Abstract
Enkelt celle analyse har tillatt kritiske funn i narkotika testing, immunobiology og stamcelleforskning. I tillegg er en endring fra to til tre dimensjonale vekstbetingelser radikalt påvirker celle-adferd. Dette allerede resultert i nye observasjoner på genekspresjon og kommunikasjonsnettverk og i bedre spådommer om celle svar på sine omgivelser. Imidlertid er det fremdeles vanskelig å studere den størrelse og form av enkeltceller som er fritt opphengt, hvor morfologiske endringer er av stor betydning. Beskrevet her er en ny metode for kvantitativ sanntids overvåkning av cellestørrelse og morfologi, på enkelt levende suspenderte kreftceller, uinnspent i tre dimensjoner. Presisjonen er sammenlignbar med de beste optiske mikroskoper, men, i motsetning, er det ikke behov for å avgrense cellen til bildeplanet. Den her først introdusert
celle magnetorotation plakater (CM) metoden er gjort mulig av
nanopartikkel indusert celle magnetisering
. Ved hjelp av et roterende magnetisk felt, blir den magnetisk merkede celle aktivt roteres, og rotasjonsperioden måles i sanntid. En forandring i morfologien induserer en endring i rotasjonsperiode av det suspenderte celle (for eksempel når cellen blir større den roterer langsommere). Evnen til å overvåke, i sanntid, celle hevelse eller død, på celle-nivået, blir demonstrert. Denne metoden kan dermed brukes for multiplexed sanntid enkelt celle morfologi analyse, med implikasjoner for narkotika testing, medisiner, genomikk og tredimensjonal dyrking
Citation. Elbez R, McNaughton BH, Patel L, Pienta KJ , Kopelman R (2011) Nanopartikkel Induced Cell Magneto-Rotasjon: Overvåking morfologi, Stress and Drug følsomhet av en suspendert enkelt kreftcelle. PLoS ONE 6 (12): e28475. doi: 10,1371 /journal.pone.0028475
Redaktør: Christina Chan, Michigan State University, USA
mottatt: 8 mars 2011; Godkjent: 08.11.2011; Publisert: 13.12.2011
Copyright: © 2011 Elbez et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (NIH-R01-EB007977 (RK), NIH-R33CA125297-03S1 (RK) og NIH-R21EB009550 (RK)). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
heterogenitet, dvs. ikke-ensartethet, som finnes i kreftcellepopulasjoner, og den allestedsnærværende celledifferensiering, har ført til økt interesse for enkelte cellestudier [1] – [4]. Historisk ble en svulst antas å stamme fra de suksessive avdelinger av en enkelt «mor celle «, som fører til antagelsen om at alle cellene i en tumor felles den samme genetiske kode. Imidlertid har de siste resultatene endret denne teorien, understreker behovet for verktøy som kan overvåke og spore enkeltceller i en høy gjennomstrømning fashion [5] – [8]. Foreløpig standard analyser utført på cellepopulasjoner gjøre individuelle mønstre vanskelig tilgjengelig på grunn av effektene av gjennomsnitt [9]. Flowcytometri, for eksempel, har blitt massivt benyttet i de siste 20 årene, for sin evne til å utføre rask analyse på et meget høyt antall celler på en gang (10000 celler /s). Tidspunkt analyse kan også bli utført ved hjelp av denne teknikk, men det er ikke mulig å spore hver enkelt celle for seg.
