Abstract
I denne studien hypotese vi at androgen-deprivasjon terapi (ADT) i prostata kreft, selv om utgangspunktet effektiv, induserer endringer i tumoren kinome, som senere fremmer utvikling av kastrering-resistente (CR) sykdom. Erkjennelsen sammenhengen mellom svulsten hypoksi og dårlig prognose i prostatakreft, vi videre antatt at slike endringer kan være påvirket av hypoksi. Mikromatriser med 144 kinase peptidsubstrater ble brukt til å analysere CWR22 prostata carcinom xenograft prøver fra ADT-naive, androgen mangel (AD), langsiktig AD (ADL), og CR sykdomsstadier. Virkningen av hypoksi ble vurdert ved å matche xenograft kinase aktivitet profiler med de ervervet fra hypoksisk og normoksisk prostata karsinom cellekulturer, mens den kliniske relevansen ble evaluert ved å analysere prostatektomi tumorprøver fra pasienter med lokalavansert sykdom, enten i ADT naive eller tidlig CR sykdomsstadier. Ved å bruke denne romanen peptidsubstrat microarray metoden vi avdekket høy kinase aktivitet mediert av signal svinger og aktivator av transkripsjon 5A (STAT5A) i CR prostatakreft. I tillegg har vi avdekket høy STAT5A kinase aktivitet allerede i tilbakegang ADL xenografter, ble før fornyet CR vekst dokumentert. Til slutt, siden økt STAT5A kinase-aktivitet ble også påvist etter eksponering av prostata carcinoma celler til hypoksi, foreslår langvarig ADT å indusere tumor hypoksi og stimulere STAT5A kinaseaktivitet, deretter fører til fornyet CR tumorvekst. Derfor studien oppdaget STAT5A som en kandidat til å bli videre etterforsket for sitt potensial som markør for avansert prostatakreft og som mulig terapeutisk mål protein
Citation. Røe K, Bratland Å, Vlatkovic L, Ragnum HB, Saelen MG, Olsen DR, et al. (2013) hypoksiske tumor Kinase Signa formidlet av STAT5A i Utvikling av Kastrering resistent prostatakreft. PLoS ONE 8 (5): e63723. doi: 10,1371 /journal.pone.0063723
Redaktør: Jean-Marc A. Lobaccaro, Clermont Université, Frankrike
mottatt: 27 juni 2012; Godkjent: 11 april 2013; Publisert: 10 mai 2013
Copyright: © 2013 Røe et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Helse Sør-Øst Norge RHF gir 2009070 og 2012002 (KR), tilskudd fra Division of Medicine, Akershus universitetssykehus, og EU 7. rammeprogram tilskuddet 222741- METOXIA. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Den første veksten av en ondartet prostata svulst stimuleres av androgener [1], og standard førstelinjebehandling av pasienter med avansert prostatakreft omfatter androgen-deprivasjon terapi (ADT) [2]. Selv om utgangspunktet effektive, svulster uunngåelig går igjen i en kastrering-resistente (CR) tilstand. Metastatisk, er CR prostatakreft fortsatt gjenstår det mest bekymret aspektet i prostatakreft ledelse, trosset langvarig behandlingseffekter. Derfor er forbedret forståelse av drivkreftene bak CR prostatakreft garantert å muliggjøre utvikling av mer effektive behandlingsstrategier for denne pasientgruppen.
Hypoksi er en vanlig microenvironmental faktor av solide svulster, fremme tumorvekst samt angiogenese, metastase, og terapiresistens [3], [4]. I prostatakreft, har svulsten hypoksi faktisk blitt korrelert med dårlig prognose [5] – [7], men skepsisen er fortsatt som sin rolle og rutinemessig klinisk betydning.
In vitro
studier har vist at hypoksi øker aktiviteten og følsomheten til androgen reseptoren [8], som i mange CR tumorer kan føre til et utvalg av tilpassede fenotyper [9].
