Abstract
En fremgangsmåte for forbedring av kreftbehandling er bruk av nanopartikler funksjonalisert med legemidler rettet mot ligandene som gjenkjenner selektivt reseptorer uttrykt ved tumorceller. I teorien er målrettet mot slike ligander bør spesielt levere nanopartikkel medikamentet til tumoren, øker medikamentkonsentrasjonen i tumoren og levere stoffet til dets virkningssete i tumorvevet. Men lekk blodkar i svulster kombinert med et dårlig lymfesystemet gjør at passiv akkumulering, og påfølgende oppbevaring, av nanomaterialer i svulster. Videre kan en stor nanopartikkelstørrelse hindre tumor penetrasjon. Som sådan, er rollen til aktiv målgruppe i nanopartikkel levering er kontroversielt, og det er vanskelig å forutsi hvordan en målrettet nanopartikkel stoffet vil oppføre
in vivo
. Her rapporterer vi
in vivo
studier for α
vp
6 spesifikke H2009.1 peptid målrettet liposomal doxorubicin, som økte liposomal levering og giftighet for lungekreft celler
in vitro
. Vi har systematisk varierte ligandaffinitet, ligand tetthet, stabilitet ligand, liposom dosering, og tumormodeller for å vurdere rollen som aktiv målretting av liposomer til a
vp
6. I direkte kontrast til de
in vitro
resultater viser vi ingen forskjell i
in vivo
målretting eller effekt for H2009.1 tetramerisk peptid liposomal doxorubicin, sammenlignet med kontroll peptid og ingen peptid liposomer. Undersøkelse av liposom-akkumulering og fordeling innen tumoren demonstrerer at liposomet, og ikke den H2009.1 peptidet, driver tumor akkumulering, og at både målrettet H2009.1 og vilkårlige liposomer forblir i perivaskulære regioner, med liten tumor penetrasjon. Således H2009.1 målrettede liposomer mislykkes i å forbedre legemidlets effekt fordi liposom medikament plattformen hindrer H2009.1 peptidet fra både aktivt rettet mot tumoren og binding til tumorceller i løpet av tumorvevet. Derfor bruker en høy affinitet og høy spesifisitet ligand rettet mot en over-uttrykt svulst biomarkør garanterer ikke økt effekt av en liposomal narkotika. Disse resultatene markere kompleksiteten i
in vivo
målretting
Citation:. Gray BP, McGuire MJ, Brown KC (2013) En Liposomalt Drug Platform Styrer Peptide Ligand Targeting til en Cancer Biomarker, Uavhengig av ligandaffinitet eller tetthet. PLoS ONE åtte (8): e72938. doi: 10,1371 /journal.pone.0072938
Redaktør: Stephanie Filleur, Texas Tech University Health Sciences Center, USA
mottatt: 31. mai 2013; Godkjent: 14 juli 2013; Publisert: 23 august 2013
Copyright: © 2013 Gray et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av Welch Foundation tilskuddet # i-1622 og National Institutes of Health /National Cancer Institute (NCI) stipend # 1R01CA164447 (til KCB). BPG ble støttet av et fellesskap fra Cancer Research and Prevention Institute of Texas (RP 101 496). De delte bilde ressursene UT sørvestre støttes delvis av en NCI støtte tilskudd til Harold Simmons Cancer Center (P30 CA142543). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kreft er nummer én dødsårsaken i verden, og antallet kreftrelaterte dødsfall er anslått å stige i de kommende tiårene [1]. En paradigme for forbedring av kreftbehandling er utvikling av behandlingsformer rettet mot tumor som bruker-spesifikke ligander for selektivt å levere legemidler til kreftceller, og dermed øke medikamentakkumulering i tumoren og redusere uønsket toksisitet fra medikament akkumulering i andre deler av kroppen. Tumor-spesifikke ligander akkumuleres fortrinnsvis i svulster på grunn av spesifisitet for en reseptor uttrykkes selektivt av tumoren eller tumor vaskulaturen-celler (og ikke uttrykt av normale celler). Nanopartikkel legemidler er spesielt attraktive for anvendelse sammen med tumorspesifikke ligander på grunn av innkapsling av legemidlet i løpet av en nanopartikkel, som hindrer stoffet aktivitet før dens frigjøring fra nanopartikkel og kan øke blodsirkulasjonen tid.