På den annen side, er det spesielt viktig at selv en liten minoritet av celler, slik som stamceller, hvis adferd kan anses for å være statistisk irrelevant i forhold til det store flertallet av befolkningen, kan ha en viktig biologisk og medisinsk effekt. For eksempel, bruk av
Imatinib
narkotika som er rettet mot
BCR-ABL
fusjonsprotein hos pasienter med kronisk myelogen leukemi (KML) først så ut til å være en av de mest vellykkede målrettet terapi. Imidlertid ikke behandling ikke eliminere CML stamceller, og med den tilbaketrekkingen av Imatinib sykdommen dukket opp igjen [10], [11]. Som en konsekvens, har fokus på celle-til-celle variasjon også tillatt viktige gjennombrudd i forståelsen av celledifferensiering, legemiddelrespons, protein mekanismer og dynamikk, så vel som av den viktige rolle spilt av stamceller, spesielt for kreft stamceller [12]. Metastase er avhengig av kreftceller som sirkulerer i det vaskulære nettverk. Cellene som er ansvarlige for kreft forplantning til sekundære tumorsteder er ekstremt sjeldent (noen få celler per million i blodet), og de går gjennom en sirkulasjonstrinnet før utfylling av andre vev. Derfor, sammen med enkelt celle analyse, tredimensjonale analyser også tillate en bedre forståelse av cellulære dynamikk [13] – [15], med innsnevring gapet mellom
in vitro Hotell og
in vivo
oppførsel [7]. Men alle tidligere nevnte enkeltcelleanalyseteknikker begrenset ved deres innesperring av cellen i to dimensjoner. For å overvinne denne begrensningen, ansetter vi en ny tilnærming ved hjelp av
suspendert celle magneto-rotasjon plakater (CM).
Spesielt bruker vi en
nanopartikkel indusert Cell Magneto-rotasjon metoden
, hvor den drivende magnetfelt og den roterende cellen er
ut-av-synk
med hverandre. Cellene er innebygd med 30 nM kommersielle magnetiske nanopartikler (Ocean Nanotech®) og roteres i henhold til et eksternt magnetisk felt på ca. 1 mT, ved about100 Hz. Vi merker oss at tusen ganger (1000 ×) høyere felt, i størrelsesorden 1T, brukes til MR. Dessuten har magnetiske nanopartikler vært mye brukt i biologi [16] – [20]. Således CM metoden er utformet for å være biokompatibel og ikke-giftig. Det levende celle roteres
asynkront plakater (se analytiker S1) i suspensjon, og dens rotasjonsfrekvens er svært følsom for eventuelle morfologi endring. Som rapportert her, betyr magneto-rotasjon ikke påvirke cellenes levedyktighet, og gir mulighet for sanntids analyse skal utføres. Endringer i celle morfologi angis kvantitativt ved enkelt celle rotasjon periode. Trendene i rotasjonshastigheten tillate forskjellsbehandling mellom en sunn celle, en døende celle eller en hevelse celle. I tillegg er lett tilpasses til en hvilken som helst mikroskop sette opp denne nye teknikken, er fluorescerende-etikett fri, og er forenlig med samtidig fluorescens og /eller andre optisk avbildning og spektroskopimetoder, så vel som magnetisk separasjon og berikelse teknikker. Andre metoder som brukes til å spore morfologiske endringer av enkle biologiske celler inkluderer Atomic Force Mikros [21] (AFM) og optisk pinsett [22] (OT). Disse fremgangsmåtene kan gi høyere oppløsning, men er begrenset ved binding av celler til en overflate (AFM), eller ved den irreversible skade forårsaket av laser trapping (OT). Videre med OT, for hver cellelinje, levedyktighet studier må utføres for hver celletype for å hindre photodamage, noe som begrenser dens anvendelse [23]. Bruken av bommene har også blitt rapportert å spore massen av levende celler [24], men det er ingen publikasjoner ennå på enkeltkreftceller i suspensjon.
Resultatene
Model for rotasjon av magnetisk merket celler
for å verifisere at cellene kan bli magnetisk manipulert, plassert vi dem i midten av magnetiske spoler med magnetfelt amplituder av 1 mT, som vist i Figur 1b. Den spoler selv er tilpasset plattformen av et mikroskop for å ta opp video (se Utfyllende Figur S4 og analytiker Video S1). De enkeltceller rotere med frekvenser fra 0,05 Hz til 2 Hz i dette oppsettet (mye lavere enn de 100 Hz kjørefeltene, på grunn av drift i
asynkron regime
, se nedenfor). Fokusering et lavt strømforbruk, 1,45 mW HeNe laser gjennom mikroskop er termin spredt signal registreres med en fotodiode [25]. Den cellelevedyktigheten blir ikke påvirket av denne lav-intensitet laser, slik som vist i figur supplerende S3 og supplerende tabeller S1 og S2. Når cellen roterer, frembringer den rotasjonsavhengig modulasjon som kan måles med fotodioden. Med sanntids signalbehandling, rotasjonen perioden av cellen og derfor sin størrelse /morfologi kan overvåkes i sanntid.