Det har i mange år vært kjent at sykdomsprogresjon og utvikling av resistens behandling i kreft generelt er kjennetegnet ved endret ekspresjon og aktivitet av nøkkelmediatorer i cellulære signaloverføring, å regulere prosesser som proliferasjon, invasjon, og angiogenese [10]. Betydningen og potensiell bruk av slike endringer for å forbedre kreftbehandling er i økende grad anerkjent, spesielt som avvikende protein kinaser spiller viktige roller i ondartet svulst progresjon [11] – [13]. Av det humane kinome (alle kinaser), blir omtrent halvparten av tyrosinkinase-komplement implisert i kreft [14]. Identifisering av avvikende tyrosin kinaser har derfor dukket opp som en attraktiv tilnærming i jakten på bedre deteksjon av sykdom aggressivitet og nye terapeutiske mål.
Vi antok at ADT i prostata kreft, selv om utgangspunktet effektiv, induserer endringer i aktiviteten til svulsten kinome som senere fører til fornyet, CR tumorvekst. For å undersøke denne hypotesen, microarrays med kinase peptidsubstrater, hovedsakelig representerer tyrosinrester, ble brukt til å analysere prøver fra en
in vivo
preklinisk prostatakreft modell som gjenspeiler ulike stadier i utviklingen av CR sykdom. Virkningen av hypoksi ble vurdert ved å matche denne modellens kinase aktivitetsprofiler med de som genereres fra hypoksiske og normoksisk prostata karsinom cellekulturer. Klinisk relevans ble evaluert ved å analysere prostatektomi tumorprøver fra pasienter med lokalavansert sykdom, enten i ADT-naive eller tidlig CR sykdomsstadier.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
alle dyreforsøk ble utført i henhold til protokoller godkjent av Animal Care og bruk komité ved Institutt for komparativ medisin, Oslo universitetssykehus (Permit Number: 32-1984), i samsvar med retningslinjer for dyrevelferd i norske nasjonalkomiteen for dyreforsøk . Den kliniske studien protokollen ble godkjent av Regional komité for medisinsk og helsefaglig forskningsetikk (REC South East, Permit Number: S-08607b) og var i samsvar med Helsinkideklarasjonen. Skriftlig informert samtykke var nødvendig for deltakelse.
Preklinisk Tumor Model
Tissue fragmenter (ca. 2 × 2 × 2 mm
3) av den menneskelige, androgen-sensitive CWR22 prostata carcinom xenograft [ ,,,0],15] var subkutant (sc) implantert i en flanke av mannlige, BALB /c naken mus (30-35 g, 6-8 uker gamle), sammen med en 12,5 mg vedvarende utgivelsen testosteron pellets (nyskapende forskning of America, Sarasota, FL ).
løpet av utviklingen av CR sykdom etter ADT er illustrert i figur 1A, ved hjelp av preklinisk modell for å fremkalle forskjellige sykdomsstadier. Først ble xenografter representerer ADT naive sykdom rekruttert når deres korteste diameter nådd 8 mm. For det andre, ADT ble utført når den korteste xenograft diameter nådd 12 mm, ved kirurgisk kastrasjon og samtidig seponering av eksponering for testosteron pellets. Androgen-belastede (AD) xenografter ble rekruttert når deres diameter ble redusert til 8 mm (omtrent en måned etter kastrering). Tredje, langsiktig AD (ADL) xenografter ble rekruttert når deres diameter ble redusert til 4 mm (ca 4 måneder etter kastrering). Sist ble det CR xenografter med fornyet vekst inkluderes når deres diameter nådd 8 mm, som er 5,4 ± 0,4 måneder etter kastrering. Xenograft diametre ble målt ved hjelp av en skyvelære to ganger ukentlig fra implantasjon til kastrering og en gang ukentlig etter kastrering til slutten av eksperimentet
(A) xenograft diametre versus tid i overgangen fra androgen-deprivasjonsterapi (ADT). – naive, via androgen mangel (AD) og langsiktig AD (ADL), til kastrering-resistente (CR) sykdom, etter ADT ved kastrering. Tid til å utvikle CR sykdom hos pasienter som er ca. 2 til 5 år. I vår prostatakarsinom xenograft-modell, den tilsvarende tid var 5,4 ± 0,4 måneder. De fire sirklene representerer de fire forsøksgruppene i denne studien. Blodprøver for prostata-spesifikt antigen (PSA) målinger ble trukket fra alle musene før tumorene ble spaltet ut og hurtigfrosset for kinaseaktivitet profilering. (B) serum PSA nivå reflekterte klinisk mønster av sykdomsprogresjon. Petroleumstilsynet ble redusert i AD og ADL svulster, før de blir restaurert i CR svulster. Signifikante forskjeller (p 0,05) sammenlignet med ADT-naive tumorer er indikert (*). Hver søyle representerer gjennomsnittet og s.e.m på 3-6 svulster.