pegylert liposomal doksorubicin (Doxil ® /Caelyx®) var den første nanopartikkel klinisk godkjent for kreftbehandling. DOXIL® er ca 100 nm i størrelse, inneholder antracyklin kjemoterapeutiske doksorubicin [2], og er for tiden godkjent for behandling av eggstokkreft [3], multippelt myelom [4], og Kaposis sarkom [5] i både i USA og Europa og for bruk i brystkreftpasienter i Europa [6]. Mange kliniske studier med stoffet er pågående, inkludert studier hos pasienter med ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) [7]. På grunn av den kliniske suksessen DOXIL®, har de fleste rettet mot ligander konjugert til nanopartikler for målrettet levering av legemidler er konjugert til liposomale former for doxorubicin. Både antistoff og peptid-målretting ligander har blitt brukt for å øke effektiviteten og redusere toksisiteten av liposomal doksorubicin ved aktivt målrettet mot tumor og tumorvaskulatur celler [8-25]. Av spesiell interesse, anti-HER2 liposomal doxorubicin og anti-EGFR liposomal doxorubicin formuleringer er i fase I kliniske studier [26,27]. I tillegg liposomal doxorubicin konjugert til et peptid derivat av svulsten blodkar målretting NGR peptid [28] har blitt primet for potensielle fremtidige kliniske studier ved forberedelse på Good Manufacturing Practices (GMP) [29].
Inkludert blant de mange fordelene med å bruke liposomal doxorubicin for målretting terapi er den høye stoffet til å målrette ligand forhold på grunn av de tusenvis av doxorubicin molekyler innesperret i hvert liposom. I tillegg pegylert liposomal doxorubicin nyter lange
in vivo
sirkulasjons ganger [30], forlenger tiden målretting ligander har til å levere sin last til svulsten. En viktig faktor som bidrar til liposomalt medikament-effektivitet er den passiv akkumulering av nano-størrelse-partikler i tumoren gjennom den forbedrede permeabilitet og retensjon (EPR) virkning [31]. I motsetning til blodkar i normalt vev, er tumor blodkar uregelmessig og uoversiktlig. Nano-størrelse partikler kan unnslippe gjennom denne lekk blodkar i det omkringliggende svulstvev og senere blir holdt tilbake inne i svulsten skyldes dårlig lymfedrenasje systemer av svulster. Således tumor akkumulering av ligand-målrettede liposomer avhenger ikke bare av den spesifikke målrettende ligand, men også på EPR-drevet effekter. Rollen til aktiv målretting i levering av nanopartikler til svulster er kontroversiell [32-36].
Studier med målrettede liposomer har demonstrert to mekanismer for økt svulst narkotika opphopning, som begge fører til ønskede terapeutiske utfall. Noen peptid-målrettede liposomer, spesielt de som er rettet mot tumorvaskulaturen, inkludert NGR-liposomer leverer mer doksorubicin til tumorene enn ikke-målrettede liposomer [9,16], som tyder på at de målrettede liposomer oppkonsentreres i tumoren basert på både peptid målretting evner og EPR effekt. Andre antistoff-målrettet liposomformuleringer, inkludert anti-HER2 og anti-EGFR liposomer, akkumuleres i svulsten på nivåer tilsvarende ikke-målrettede liposomer. Men i motsetning til de ikke-målrettede liposomer, disse målrettet liposomer internal til kreftceller og viser bedre distribusjon i hele svulstvev [37,38]. Mens det målsøkende ligand som ikke overstyrer EPR virkning drivende tumor opphopning av disse liposomale formuleringer, er endret plassering av medikamentet til dets virkningssete inne tumorcellene øker effekten. På grunn av den EPR virkning og de forskjellige blodkar strukturen av hver tumor, er det vanskelig å forutsi hvordan en unte målretting liposomformulering vil akkumuleres i tumorer og påvirke tumorvekst.