a) Skjematisk av hele oppsettet. En levende celle Array® plate, med 100 um brønner, er plassert på plattformen til et mikroskop, som et sett av elektromagneter har blitt tilpasset. Legg merke til at cellen ikke er fast til bunnen av brønnen. Under 60 x objektiv, gjennomgår laserstrålen forover spredning fra den roterende celle (15 til 20 um), og variasjonene i den fremover spredte lyset blir fanget i sanntid ved en foto-detektor, og analyseres på en datamaskin. b) Skjematisk av en roterende celle plassert på innsiden av de magnetiske spoler: to identiske sinusformede signaler med en faseforskyvning på 90 °, passerer gjennom de to parene av spoler. Det påtrykte magnetiske felt og det magnetiske moment av cellen er ikke justert, og skaper et moment som driver cellens rotasjon. c) Roterende periode på en fiksert celle i DMEM. Den innfelte representerer rå-signalet fra fotodetektoren, som viser periodisitet i et gitt tidsvindu. Behandlingen av signalet gir deretter rotasjonsperiode (se metodedelen på den optiske oppsett for signalet behandling beskrivelse). d) Bildetekst av oppsettet. Custom Helmoltz Coils med NUNC Live-Cell Array Plate på mikroskopet scenen.
Cellen er funnet å vise magnetisk rotasjons oppførsel svært lik som en magnetisk mikropartikkel (Supplementary fig. S1). Som vist ved McNaughton et al. [26], og utvidet til tilfelle av superparamagnetiske partikler [27], eksisterer det en grensefrekvens av det ytre magnetfelt over hvilken partikkelen ikke roterer synkront med feltet, dvs. partikkel kan ikke holde seg lenger med den drivende frekvens. I denne asynkron ordning er den midlere verdi av rotasjonshastigheten til enkeltcelle gitt av, hvor det magnetiske moment og er motstanden på grunn av viskositet krefter. Her
κ
er dens Einsteins formfaktor,
V
volumet og
η
koeffisienten til viskositet. Vi merker som er proporsjonal med størrelsen av det magnetiske feltet, det magnetiske moment av cellen og volumet av de magnetiske
innholdet
i cellen; Imidlertid er alle disse parametrene holdes konstant i eksperimentene. Derfor, i den asynkrone regime, en hvilken som helst endring i cellens form eller volum, dvs. i dens effektive volum, induserer en endring i rotasjonshastighet, gitt ved den ovennevnte formel. Denne modellen har blitt videreutviklet for tilfellet av paramagnetiske partikler [28], [29], karakterisert ved at rotasjonsperioden, er funnet å være proporsjonal med det effektive volum, (dette gjelder i den asynkrone rotasjons regime, for en fullstendig avledning , se ref. 27 og ligninger i Supplementary Information S1). Som det kan ses fra denne avhengighet, hvis volumet øker, er rotasjons periode øker proporsjonalt. Det samme gjelder for formfaktoren, og som en konsekvens, kan man oppdage morfologi endringer.
