å identifisere de fettsyrer. I den foreliggende undersøkelse, som forventet, de mettede fettsyrene viste overveiende to karakteristiske fragmentioner ved
m /z
74 og 87 mens flerumettede fettsyrer viste fragment ion ved
m /z
79 i lav masse-regionen av spekteret. EI-spektra av metylestere av heptadecansyre (17: 0), linolensyre (18: 3) og arakidonsyre (20: 4) er vist i S1A til S1B fig. Vi kunne lett karakter høye rikelig fettsyrer fra sin EI massespektra (full skanning modus analyse). I tilfelle av lave rikelig fettsyrer, har vi utført GC-MS-eksperimenter i SIM-modus ved å velge spesifikke fragmentioner av mål-fettsyrer. I denne type av analyse, retensjons-parametrene av målforbindelsene er avgjørende. Følgelig, før SIM-eksperimenter, er oppholdstider på målet fettsyrene ble bekreftet ved hjelp av standarder. Ved å anvende den GC-MS (SIM) -metoden, har vi bekreftet nærvær av linolensyre og arakidonsyre i lipidekstraktet prøver. Metylesterne av linolensyre (18: 3) og arakidonsyre (20: 4) ble eluert ved retensjonstider på 20,9 og 22,3 minutter henholdsvis (fig 7). Tilstedeværelse av disse to fettsyrene ble ytterligere bekreftet ved å tilsette standardene i lipidekstraktet og utføre GC-SIM-modus-analyse etter forestring, hvor disse to fettsyrene først ved de samme RT’ene som for prøve (figur 7).
<