Vi har nylig beskrevet utviklingen av peptidet målrettet liposomalt doksorubicin formuleringer spesifikke for restriktivt uttrykt reseptor α
vp
6 [39]. Inte α
vp
6 fremstår som en ideell kreft målet; Det uttrykkes ved en rekke kreftformer av epitelet [40-50] og bare sjelden uttrykt i normalt vev [51]. Av spesiell interesse er forekomsten av α
vp
6 i lungekreft, nummer én kreft morder av både menn og kvinner [1]. Mer enn halvparten av pasienten ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) tumorer uttrykke α
vp
6, og inte uttrykk er «slått på» i de tidlige stadier av NSCLC kreftutvikling og forblir forhøyet i hele utviklingen av sykdommen [52].
Vi har identifisert og senere optimalisert en α
vp
6-spesifikt peptid, H2009.1 [53]. Den monomere peptid binder H2009 adenokarsinom NSCLC celler med en halv-maksimal binding affinitet på 9,2 nM, og syntetisere H2009.1 peptid som et fag struktur-ligne tetramerisk peptid øker affinitet til 23:00 [54]. Både monomere og tetramer peptider internal inn α
vp
6-uttrykke celler
in vitro Kjøpe og målet svulster
in vivo
. Med mål om å oversette peptider isolert fra fag skjerm bibliotekene til effektive terapeutiske leveringsmidler, undersøkte vi den beste plattformen for visning av H2009.1 peptider på liposomal doxorubicin for levering av legemidler
in vitro
, varierende både liposomal peptid tetthet og peptidet valens [39].
In vitro
, viser den mest effektive liposomformulering den H2009.1 tetramerisk peptidet ved en tetthet på 1,3% av det totale lipidinnholdet. Den 1,3% H2009.1 tetramert liposomformulering var to ganger mer toksisk for cellene enn liposomer som bærer styreegge scH2009.1 peptid, og mer enn 10 ganger mer giftig enn naken, uten peptid, liposomer. Til tross for disse
in vitro
resultater, er det uklart om det samme liposomformulering vil beste målet α
vp
6-uttrykke svulster
in vivo
. Vesentlige forskjeller mellom
in vitro
til
in vivo
sammenhenger, herunder eventuelle forskjeller i reseptor uttrykk og tilgjengelighet, tumor blodkar struktur, og narkotika biofordelingsstudier effekter.
For å undersøke den beste H2009.1 målrettet liposomal doxorubicin formulering for å hemme α
vp
6-uttrykke tumorvekst
in vivo
, vi systematisk variert ligandaffinitet, ligand tetthet, ligand stabilitet, liposom dosering, og tumor modeller for å vurdere rollen som aktiv målretting av liposomet i tre NSCLC-modeller. Til tross for målretting forskjeller mellom de ulike liposomformuleringene
in vitro
, alle H2009.1 peptid liposombehandlede plattformer utviser identisk effekt
in vivo
. I tillegg er det ingen effekt forskjell mellom de H2009.1 liposomer og styrer ikke-peptid liposomer. Etterfølgende eksperimenter viser at dette resultat skyldes EPR-baserte liposom-tumor akkumulering og svikt av liposomene til å trenge inn i tumorvevet forbi områder i umiddelbar nærhet til tumorvaskulaturen, til tross for utstrakt ekspresjon av α
vp
6 i tumoren . Disse resultatene markere kompleksiteten i
in vivo
narkotika målretting, selv når du bruker en høy affinitet ligand kjent for å selektivt målet svulster
in vivo
, og tyder på at en stor nanopartikkel ikke kan være den beste målretting plattform for hver svulst miljø.
Materialer og metoder
Material
Alle Fmoc aminosyrer ble kjøpt fra Novabiochem® (EMD Millipore, Billerica, MA). Sepharose CL-4B og Sephadex G-50 ble innkjøpt fra Sigma-Aldrich Inc. (Livermore, CA). Lipider ble kjøpt fra Avanti® Polar Lipids, Inc. (Alabaster, AL) og doksorubicinhydroklorid for injeksjon fra Bedford Laboratories ™ (Bedford, OH). Molecular Probes® fargestoffer Dil [Dil (C)
18 (3), 1,1′-dioktadekyl-3,3,3 «, 3»-tetramethylindocarbocyanine perklorat] og DIR [DiOC
18 (7) 1,1′-dioktadekyl-3,3,3 «, 3»-tetramethylindotricarbocyanine jodid], ble kjøpt fra Life Technologies ™ (Grand Island, New York). For cellekultur, ble føtalt bovint serum (FBS) kjøpt fra Gemini bio-produkter (West Sacramento, California) og både RPMI 1640 og Trypsin EDTA, 1x fra Mediatech, Inc. (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA).