Magnetic karakterisering av cellene
For å karakterisere videre magnetiseringen av cellene, har vi sett på lokalisering av nanopartiklene etter inkubering, å bestemme hvorvidt de værende bundet til overflaten, ble internalisert, og, hvis de gjorde, hvis nanopartiklene var fri til å bevege seg i cytoplasma eller fanget i vesikler (endosomer). For å gjøre dette, festet vi HPTS fluorescerende dyemolecules (8 – Hydroxypyrene – 1,3,6 – trisulfonic syre, trisodium salt) til våre nanopartikler, ved hjelp av elektrostatiske tiltrekningskreftene mellom partiklene og fargestoffer. HPTS er en membran impermeant fargestoff, og dermed det er behov for en vektor for å bli internalisert av celler. Ved å følge standard protokoll med inkubasjon, vasket vi cellene tre ganger i PBS, og cellene ble observert etter eksitasjon ved 450 nm med fluorescens blir kontrollert ved 510 nm. Resultatene er vist i figur 2a. Som vi kan se, er de magnetiske nanopartikler internalisert av cellen gjennom endocytose. I tillegg, hverken i kjernen eller i cytoplasma viser fluorescens, noe som tyder på at nanopartiklene forblir i vesiklene. Videre, vurderte vi jerninnholdet i cellene ved induktivt koblet plasma (ICP) måling (se Methods avsnitt). Som forventet, jerninnholdet øker med MNP-konsentrasjonen i kulturmediet, og utviklingen synes å være lineær i konsentrasjonen vinduet som vi brukte (figur 2b). For våre eksperimenter rotasjon, beregnet vi at jerninnholdet er omkring 14 pg /celle. I forhold til massen av en nanopartikkel, betyr dette at i gjennomsnitt er mindre enn 20.000 nanopartikler kommet inn i cellen. Andre størrelser av magnetiske nanopartikler ble også testet (10 nm, 100 nm og 200 nm), men internalisering ble maksimert for partikler med en diameter på 30 nm (data ikke vist).
a) Fluorescens Bilde (40 x ) av et HeLa-celler etter inkubasjon med farget magnetiske nanopartikler på en ekstracellulær jernkonsentrasjon av [Fe] = 12,5 ug /ml (0,22 mM). b) Cellular jerninnhold i pikogram per celle. Konsentrasjonene av partikler i media er gitt i jernkonsentrasjon (feilfelt verdiene representerer gjennomsnitt +/- 0,5 * sd, n = 3).
Cvtotoksisitetsmålinq og narkotika følsomhet
i denne studien ble kreftceller ladet med nanopartikler magnetisk separert og resuspendert i forskjellige medier, for eksempel dyrkningsmedium (DMEM), DMEM med 5% etanol, DMEM med 100 ug /ml cisplatin eller DMEM med 75% deionifzed vann. Hvert medium ble brukt til å bekrefte forskjellige aspekter ved denne metoden: DMEM ble anvendt som en kontroll, etanol ble brukt som et cytotoksisk middel, ble Cisplatin brukt til å modellere et medikament assay; også, for å fremme stress gjennom celle hevelse, anvendte vi en stor andel av DI vann, å reversere den ioniske balansen mellom innsiden og utsiden av cellen. Legg merke til at en stor konsentrasjon av salt i løsningen har motsatt effekt på cellen, nemlig krymper den. Cellene i suspensjonen ble deretter pipettert på en levende celle Array ™ plate (NUNC ™), hvor matrisen har 100 mikrometer brede brønner, som gir tilstrekkelig kamre for enkeltceller til å rotere og bli analysert. Optiske spredningssignaler (fra de roterende celler) ble målt og endringen i rotasjonsperioden ble målt for de forskjellige media (figur 3). Magneto-rotasjon ble utført under en rekke forhold, med forskjellige celleprøver; de følgende resultater viser typiske eksempler på celle oppførsel som er gjengitt flere ganger i systemet.
a) i DMEM på en agarose lag b) I en blanding av 75% avionisert vann og 25% DMEM c) I en blanding av DMEM med 5% etanol, og d) for en levende celle i DMEM (grønne sirkler) sammenlignet med en HeLa celle (røde firkanter) i DMEM med 100 ug /ml cisplatin. Y-aksen er den normaliserte periode, og X-aksen er tid i sekunder. Linjene viser utviklingen mellom tilkoblede poeng. For hver graf, i bildene ovenfor det, viser de nederste bildene øyeblikksbilder av den roterte celle ved hver angitt tid, mens de skjematiske bilder på toppen av det viser de tilsvarende celleformer (fiksert celle ikke vist). Mørke plater representerer cellens cytoplasma og membranen, mens grå flekker viser vesiklene er dannet på overflaten, hvis noen.