Kastrering ble utført under bedøvelse, ved hjelp av subkutan injeksjoner av zoletil blanding (2,4 mg /ml tiletamin, 2,4 mg /ml zolazepam (Zoletil veterinær, Virbac Laboratories, Carros, Frankrike), 3,8 mg /ml xylazin (Narcoxyl veterinær, Roche, Basel, Sveits), og 0,1 mg /ml butorphanol (Torbugesic, Fort Dodge Laboratories, Fort Dodge, IA)), fortynnet 1:05 i sterilt vann, i en dose på 7,5 ul /g. Analgesi ble gitt til kastrerte dyr som s.c. injeksjoner av buprenorfin (Temgesic, Schering-Plough, Brussel, Belgia), i en dose på 0,1 mg /kg.
Blodprøver for prostataspesifikt antigen (PSA) analyse ble trukket tilbake fra alle dyrs femoralvenene rette før aktiv dødshjelp. Prøvene fikk lov til å koagulere før den ble sentrifugert og lagret ved -80 ° C inntil alle prøver ble analysert samtidig. Gratis og total serum PSA nivå ble analysert ved fluoroimmunonometric AutoDELFIA ProStatus ™ PSA Free /Total kit (PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Wallac Oy, Turku, Finland). Avliving av dyr ble utført av livmorhals dislocations og umiddelbart etterfulgt av fjerning av svulstvev, som direkte var snap-frosset i flytende nitrogen, og lagret ved -80 ° C.
Pasienter
For Hensikten med å validere prekliniske data, ble fire pasienter med prostatakreft som hadde gjennomgått radikal prostatektomi med klare reseksjonskanten inkludert i studien (tabell 1). Pasientene ble rekruttert ved Det Norske Radiumhospital, Oslo universitetssykehus. Histopathologic svulsten og lymfeknutestatus (PTN), tumor Gleason score, og preoperativ serum PSA nivå ble registrert som en del av standard kliniske prosedyrer. Pasient 4 hadde fått forlenget (~ 2 år) tre-månedlig subkutan goserelin i en dose på 10,8 mg inntil hans PSA-nivå begynte å øke etter ADT nadir, og han ble henvist til definitive kirurgi.
Tissue Forberedelse
xenograft og kirurgiske biopsier fra prostatektomi prøver, fersk frosset umiddelbart etter reseksjon, ble først evaluert for svulst celle innhold, etter å ha blitt seksjonert ved hjelp av en cryostat mikrotom og farget med hematoxylin og eosin. Enhver normal vev stede i tumorprøver ble grovt fjernet ved disseksjon guidet av flekker. Alle vevsprøver anvendt hadde tumorcelleinnhold høyere enn 80%. Prøvene ble deretter kuttet i 10 um seksjoner, kontinuerlig holdes frossen og umiddelbart igjen lagret ved -80 ° C. Et volum på ~3 mm
3 ble kuttet av alle xenograft prøver, det nødvendige antall seksjoner for å kutte beregnes etter måling prøvene «bredde og lengde. Ved identiske prosedyrer, ~ 5 mm
3 ble delt av hver prostatektomi biopsi (normal og svulst) prøven.
Data Analysis of prostatakarsinom xenografter «kinase aktivitet Profiler
Prosedyrer for utarbeidelse av proteinlysatene og generering av kinase aktivitetsprofiler er beskrevet i tekst S1. Protein lysates fra tre biologiske replikater fra hver av de fire forsøksgruppene (ADT-naive, AD, ADL, CR) ble analysert for å generere xenograft kinase aktivitetsprofiler.