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP
Alle menneskelige NSCLC cellelinjer som ble brukt var tidligere etablert og preget [55]. Cellelinjer ble hentet fra Hamon Senter for Terapeutisk onkologi Forskning ved UT Southwestern Medical Center. Cellelinjer ble rutinemessig testet for Mycoplasma og DNA fingeravtrykk for å bekrefte sin identitet. De H2009, H1975, og H460-cellelinjer ble alle dyrket ved 37 ° C og 5% CO
2 i RPMI 1640 supplert med 5% FBS.
Peptide Synthesis og rensing
Både monomere og tetramer H2009.1 og scH2009.1 peptider ble syntetisert som tidligere beskrevet [54]. Kort sagt ble alle monomere peptider og tetramerisk kjernen trengs for å gjøre det tetrapeptider syntetisert på en symfoni Synthesizer (Rainin Instruments, Protein Technologies, Inc., Tucson, AZ) ved standard Fmoc fast-fase peptidsyntese. Det tetra peptider ble syntetisert ved omsetning av 5-ganger overskudd av renset cystein bærende monomere peptider med renset maleimid-aktivert tetramert kjerne, i en oppløsning av PBS + 10 mM EDTA med risting ved RT i 2 timer. Alle peptider ble renset ved reversfase væskekromatografi (HPLC) ved anvendelse av en SPIRIT ™ Peptide C18 5 um, 25 x 2,12 kolonne (AAPPTec®, Louisville, KY) på en Breeze ™ HPLC (Waters Corporation, Milford, MA) ifølge publiserte elueringsbetingelser [54]. Matriks-assistert laserdesorpsjon /ionisering flukttid massespektrometri ble anvendt for å bekrefte at peptidet masse (Voyager-DE ™ PRO, Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). Massene av de monomere peptider (gjennomsnittlig masse beregnet /MH +: 1843,02 /1844,18) og tetramere kjerne (gjennomsnittlig masse beregnet /MNa +: 1251,49 /1274,27) ble bestemt i reflekterende modus ved hjelp av α-cyano-4-hydroxycinnamic syre som en matrise. Massene av det tetrapeptider (gjennomsnittlig masse beregnet /MH +: 8629,01 /8626,77) bestemt i lineær modus ved hjelp sinapinic syre som en matrise
Utarbeidelse av liposomalt doxorubicin
liposomer ble dannet fra løsninger. av lipidene hydrogenert soya L-α-phophatidylcholine (HSPC), kolesterol, 1,2-distearoyl-sn-glysero-3-phosphoethanolamine-N- [karbonyl-metoksy (polyetylenglykol) -2000] (DSPE-PEG
20 000), og 1,2-distearoyl-sn-glysero-3-phosphoethanolamine-N- [maleimid (polyetylenglykol) -2000] (DSPE-PEG
2000-maleimid) i 2: 1 kloroform: metanol. De 0,64% liposomer ble fremstilt fra blandinger av 100 mg (131 umol) av HSPC, 25,4 mg (65,6 umol) av kolesterol, 14,7 mg (5,20 umol) av DSPE-PEG
20 000 og 3,85 mg (1,31 umol) av DSPE -PEG
2000-maleimide. De 1,3% liposomer ble fremstilt fra blandinger av 100 mg (131 umol) av HSPC, 25,4 mg (65,6 umol) av kolesterol, 10,9 mg (3,87 umol) av DSPE-PEG
20 000 og 7,92 mg (2,69 umol) av DSPE -PEG
2000-maelimide. Oppløsningsmidlet ble fjernet under en langsom strøm av nitrogen ved 45
° C, og lipidfilmen ble igjen under vakuum over natten. Den tørkede lipidfilmen ble hydrert med 155 mM (NH
4)
2SO
4-buffer, pH 5,5, ved periodisk oppvarming ved 65
° C og virvling. Liposomer ble deretter ekstrudert 20 ganger gjennom doble stablet 100nm membraner, og PD-10 avsaltings kolonner (GE Healthcare, Waukesha, WI) ble brukt til å endre ytre liposomal buffer til 123 mM Na-sitrat, pH 5,5. Doksorubicin ble lastet fjern (post-liposom-dannelse) ved inkubering av liposomene og doksorubicin ved 65
° C i 1 time. Fri doksorubicin ble fjernet ved anvendelse av en Sephadex G-50 kolonne ekvilibrert med HEPES-bufret saltvann. Peptider ble konjugert til liposomer ved reaksjon i 24 timer ved et forhold på 2: 1 peptid:. DSPE-PEG