figurene 3a og 3b viser to tilfeller av celle hevelse. Cellesvelling vanligvis oppstår på grunn av det osmotiske trykk dannet enten av en ionisk ubalanse, som nevnt tidligere, eller ved en mangel på næringsstoffer. Uansett, utvides cellen for å takle ubalanse av kjemikalier den trenger for å opprettholde sin metabolisme. For å nå ionisk ulikhet, brukte vi DI vann (figur 3b). Vi har også observert at cellene ville også sveller når den plasseres på en agarose lag (2% agarose i DI-vann) (figur 3b). Agarosegel er porøs, en egenskap som er brukt i elektroforese av proteiner, og denne egenskapen kan være opprinnelsen til svelling. Faktisk næringsstoffene er tilstede i vekstmediet, hovedsakelig glukose, kan diffundere inn i agarosegel mens cellene som rotere over den. Cellene vil derfor svelle for å balansere den reduserte konsentrasjonen av næringsstoffer som er tilgjengelige i oppløsning, som observert av Goldberg et al. i kortikale celler [29]. Siden cellevolumet øker, turnusperiode øker. Alternativt blir celledød provosert når de plasseres i en oppløsning med 5% etanol (figur 3c), eller ved anvendelse av en konsentrasjon på 100 ug /ml av Cisplatin i oppløsning (figur 3d, rød linje som forbinder kvadrerte prikker). Imidlertid er mekanismene for slike celle dødsfall er forskjellig fra de ovennevnte tilfeller, ettersom blebs vises på overflaten av cellen. I 5% etanol, tar det bare rundt 30 minutter (figur 3c) for blebs skal vises, mens i tilfelle av behandling med cisplatin på 100 ug /ml, tar det flere timer. I motsetning til svelle tilfelle er det endringene i form av cellemembranen som øker det effektive volum. Blebbing og dannelsen av blærer på overflaten av cellen indikerer at celleinnholdet blir brutt ned og separert i flere vesikler. Som dødsprosessen fortsetter, de vesikkel størrelser øke. Denne type fenomen er ikke bare legge til volum, men det kritisk påvirker formfaktoren av cellen. Kombinasjonen av disse to parametrene, nemlig
effektiv volum
, er det spores med magnetorotation, og dermed forsterke blebbing effekt. Til slutt blir det drag på cellen så høy, sammenlignet med den opprinnelige tilstand av cellen, at cellen rotasjonsperioden øker drastisk (ved 550%), i en ikke-lineær måte (se figur 3c, rød linje på figur 3d og se fig. 4 for en sammenligning med mikroskop målinger). Dermed både celledød mekanismene, men veldig forskjellige, kan observeres og differensiert med Cell Magnetorotation.
a) Sammenligning av sensitivitet mellom mikroskop og magneto-rotasjon i måle celledød (HeLa celle i DMEM, 5% etanol) . I rødt er den normaliserte overflatearealet målt med mikroskopet, og i blått er den normaliserte effektive volum periode som målt med Magneto-rotasjon ved hjelp av supplerende informasjon S1. b) Sammenligning av celledød overvåking ved hjelp av magneto-rotasjon og Live /Død celleanalyse.
Vi har også utført magnetorotation av en sunn celle (figur 3d, grønn linje), i vekstmedier. I fravær av et toksisk middel, har rotasjonen periode ikke signifikant endring (standardavviket av rotasjonsperioden var 15%). Et fast morfologi kontrolltest ble realisert ved fiksering av cellene i en 4% formaldehyd ampulle (1,5 ml) i 10 minutter, i henhold til ende-over-ende rotasjon ampulle (se figur supplerende S2, rød linje). Siden membranen og celleinnholdet var tverrbundet, hadde den cellemorfologi ikke endres under isotoniske betingelser, og derfor, som ventet, den rotasjonsperioden ble ikke endret. I forhold til en fiksert celle, hvor rotasjonsperiode er meget flat, for levende celler observerer vi at rotasjonsperioden, over tid, oppviser betydelige korttidsvariasjoner. Dette kan være et resultat av cellens metabolisme, som fortsatt er aktiv i løpet av rotasjon. Alt i alt viser dette at når rotasjonsperioden er konstant, det tilsvarer en celle som ikke vesentlig endrer dens effektive volum.