Etter visuell sjekk og bakgrunn subtraksjon, endepunkt signalintensitet (den gjennomsnittlige signalintensiteten av de tre siste kinetiske sykluser) for hver enkelt sted, det vil si for hver kinase peptid substrat pr matrise, ble beregnet ved BioNavigator (PamGene International BV). Et lite antall negative signal intensiteter ble administrert ved å trekke 1% kvantil av alle data og sette de resterende signalintensitet mindre enn 1 til 1. Deretter alle signalintensitet var log
2-transformert før gjennomsnittlig gjenskape signalintensitet innenfor hvert forsøk ble beregnet for hvert peptid-substrat. For å korrigere for mulige eksperiment til eksperiment variasjon, ble gjennomsnittet av de fire forsøksgruppene «signalintensiteter for hvert peptid substrat subtrahert fra hver gruppe peptidsubstrat signalintensitet. Microarray data blir sendt til ArrayExpress (https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/); sjonsnummer E-mtab-1572
ble senere utført Statistisk analyse i PASW Statistikk 18,0 (IBM, Somers, NY), med p. 0,05 ansett som statistisk signifikant. ANOVA ble brukt til å identifisere peptidsubstrater med vesentlig forskjellige fosforylering nivåer mellom de eksperimentelle gruppene (ADT-naive, AD, ADL, og CR). Den Dunnetts mange-til-en (AD, ADL, og CR versus ADT-naive) post-hoc test justert for multiple sammenligninger. Peptid underlag «protein og genet navn, blant annet informasjon om de cellulære prosessene de er involvert i, ble hentet Uniprot (https://uniprot.org, 15 mai 2012) og HUGO Gene Nomenclature Committee (HGNC) (http: //www.genenames.org;. 15 mai 2012) [16]
kinase aktivitet Profilering av prostatektomi Biopsi prøver
Tre tekniske replikater (både svulsten og normale prøver) ble analysert fra hvert pasient, på en Tyrosin PamChip®96 plate, på PamGene International BV plassering i «s-Hertogenbosch, Nederland. Eksempelløpe ble utført som tidligere beskrevet [17]. Fra den resulterende datasettet, beregnes etter visuell sjekk og bakgrunn subtraksjon, data var log
2-transformert etter innstillingen noen datapunkter med signal intensiteter mindre enn 1 til 1.
hypoksisk Eksponering av prostata carcinoma celler
22Rv1, PC3, DU145 og human prostata carcinoma-cellelinjer ble erholdt fra American Type Culture Collection (ATCC). Alle cellelinjer ble godkjent av kort tandem repeat (STR) profilering basert på 16 polymorfe markører i bruk av ATCC og farskap testing, og bekreftet å være mycoplasma-fri (MycoAlert, BioNordika, Oslo, Norge). Alle cellelinjer ble holdt i RPMI 1640 medium (Sigma-Aldrich, Oslo, Norge) supplert med 10% føtalt kalveserum, 1% L-glutamin (Invitrogen, Oslo, Norge), og 1% penicillin /streptomycin (Invitrogen). Cellene ble rutinemessig dyrket som et monolag i 75 cm
2 kolber ved 37 ° C i 95% luft /5% CO
2, og dyrket to ganger i uken for å opprettholde eksponentiell vekst.
For å undersøke endringer i kinase-aktivitet indusert ved hypoksi, eksponentielt voksende celler ved -60% konfluens, med friskt medium, ble overført til en hypoksi kammer i 24 timer (Invivo2 200; Ruskinn Technologies, Leeds, UK). Moderat hypoksi (1% O
2) ble oppnådd ved 5% CO
2 og rest N
2. Alvorlig hypoksi (anoksi) ble oppnådd ved 5% CO
2 og en blanding av 10% H
2 og 90% N
2 i kombinasjon med en katalysator som katalysert omdannelse av H
2 med noen O
2 latt til H
2o. Alle normoxia og hypoksi eksperimenter ble utført tre ganger for å generere tre biologiske replikater på alle eksperimentelle betingelser.
Kinase Activity Profilering av prostata-carcinomceller
Fremstilling av protein lysater er beskrevet i tekst S1. Kinaseaktivitet profilering ble utført identisk som for xenotransplantater, ved anvendelse av 10 ug av total protein fra alle prøver. Protein lysater fra tre replikater biologiske fra hver av de tre eksperimentelle grupper (normoxia, moderat hypoksi, hypoksi alvorlig) ble analysert for å generere kinase aktivitetsprofiler. I post-hoc Dunnetts test, ble kontroll tilstand representert ved normoksisk vev. En evaluering av teknisk reproduserbarhet av arrays (interchip og intra korrelasjoner følgende analyse av det samme cellekultur lysat i alle matriser) er presentert i tekst S2.