2000-maelimide i en løsning av HEPES-bufret saltoppløsning, og overskudd av peptid ble fjernet ved bruk av Sepharose CL-4B kolonner
Utarbeidelse av Dil eller dIR-merkede liposomer
Farg merkede liposomer ble fremstilt som beskrevet, bortsett fra at de ikke var lastet med doksorubicin. Den 1,3% liposomformulering ble fremstilt med tilsetning av Dil eller DIR fargestoff i blandingen av lipider i 2: 1 kloroform: metanol. De Dil eller dir-fargestoffer som ble oppløst i etanol ved en konsentrasjon på 2,5 mg /ml og ble tilsatt til lipidblandingen i et forhold på 3,75 ug fargestoff /0,5 mg lipid. Oppløsningsmidlet ble fjernet under en langsom strøm av nitrogen ved 45
° C, og lipidfilmen ble igjen under vakuum over natten. Den tørkede lipidfilmen ble hydrert med 155 mM (NH
4)
2SO
4-buffer, pH 5,5, ved periodisk oppvarming ved 65
° C og virvling. Liposomer ble deretter ekstrudert 20 ganger gjennom doble stablet 100 nm membraner, og PD-10-avsaltings kolonner (GE Healthcare, Waukesha, WI) ble anvendt for å forandre den ytre liposomale buffer til HEPES-bufret saltløsning. Peptider ble konjugert til liposomer ved reaksjon i 24 timer ved et forhold på 2: 1 peptid:. DSPE-PEG
2000-maelimide i en løsning av HEPES-bufret saltløsning og overskudd av peptid ble fjernet ved bruk av Sepharose CL-4B kolonne
Etablering av Musetumormodeller
Animal protokoller ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved UT Southwestern Medical Center (Animal Welfare Assurance antall A3472-01, protokollnummer 2010-0280). All tenkelig ble utført under isofluran, og hver innsats ble gjort for å minimere lidelse i tråd med anbefalingene i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. Kvinne NOD /SCID mus (fra UT Southwestern Medical Center Mouse Avl Kjerne Facility) ble injisert med 1 million H2009, H1975, eller H460 celler i høyre flanke. Alle celler ble injisert i fosfatbufret saltvann, pH 7,4, og ble fremstilt for injeksjon ved å inkubere cellene med 0,05% Trypsin-EDTA (Gibco®, Life Technologies ™, Grand Island, NY) i 10 minutter, avkjøling av trypsin med media, og vasking av cellene med fosfat-bufret saltvann før endelig suspensjon i fosfatbufret saltløsning ved en konsentrasjon på 10 millioner celler per mL.
in vivo terapeutiske eksperimenter
Subkutan H2009 tumorer ble etablert i flanken av NOD /SCID-mus. Når palpable tumorer hadde dannet seg, 18 dager etter tumorcelle implantasjon, ble musene behandlet med HBS (kontroll) eller forskjellige liposom-formuleringer, basert på den totale konsentrasjon av doksorubicin. De forskjellige liposom-formuleringer og behandlingsdoser er beskrevet i detalj under resultatene. For alle eksperimentene ble musene behandlet en gang i uken i 3 uker, på dag 18, 25 og 32, via haleveneinjeksjon. Svulster ble målt av en uavhengig forsker, og svulstvolum ble beregnet ut fra formelen
V
=
(lxb
2
) Twitter /2.
statistiske metoder
den statistiske signifikans av tumorstørrelsesforskjeller mellom legemiddel-behandlede grupper og kontrollgruppen ble beregnet ved hjelp av en enveis ANOVA med Dunnetfs multiple sammenligningstest og mellom ulike legemiddelbehandlede grupper, ved hjelp av en enveis ANOVA med Tukey multippel sammenligningstest. Den statistiske signifikans av forskjeller mellom overlevelseskurver ble beregnet ut fra Kaplan-Meier-kurver med log-rank tester. Alle beregninger ble bestemt ved hjelp av GraphPad Prism.