For å bedømme nøyaktigheten av metoden om effektive volum modifikasjoner sammenlignet vi trendene i det effektive volum (proporsjonal med rotasjonsperioden) med de av overflatearealet, som estimert fra mikroskopi bilder (overflatearealet være en standard indikator på cellemorfologi /formfaktoren). Med et bildebehandlingsprogrammer (Adobe® Photoshop®), beregnet vi overflate områder av cellene ved jevne mellomrom mellomrom. Som det kan ses på figur 4a, er magneto-rotasjon så effektiv som en optisk mikroskopi oppsett for å observere små endringer. Imidlertid, for større endringer, forsterker magneto-rotasjon responsen, i forhold til det optiske mikroskop oppsettet. Noe betydelig tap av magnetisk innhold tar flere dager, i henhold til Arbab et al. [30]. Dermed dens innvirkning på tolkningen av resultatene, etter flere timer, kan ignoreres. Også den jevne rotasjonshastigheten for en magnetisert kontrollcelle har en tendens til å bekrefte at tapet av magnetisk innhold er ikke signifikant over tidsspenn for målingen. Ellers vil det magnetiske moment av cellen kritisk avta, og cellen ville avta betydelig, noe som ikke er tilfelle (figur 3d). Derfor kan vi gå ut fra at cellens effektive volum er faktisk proporsjonal med rotasjonsperioden. Magneto-rotasjon kan også sammenlignes til Live /Dead-celleanalyser. Celler ble fremstilt ved å følge den protokoll som er beskrevet tidligere. Før pipettering inn i mikrobrønnplate, tilsatte vi 2,0 ul av calcein og 5,0 ul av propidiumjodid (PI) til en 1 ml prøve inneholdende celler. Celler ble forlatt sitte i inkubator i 10 minutter, og deretter suspendert på nytt i DMEM med 5% etanol, og den samme mengde av fargestoffer, hvoretter de ble pipettert og rotert. Som det kan sees på figur 4b, gjennomgår cellemorfologi endringer i god tid før PI fluorescens kan sees, og etter den tid celledød (PI definert) inntreffer, har rotasjonen perioden avtok med en faktor på omkring 2. Dette ikke bare viser at magneto-rotasjon metoden «sammenligner godt med fluorescerende analyser, men viser også at det skal være mer sensitive. Det er ikke overraskende å se rotasjonshastighet sakker
godt før
en er i stand til å detektere fluorescens fra PI fargestoffer. Faktisk PI fargestoffer bare gjøre veien inn i cytoplasma etter celleveggene har blitt ødelagt. Men også før, andre prosesser finner sted, en av dem blir dannelsen av blemmer på overflaten av cellen, et fenomen som celle magneto-rotasjon nøyaktig kan overvåke, noe som ikke er tilfelle for MTT-assayet for eksempel.
Effekter av magneto-rotasjon på celleviabilitet og divisjon
for å undersøke muligheten av oppsettet å overvåke celledød, uten å forårsake celledød, gjennomførte vi flere levedyktighet tester (laser eksponering, kort sikt og lang langtidsvirkninger av rotasjon på levedyktighet, celledeling og clonogenicity).
Vi først testet effekten av opptaket av magnetiske nanopartikler [gul (RHS) og rød (i midten) barer i figur 5a], og av tilstedeværelse av et magnetisk felt, på cellenes levedyktighet [red (i midten) og blå (LHS) barer i figur 5a]. Vi utførte levedyktighet test på tre forskjellige HeLa-cellepopulasjoner. Etter en time ved 37 ° C med fuktighet og CO
2 kontroll, ble en celletall gjort ved hjelp av trypanblått. Det var ingen signifikant forskjell i levedyktighet av de tre cellegrupper (figur 5a). Dette viser at verken inkorporering av partiklene og heller ikke rotasjon under et magnetisk felt påvirket celler levedyktighet i løpet av tidsskalaen for en time. Faktisk er den samme type magnetisk jernoksid nanopartikler ganske ofte brukt [16], [30] for å magnetophoretically separate visse cellepopulasjoner fra heterogene populasjoner, samt under MR på pasienter (for kontrastforsterkning), uten å forårsake skade på celler . I de ovenfor angitte levedyktighet testene, ble det feltstyrke og den magnetiske partikkelkonsentrasjoner hensikt satt ved høyere verdier (0,5 mT og 40 pg /ml) enn de som er beskrevet i denne artikkelen for magnetorotation (0,1 mT og 25 ug /ml), for å kunne holde en sikkerhetsmargin i protokollen.