Koboltklorid Behandling
For å simulere hypoksisk eksponering og ekspresjon av den hypoksi-induserbar faktor-1α (HIF-1 a) celler ble eksponert for 100 uM av den hypoksi-mimetiske middel koboltklorid (CoCl
2) (Sigma Aldrich) i 4 timer før protein lysater ble laget. Behandling med CoCl
2 induserer HIF-1α ekspresjon ved binding til PAS domene, som blokkerer HIF-1α pVHL binding, og dermed gi HIF-1α stabilisering [18].
Western Blot analyse
Protein og Fosfoproteinet uttrykk ble målt ved western immunoblot. De primære antistoffer var anti-HIF-1α (BD Biosciences, Trondheim, Norge), anti-STAT5A (Sigma-Aldrich), og anti-fosfor STAT5A /B (Y694 /Y699) (Millipore, Temecula, CA). Mus monoklonalt anti-γ-tubulin (Sigma-Aldrich) ble anvendt som kontroll lasting. Sekundære antistoffer ble peroksydase-konjugert geit anti-kanin og esel anti-mus (Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, MA). Proteinene ble visualisert ved chemiluminescence hjelp SuperSignal West Dura Utvidet Varighet substrat (Thermo Scientific, Rockford, IL) eller LumiGLO kjemiluminescenssubstrat (KPL, Gaithersburg, MD).
Resultater
Validering av Preklinisk Model
CWR22 prostatakarsinom xenografter utstilt volum reaksjonsmønstrene følgende kastrering lik dem sett hos pasienter, og utviklet CR xenografter etter 5,4 ± 0,4 måneder (Figur 1a). Når regnskap for omtrent fem ganger raskere metabolisme hos mus, tilsvarer dette rundt 2-3 år hos mennesker. Den klinisk relevant sykdomsprogresjon av xenograft ble ytterligere bekreftet av serum PSA quantifications fra dyrenes blodprøver (figur 1B). Reduksjonen i PSA fra ADT-naive xenografter til AD og ADL xenografter var signifikant (p = 0,032 og p = 0,042, henholdsvis). I CR xenotransplantater, ble pre-ADT PSA-nivå gjenopprettes.
kinase-aktivitet i xenotransplantater Etter ADT
Fra analysen av kinase aktivitetsprofiler som genereres av xenotransplantater, fosforylering av 35 av de kinase peptidsubstrater ble funnet å være signifikant påvirket (økt eller redusert) etter ADT etter kastrering (tabell 2). Disse underlag representert proteiner involvert i flere cellulære prosesser, slik som angiogenese (f.eks PDGFR, VEGFR, Epor), overlevelse, spredning, og progresjon (f.eks MAPK, RAF, STAT), og adhesjon, migrasjon og invasjon (f.eks FER, FES, MET).