I Vivo og Ex Vivo nærheten Infrared Imaging
Mus peiling subkutan H2009, ble H1975 eller H460 svulster i høyre flanke injisert via halevenen med DiR- merkede liposomer ved en konsentrasjon på 22,22 pmol fosfolipid /kg. Dette fosfolipid /kg konsentrasjon korrelerer med den samme mengde av fosfolipid (og derfor det samme antall av liposomer) som er tilstede i en behandling av 4 mg /kg liposomal doksorubicin. H2009 og H460 tumorbærende mus ble injisert med DIR-merkede versjoner av 1,3% H2009.1 tetramerisk, AcH2009.1 tetramerisk, scH2009.1 tetramerisk, eller nakne liposomer med 3 mus pr liposomer gruppe. Mus med H1975 svulster ble injisert med DIR-merkede versjoner av 1,3% H2009.1 tetramerisk, scH2009.1 tetramerisk, eller åpen liposomer med tre mus per liposomer gruppe. For hver mus ble Nair® anvendt for å fjerne alt hår fra den nedre halvdel av kroppen. Ved 24, 48 og 72 timer etter liposom injeksjon ble musene avbildes for DIR fargestoff fluorescens ved hjelp av en IVIS® Lumina (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA). Etter hele musen bildebehandling på 72 timer, ble alle musene avlivet og organer fjernet for
ex vivo
fluorescerende bildebehandling. For hver mus, ble organene avbildes på begge sider, og gjennomsnittet av strålende effektivitet verdien av begge sider brukes som den faktiske verdien av liposomer opphopning i at vevet.
Mikroskopi av DII liposomer i tumorsnitt
Mus som bærer subkutane H2009, H1975, eller H460-tumorer ble injisert via halevenen med dii-merkede liposomer ved en konsentrasjon på 22,22 pmol fosfolipid /kg. For hver tumor type, ble musene injisert med Dii-merket versjoner av 1,3% H2009.1 tetramerisk, scH2009.1 tetramerisk, eller åpen liposomer, med tre mus per liposomer gruppe. En mus fra hver gruppe ble avlivet ved 24 timer, en andre mus ved 48 timer, og den tredje musen i 72 timer. Ved ofring ble svulstene fjernet og hurtigfryst inne cryomolds hjelp Tissue-Tek® O.C.T. Forbindelse montering medium (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA).
For mikroskopi, ble svulstene seksjonert på 10 mikrometer ved hjelp av et Leica CM3050S cryostat (Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove, IL). Seksjoner ble oppnådd fra toppen, midten og bunnen av hver svulst. For blodkar flekken, ble en CD31 primært antistoff (Rat-anti-CD31, katalog # 550274, BD Biosciences, San Jose, CA) som brukes på en 1:50 fortynning og en fluorescein geit anti-rotte sekundært antistoff (katalog # A10528, Life Technologies ™, Grand Island, NY) ble anvendt ved en 1: 100 fortynning. Platene ble montert med Dapi Fluoromount-G (SouthernBiotech, Birmingham, AL) og avbildes på en Leica CTR5500 mikroskop (Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove, IL) og en Deltavision
PDV
deconvolution mikroskop (Applied Precision, Inc., Issaquah, WA).
β
6 Farging av tumorsnitt
tumor snitt preparert fra svulstene som inneholder Dii-liposomer ble farget for β
6 uttrykk ved hjelp av en β
6 primære antistoff (katalog # MAB2076Z, EMD Millipore, Billerica, Massachusetts) ved en 1:50 fortynning, og et fluorescein geit anti-rotte-sekundært antistoff (katalog # A10528, Life Technologies ™, Grand Island, NY) ved en 1: 100 fortynning. Slides ble fotografert på en Leica CTR5500 mikroskop (Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove, IL) og en Deltavision
PDV
deconvolution mikroskop (Applied Precision, Inc., Issaquah, WA).