a) HeLa-celler levedyktighet etter inkubasjon med nanopartikler og rotasjon under et roterende magnetfelt. Alle cellene kom fra den samme cellelinje, og ble dyrket på samme tid, hver i 4 dager. HeLa-celler ble dyrket til å nå 70% konfluens, og den første prøven utgjorde kontrollgruppen (RHS). De to andre grupper, inkubert med magnetiske nanopartikler, som stammer fra den samme celle batch, celler dyrket i nærvær av 40 ug /ml i DMEM, til den når 70% konfluens. Hver gruppe ble laget av to prøver som inneholdt 50.000 celler hver. Mens den andre prøven ikke ble rotert, ble den tredje (kontroll) satt under et felt av 0,5 mT og rotert med en drivende frekvens på 100 Hz (LHS). Under eksperimentet ble cellene holdt ved 37 ° C, med 5% CO
2 og fuktighetskontroll. For hver gruppe, n = 3. Verdier representerer gjennomsnitt +/- s.d. b) Magnetisk HeLa-celler levedyktighet før og etter eksponering laser. HeLa-cellene ble inkubert med magnetiske nanopartikler, i 48 timer, etter den protokoll som er beskrevet før. I en 96-brønners plate, ble 150 ul av hvert sett av celler pipettert. Kontrollmåling (blå) ble realisert etter Cellene ble vasket, frittliggende og på nytt oppslemmet i friskt medium ved 37 ° C. Ikke-eksponerte (rød) og eksponerte celler (grønt) ble holdt på mikroskopet scenen i 120 minutter ved romtemperatur. Hver brønn inneholdt 25.000 celler. Verdier representerer betyr +/- 0,5 * S.D. n = 3. c) HeLa-celler levedyktighet i løpet av magneto-rotasjon ved 37 ° C med fuktighet og 5% CO2 kontroll. HeLa-celler ble pipettert på en levende celle Array (NUNC ™). Cellene fanget i de 100 um brønnene ble telt ved bruk av Calcein. For både i kontrollen og de roteres celler grupper, n = 4. Celledød ble overvåket ved hjelp av propidium jodid. Standardavvik er innenfor prikkene.
En annen mulig bekymring vi adressert er effekten av laser eksponering på cellenes levedyktighet (figur 5b). Levedyktigheten testen viser ingen signifikant celledød, og ingen signifikant forskjell etter to timer, mellom kontrollcellene og magnetiske celler som ble eksponert for laseren. Både interaksjon av cellene med lys og den mulige interaksjon mellom de magnetiske nanopartikler med laseren ikke påvirker levedyktigheten av cellene.
Til slutt vi undersøkt den mulige virkning av den fysiske rotasjonen av cellene på sin levedyktighet. Faktisk, for å nøyaktig overvåke giftvirkninger, har celle rotasjon å være ufarlig. Figur 5c adresser dette sistnevnte punkt. Sammenligning dødeligheten av roterende celler og dødsraten av ikke-magnetiske celler, vi fant ingen statistisk forskjell i de to trender (n = 4, p = 0,245 og 0,05, F = 1,65 5.98 = F
crit ). I tillegg, som vi har observert (data ikke vist), og som er beskrevet i andre publikasjoner [30], kan celler som inneholder magnetiske nanopartikler subkultiveres. Også, for å vurdere cellenes clonogenicity, utførte vi en klonogene assay hvor cellene ble først magnetisk rotert i 24 timer i en inkubator, og deretter la til å vokse på agarose i tre uker. Vi fant ingen signifikant forskjell mellom kontrollprøver og de roterte prøver (n = 3, t = 1,37 2,77 = t
crit, p = 0,24 0,05 = p
Crit, se supplerende figur S3).
til slutt, vi testet også effekten av magneto-rotasjon på celledeling. Spørsmålet var: Har magneto-rotasjon hindre umiddelbar celledeling? For å undersøke virkningen kort sikt, roteres vi cellene med agarose i 72 timer, og sammenlignet cellevekst med to andre kontroller (ikke merket og magnetisk merkede celler i fravær av magnetfeltet). Vi fant ingen forskjell mellom de to ulike grupper av magnetisk merkede celler (se figur supplerende S4). Dette utelukker også ut eventuelle magnetiske hypertermi skjer under rotasjon.