i forhold til ADT-naive xenografter, noen substratfosforylering nivåer generert av AD xenografter var svakt redusert, mens andre ble økt. I figur 2A den logaritmiske
2-forhold og S.E.M. for alle 35 viktige substrater er vist for de tre behandlingsgruppene versus ADT-naive xenografter, med blå farge indikerer negativ log
2 forhold og rød farge indikerer positiv log
2 forhold, henholdsvis. I figur 2B Volcano plott (-log
10 p-verdier versus log
2 ratios) er å visualisere kinase peptidsubstrater med de mest betydningsfulle og /eller høyeste logg
2 forhold mellom behandlede og ADT-naive svulster «fosforylering nivåer
(A) Redusert. (blå, negativ log
2 ratio) og økt (rød, positiv log
2 ratio) fosforylering nivåer av kinase peptidsubstrater av androgen fratatt (AD ), langsiktig AD (ADL), og kastrering-resistente (CR) prostatakarsinom xenografter forhold til ADT-naive tumorer (gjennomsnittsratio og sem per substrat). Protein lysater fra tre replikater biologiske fra hver av de fire forsøksgruppene (ADT-naive, AD, ADL, CR) ble analysert for å generere de xenograft-kinase aktivitetsprofiler. Oppført er substrater «tilsvarende genet navn, med start- og sluttposisjonen for peptidsekvens innenfor proteinet i parentes. (B) Volcano plott (-log
10 p-verdier versus prosenter) visualisering kinase peptidsubstrater med mest betydningsfulle og /eller høyeste logg
2 forhold mellom behandlede og ADT-naive svulster «fosforylering nivåer. Color merking: gul: p 0,01 og ratio 1,0; green: p 0,01 og ratio = 0,5-1,0; mørk rosa: p = 0,01-0,05 og forholdet 1,0; orange: p = 0,01-0,05 og forholdet = 0,5-1,0; blå: p = 0,01-0,05 og forholdet 0,5; blekrosa.: p 0,05
I samsvar med betydelig tumorveksthemning etter langvarig ADT nivået av substrat-fosforylering av ADL-xenografter ble sterkt redusert for 32 av de 35 kinase peptidsubstrater, sammenlignet til de respektive fosforylering nivåer som stammer fra eksponentielt voksende ADT naive xenografter. To av de tre gjenværende kinase peptidsubstrater, som representerer signalet som transduseren og aktivator av transkripsjon 1 og 5A (STAT1 og STAT5A), viste betydelig økt fosforylering av ADL xenotransplantater, med en log
2-forhold sammenlignet med ADT-naive xenotransplantater på 1,5 ± 0,3 til STAT1 (p = 0,004) og 1,5 ± 0,7 for STAT5A (p = 0,019). Fosforylering av CR xenografter var for de fleste av substrater restaurert på samme nivå som for ADT-naive xenografter. Men også fra CR xenografter, fosforyleringen av STAT1 og STAT5A underlag var høy, for STAT5A være betydelig i forhold til ADT-naive xenografter (p = 0,040; log
2 ratio = 1,3 ± 0,8)
kinase aktivitet i ADT-naive prostatektomi prøver
for å vurdere klinisk relevans, kinase aktivitet profiler av prostatektomi prøver fra prostatakreftpasienter ble generert. En kinase aktivitet signaturen ble hentet fra de 100 kinase peptidsubstrater med høyeste fosforylering nivåer, for xenografter og pasientenes tumorprøver. For xenografter ble signaturen representert ved gjennomsnittet av alle ADT-naive xenografter. For kliniske prøver, ble signaturen uttrykt av gjennomsnittet av de tre ADT-naive tumorprøver (tilfeller 1, 2 og 3 i tabell 1). Sammenligningen av de to resulterende signaturene avslørte 74 felles substrat phosphorylations (figur 3A og B), mens hver av dem omfattet 26 utelukkende fosforylerte substrater (figur 3C). Den 74% overlapp indikerer at xenograft modell som brukes i den aktuelle studien er en biologisk relevant modell av den kliniske situasjonen.
En ADT naive kinase aktivitet signaturen ble definert som de 100 kinase peptid substrater med høyest fosforylering nivåer. For prostatakarsinom xenografter ble signaturen representert ved gjennomsnittet av alle ADT-naive substratfosforylering nivåer. For pasienter med prostatakreft, ble en topp 100 signatur produsert ved å beregne gjennomsnittet av de tre ADT-naive (sak 1, 2 og 3, Tabell 1) svulst fosforylering nivåer. (A) Sytti-fire av de 100 substrater ble delt av xenograft og pasientenes tumor ADT naive signaturer. (B) fosforylert kinase peptidsubstrater deles av ADT-naive prostatakarsinom xenografter (n = 3) og ADT-naive svulster fra pasienter med prostatakreft (gjennomsnittlig saks 1, 2 og 3). Oppført er substrater «tilsvarende genet navn, med start- og sluttposisjonen for peptidsekvens innenfor proteinet i parentes. (C) utelukkende fosforylerte kinase peptidsubstrater (n = 26) i xenograft signatur (til venstre) og i pasientens tumor signatur (til høyre).