Resultater
In Vivo Effekt av H2009.1 tetramerisk Peptide liposomer Targeting α
vp
6
for å undersøke om α
vp
6 spesifikke H2009.1 peptid kan brukes til å øke
in vivo
levering og effekt av liposomalt doxorubicin mot α
vp
6-uttrykke NSCLC tumorer, setter vi ut for å utforske effekten av liposomal peptid tetthet og valens på terapeutiske resultater i tumorbærende mus. Vi begynte ved behandling av tumorbærende mus med 1,3% H2009.1 tetramere peptid liposom-formulering som viste den beste
in vitro
effekt med begrenset ikke-spesifikk toksisitet [39]. I denne 1,3% liposomformulering, er 1,3% av det totale lipid modifisert med maleimid for å tillate cystein-bærende peptider i par til lipid via cystein-maleimid kjemi. Således, 1,3% av lipidene som utgjør hver liposom-bærer H2009.1 peptid, noe som resulterer i omtrent 1400 peptider pr liposom. Kobling av H2009.1 tetramerisk peptidet til 1,3% liposomformulering resulterer i et nanopartikkelbasert multivalent fremvisning av den iboende flerverdige tetramerisk peptid, noe som resulterer i en lagdelt multivalency som fører til høyere spesifisitet og høyere toksisitet mot α
vp
6-uttrykker NSCLC celler
in vitro
enn liposomer modifisert med den monomere H2009.1 peptid.
H2009 NSCLC celler som uttrykker α
vp
6, ble injisert i NOD /SCID-mus for å danne subkutane H2009 xenografter. På dag 18, etter at musene hadde dannet palpable tumorer, ble de behandlet med HEPES bufret saltvann (HBS) som en kontroll; fri, ikke-liposom innkapslet, doksorubicin; α
vp
6-målrettet 1,3% H2009.1 tetramerisk liposomalt doxorubicin; eller kontrollere liposomalt doxorubicin formuleringer. To forskjellige liposomformuleringene ble brukt som ikke-målrettede kontroller: 1,3% «naken», ingen peptid, liposomer og 1,3% scH2009.1 tetramer liposomer. De 1,3% nakne liposomer tjene som en normal, ikke-peptid målrettede liposom-kontroll, som bør bare samler seg passivt i tumorer basert på EPR virkning. De 1,3% scH2009.1 tetramer liposomer vise en sekvens kryptert versjon av H2009.1 peptid som ikke målrette α
vp
6; Derfor er disse liposomene tjene som en kontroll for spesifisiteten av den H2009.1 peptidet og sikre at ladningen og hydrofilisiteten av peptidet ikke kjører tumor akkumulering. Musene ble behandlet via halevenen intravenøse injeksjoner en gang i uken i 3 uker med 4 mg /kg av hvert liposom-formulering, basert på total doxorubicin konsentrasjon på dagene 18, 25, og 32 etter tumorcelle implantasjon. Dette regimet vil gi den maksimale tolererte dose levetiden for NOD /SCID-mus i løpet av en periode på 2 uker [56]. Ukentlige injeksjoner ble valgt basert på tidligere studier; flere injeksjoner ved en lavere dose har vist seg å være av lignende virkning som en høyere ukentlig dose for andre liposomer med de samme lipid formuleringen [2,16,57,58].
Som vist i figur 1A, alle liposom formuleringer betydelig hemmet tumorvekst sammenlignet med kontroll HBS behandlet gruppe, med p-verdier mindre enn 0,001. Det ble imidlertid ikke observert noen forskjell mellom en hvilken som helst av liposomformuleringene. De målrettede 1,3% H2009.1 tetramer liposomer hemmet tumorvekst i den samme utstrekning som både styre scH2009.1 tetramere eller nakne liposomer. Svulsten vekstratene er nesten identisk opp til dag 64, noe som medførte at scH2009.1 tetramerisk kurven skiller seg litt ut, men er fortsatt innenfor feilmarginen i H2009.1 tetramerisk og nakne liposome grupper. Viktigere, er denne effekten reproduserbar; dataene i figur 1A representerer kombinasjon av flere separat utført eksperimenter.
Subkutan H2009 svulster ble etablert i flanken av NOD /SCID-mus. Tumor-bærende mus ble behandlet med HBS (kontroll) og enten 4 mg /kg (
A
–
B
) eller 2 mg /kg (
C Anmeldelser –
D
) av fri doksorubicin eller 1,3% H2009.1 tetramert, scH2009.1 tetramer, eller nakne liposomer, basert på den totale konsentrasjon av doksorubicin.