Diskusjoner
harmløshet av metoden
Bruk av magnetiske nanopartikler og vekslende magnetfelt er ofte forbundet med hypertermi , en prosess hvor de vibrerende nanopartikler inne i cellene produserer varme, til slutt drepte de merkede cellene gjennom en økning i temperatur. Som en følge av dette har evnen til å rotere cellene gjennom internalisering av tilsvarende magnetiske nanopartikler og anvendelse av et roterende magnetisk felt, det vil si alternerende i to retninger samtidig, uten å forårsake skade på cellen vært en bekymring, selv om vi bruker mye lavere felt av en størrelsesorden, og frekvenser i de områder av et par dusin Hz i stedet for noen få 100 kHz [31], [32].
Vår første bekymring var da å sikre at rotasjonen i seg selv ikke dreper cellene. Våre resultater viser at levedyktigheten til cellene opprettholdes, mens de roteres. Også eksponering for et (svakt) laser (for å fange opp en spredning signal fra den roterende celle) ikke har noen effekt på kort sikt celleviabilitet, som vist i figur 5b. Imidlertid er tilstedeværelsen av en laser ikke er nødvendig, og signalet kan også bli analysert gjennom et kamera, fjerne eventuelle lang tid fare for at en lang tids eksponering for en laserstråle kan forårsake.
Våre resultater viser også at internalisering av magnetiske nanopartikler forårsaker ikke noen virkning på cellenes levedyktighet, og det påvirker bare celledeling ved å redusere vekstraten for en kort tid, i løpet av et begrenset antall – i det meste 3 – av cellesyklus, før de nådde normale priser. Faktisk har våre magnetisk merkede celler blitt dyrket i petriskåler, og vi observerte ingen forskjell i levedyktigheten (se analytiker S1) eller spredning priser etter tre divisjons sykluser (data ikke vist). I samsvar med tidligere publiserte data [33], fant vi også at magnetisk merkede cellene vokste langsommere enn ikke-merkede celler, opp til tre divisjon sykluser, som peker utover vekstratene var tilbake til det normale (se Tilleggsinformasjon S1 ). Også, som nevnt, i henhold til Arbab et al. [30] i nærvær av celle internalisert magnetiske nanopartikler ikke forårsaker skadelige langtidseffekter på levedyktigheten av cellene (over en periode på 5 til 7 divisjon sykluser, dvs. i løpet av flere uker).
Tilstedeværelsen av en roterende magnetfelt, og de induserte sub-hertz frekvensdreininger som ble indusert i de magnetisk merkede celler ikke har en langvarig effekt på celledeling, som vist ved våre klonogene analyse og ved celletall, etter dreining celler for 24 til 72 timer.
Derfor har vi vist at for magnetorotation noen celledød observert var konsekvensen av en hensikt-indusert giftig miljø. Dessuten antar vi at ettersom celler ikke dør som et resultat av rotasjon, cellevekst, og til og med kritisk dormancy studier kan utføres (work in progress). Det er verdt å merke seg at celledelingen er blitt observert under rotasjon (se supplerende video S3), og roterende celler ikke synes å ha en annen fordeling hastighet i forhold til magnetisk merket ikke-roterende celler (se Tilleggsinformasjon S1) Alt i alt, forskjell i veksthastighet observert i løpet av rotasjon kan være helt sikkert forbundet med merkingen av cellene med nanopartikler, og ikke virkningen av rotasjonen selv.
Denne studien viser en stor forskjell i celleviabilitet i forhold, for eksempel, til
celle elektro-rotasjon
metoden, som bruker cytolplasm ujevnhet å indusere en elektrisk dipol.