STAT1 og STAT5A substratfosforylering etter prostatektomi Prøver
etter å avdekke økt fosforylering av STAT1 og STAT5A underlag av ADL og CR xenografter sammenlignet med ADT-naive xenografter, tilsvarende substratfosforylering nivåer fra prostatektomi prøver ble undersøkt. Å tillate sammenligninger mellom ulike pasienter ble substratet phosphorylations ved hver av de tre ADT naive pasientens tumorprøve normalisert til de respektive phosphorylations av kontralaterale lapp normal vevsprøve. En pasient (sak 4, tabell 1) hadde fått langsiktig ADT før tidlige tegn på CR sykdom ble oppdaget (stigende serum PSA) og henvisning til radikal prostatektomi. Siden denne pasientens normale vev også ble androgen-fratatt, ble normalisering av substratfosforylering generert av svulsten prøven til at fra normal vevsprøve utelukket. Således, for denne pasienten, underlaget phosphorylations ved tumorprøve ble normalisert til gjennomsnittet av de normale vev substratet phosphorylations av de tre ADT-naive pasienter. Den STAT1 substratfosforylering var lav og lik for alle pasienter. Imidlertid, mens den STAT5A substratfosforylering av tumor sammenlignet med normale prøver i alle de ADT-naive pasienter var lav; log
2 ratio = 0,7 ± 1,2 (n = 3), det var vesentlig høyere i tidlig CR pasienten; log
2 ratio = 2,6 (n = 1) (Figur 4A).
(a) for androgen-deprivasjon terapi (ADT) -naïve prostatakreftpasienter, det logg
2 forholdstall mellom de substratfosforylering nivåene som genereres av prostatektomi tumorprøve versus den respektive kontralaterale lobe normalt vev prøve ble beregnet. For pasienten som fikk langvarig ADT før radikal prostatektomi, loggen
2 forholdet mellom substratfosforylering nivåer fra tumorprøve versus gjennomsnittlig substratfosforylering nivåer fra ADT-naive pasienter normale vevsprøver ble beregnet (siden dette pasientens normale vev ble også utsatt for ADT). (B) Western immunoblot analyse av prostatektomi tumorprøver «lysatene med et antistoff mot hypoksi-induserbar faktor-1α (HIF-1α), den viktigste protein kjent for å være aktivert og stabiliseres etter hypoksiske forhold, avslører økt HIF-1α uttrykk i lysat fra tidlig CR tumor (sak 4). Ingen HIF-1α uttrykk ble sett i lysatene fra ADT-naive svulster.
Hypoksi-indusert økning i STAT5A substratfosforylering av prostata carcinoma celler
Fra resultatene oppnådd i xenografter og prostatectomies , kombinert med erkjennelsen av potensielle rolle hypoksi i utviklingen av CR sykdom [5], ble det antatt at hypoksi kan være involvert i den endrede STAT5A kinase aktivitet. For å vurdere om hypoksisk tilstand var til stede i prostatektomi prøvene ble utført Western immunoblot analyse av HIF-1α på prostatektomi kreftlysatene. HIF-1α er master regulator av oksygen homeostase, som er kjent for å bli aktivert og stabilisert i henhold til hypoksiske betingelser. Figur 4B viser at ekspresjon av HIF-1α ble funnet i lysatet fra pasienten med tidlig CR sykdom, som reflektert ved økende PSA etter langvarig ADT (case 4), mens ingen HIF-1α ekspresjon ble observert i lysatene fra ADT -naïve svulster
for ytterligere å undersøke denne hypotesen, ble kinase aktivitet profiler generert fra normoksisk 22Rv1 prostata carcinoma celler, samt fra celler eksponert for moderat (1% O
2) og alvorlig ( 0,02% O