A
) Tumor vekstkurver for mus behandlet med 4 mg /kg for de forskjellige liposom-formuleringer viser at α
vp
6-målretting 1,3% H2009.1 tetramer liposomer hemme tumorvekst i den samme utstrekning som styre scH2009.1 tetramerisk og naken, ikke-peptid, liposomer. (
B
) Kaplan-Meier-overlevelseskurver for mus behandlet med 4 mg /kg for de forskjellige liposom-formuleringer demonstrerer at alle liposom-behandlingene i betydelig grad øke overlevelse sammenlignet med kontrollmus (p 0,0001 for H2009.1 tetramer og nakne liposomer og p = 0,0007 for scH2009.1 tetramer liposomer), og behandling med H2009.1 tetramer liposomene øker overlevelse sammenlignet med behandling med kontroll scH2009.1 tetramer liposomer (p = 0,0068). (
C
) Tumor vekstkurver for mus behandlet med 2 mg /kg av de forskjellige liposom-formuleringer viser at fri doksorubicin og alle liposom-formuleringene i betydelig grad hemme tumorvekst i forhold til kontroll mus, og alle 3 liposomformuleringer hemme tumor vekst i samme grad på nivåer betydelig bedre enn fri doksorubicin. (
D
) Kaplan-Meier-overlevelseskurver for mus behandlet med 2 mg /kg av de forskjellige liposomformuleringene demonstrerer ingen signifikant overlevelse forskjell mellom mus behandlet med enten fri doksorubicin eller en hvilken som helst av liposomformuleringene. (
E
F
) Direkte sammenligninger av tumorvekst (
E
) og overlevelse (
F
) av mus behandlet med 4 mg /kg eller 2 mg /kg av 1,3% H2009.1 tetramer liposomer viser at 4 mg /kg behandling var betydelig bedre ved å inhibere tumorvekst og betydelig økt overlevelse (p = 0,0005). Pilene viser behandlingsdagene. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0.001verses kontroll, med mindre annet er angitt med parentes.
Total overlevelse av musene på de forskjellige behandlingsregime ble også bestemt. Fri, ikke-liposom innkapslet, doksorubicin viste seg å være giftige for mus ved denne 4 mg /kg doseringsregime. De frie doxorubicin behandlede mus alle døde på dag 32, før du mottar den tredje og siste dose av stoffet. Derfor er to injeksjoner på 4 mg /kg doksorubicin, for en total på 8 mg /kg doksorubicin, er tilstrekkelig for medikament-indusert toksisitet i våre studier. Alle de andre mus levde inntil de ble avlivet på grunn av deres tumorer nådde en lengde på 2 cm (figur 1B). Som forventet fra tumorvekstkurver, var det en betydelig overlevelse forskjell mellom kontrollgruppen og alle liposom behandlingsgrupper (p 0,0001 til 1,3% H2009.1 tetramer og nakne liposomer og p = 0,0007 til 1,3% scH2009 .1 tetramer liposomer). Mens tre av de 1,3% H2009.1 tetramert liposom-behandlede mus levde lenger enn noen av de 1,3% nakne liposom-behandlede mus, er disse forskjellene var ikke statistisk signifikante. Imidlertid, var det en betydelig overlevelse forskjell mellom mus behandlet med 1.3% H2009.1 tetramer og scH2009.1 tetramer liposomer (p = 0,0068). Derfor, selv om behandling med 1,3% H2009.1 tetramer liposomer ikke bedre terapeutisk effekt på en 4 mg /kg doseringsregime i forhold til de ikke-målrettede nakne liposomer, disse α
vp
6-målrettede liposomer økt overlevelse sammenlignet med kontroll peptid scH2009.1 tetramer liposomer.
Effekter av Liposome Dosering på In Vivo Effekt av H2009.1 Peptide liposomer
Så det var ingen økt behandlingseffekt for 1,3% liposomer viser H2009.1 tetramere peptid vers tak nakne liposomer, begrunnet vi at α
vp
6 spesifikk målretting av de H2009.1 peptid-liposomene kan bli maskert av effektiviteten av de nakne liposomer ved konsentrasjoner på fire behandlings mg /kg (12 mg /kg totalt). Dette kan føre til ved å mette reseptoren slik at forskjellene mellom aktiv og passiv målretting er redusert.