2) hypoksi i 24 timer. Den 22Rv1 cellelinje er androgen-responsive og opprinnelig stammer fra residiverende CWR22 xenograft [19], uttrykker både androgen reseptor og PSA, og dermed representerer en modell av avansert prostatakreft. Fosforyleringen nivåene av 22 kinase peptidsubstrater ble betydelig økt eller redusert etter hypoksisk cellelysatene (moderat eller alvorlig hypoksi) i forhold til normoksisk av cellelysatene. Disse inkluderte STAT5A underlaget, som presenterte en økende fosforylering nivå med økende hypoksi (figur 5A, blå søylene), selv om gjennomsnitts fosforylering nivået for alle de 22 vesentlig påvirket kinase peptidsubstrater var lav (figur 5A, grå søyler). Forskjellen i midlere fosforylering nivå ved moderat i forhold til alvorlige hypoxia var ikke signifikant. For STAT5A, loggen
2 forholdstall i forhold til normoksisk celler var 0,47 ± 0,27 (p 0,05) for de moderat hypoksiske celler og 0,63 ± 0,31 (p = 0,020) for de alvorlig hypoksiske celler. En liste over de 22 kinase peptidsubstrater betydelig påvirket av hypoksi er gitt i Figur 5B
(A) 22Rv1 celler ble utsatt for moderat (1% O
2) og alvorlig (. 0,02% O
2) hypoksi i 24 timer i en hypoksi kammer. Protein lysater fra tre replikater biologiske fra hver av de tre eksperimentelle grupper (normoxia, moderat hypoksi, hypoksi alvorlig) ble analysert for å generere kinase aktivitetsprofiler. Kinase aktivitet profilering av hypoksiske og normoksiske cellelysater oppdages økt STAT5A substratfosforylering med økende hypoksi (blå søyler), mens gjennomsnitts fosforylering nivået for alle 22 kinase peptidsubstrater med betydelige endringer var lav (grå søyler). * Økningen fra normoxia til alvorlig hypoksi var signifikant (p = 0,020). Forskjellen i midlere fosforylering nivå ved moderat i forhold til alvorlige hypoxia var ikke signifikant. (B) Andelen sank versus økt kinase aktivitet i hypoksisk versus normoksiske 22Rv1 cellelysatene. Oppført er genet navnene på de berørte kinase peptid underlag, med start- og sluttposisjonen for peptidsekvens innenfor proteinet i parentes. (C) Western-blot med anti-fosfo-STAT5A /B og anti-STAT5A ekspresjon i normoksiske (-) og sterkt hypoksisk ( 0,02% O
2, 24 h) (+) cellelysater fra PC3, DU145 og 22Rv1 celler. Anti-γ-tubulin tjente som lasting kontroll. (D) Western-blot med anti-HIF-1α, anti-fosfo STAT5A-/B og anti-STAT5A ekspresjon av lysater fra PC3, DU145 og 22Rv1 celler med (+) eller uten (-) 4 timer etter eksponering til 100 uM av den hypoksi-mimetiske middel koboltklorid (CoCl
2), en kjemisk induser av HIF-1α. Anti-γ-tubulin tjente som lasting kontroll.
En vestlig immunoblot tilsvar bekreftet økt uttrykk nivå av fosfor-STAT5A /B (Y694 /699) i alvorlig hypoksisk 22Rv1 celler, sammenlignet med normoksisk 22Rv1 celler (figur 5C). Ekspresjonen av det totale STAT5A proteinet ble også funnet å øke i henhold til hypoksi, men i mindre grad enn økningen i fosfo-STAT5A /B uttrykk. For å utelukke at funn av hypoksi-indusert økt STAT5A aktivitet var cellelinje bestemt vi analysert ytterligere to cellelinjer, de PC3 og DU145 prostatakreft cellelinjer, avslører lignende resultater som i 22Rv1 cellelinje (figur 5C).
for å belyse hvorvidt STAT5A aktivisering var direkte indusert av HIF-1α aktivisering vi behandlet cellene med CoCl
2, en kjemisk induser av HIF-1α. Som det fremgår av figur 5D, CoCl
2 indusert øket ekspresjon av både HIF-1α og fosfo-STAT5A /B i alle cellelinjer. Den STAT5A protein-ekspresjon ble økt i en cellelinje, og uendret i de to andre cellelinjer. Siden HIF-1α spesifikt induserte en økning i STAT5 fosforylering disse resultatene støtter at hypoksi er årsaken til økt STAT5 aktivitet, gjennom en HIF-1α-mediert mekanisme.
Diskusjoner
Den aktuelle studien identifisert økt fosforylering nivået av STAT5A peptid substrat av ADL og CR prostata karsinom xenografter, sammenlignet med ADT-naive xenografter.
