Abstract
mikro markører brukes for tap-av-heterozygositet, allelisk ubalanse og klonalitet analyser i kreft. Vanligvis er tumor-DNA sammenlignet med tilsvarende normal DNA. Imidlertid er normal DNA ikke alltid er tilgjengelig, og kan vise avvikende allel-forhold på grunn av kopiantall variasjoner i genomet. Videre kan hakke topper komplisere analysen. For å bruke mikro markører for diagnose av tilbakevendende blærekreft, rettet vi velge markører uten stutter topper og et konstant forhold mellom alleler, og dermed unngå behovet for en kontroll DNA-prøve. Vi undersøkte 49 mikro markører med tri- og tetranukleotid gjentar i regionene ofte tapt i blærekreft. Basert på analyse av 50 blod DNA de 12 beste resultater markører ble valgt med noen stutter topper og et konstant forhold mellom topper høyder. Per markør øvre og nedre kuttet av verdier for allel forhold ble bestemt. LOH av markørene ble observert i 59/104 tumor-DNA. Vi så bestemt følsomheten av markør panel for deteksjon av tilbakevendende blærekreft ved å analysere 102 urinprøver fra disse pasientene. Følsomhet var 63% når pasientene ble stratifisert for LOH i sine primære svulster. Vi viser at opp-front utvalg av mikrosatellittmarkører utsletter behovet for en tilsvarende blodprøven. For diagnostisering av blærekreft tilbakefall i urinen dette reduserer kostnadene betraktelig. Dessuten letter denne tilnærmingen retrospektiv analyse av arkivtumorprøver for allel ubalanse
Citation. Van Tilborg AAG, KOMPIER LC, Lurkin jeg, Poort R, El Bouazzaoui S, van der Keur K, et al. (2012) Valg av mikro Markører til blærekreft diagnose uten behovet for tilsvarende Blood. PLoS ONE 7 (8): e43345. doi: 10,1371 /journal.pone.0043345
Redaktør: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japan
mottatt: 02.04.2012; Godkjent: 19 juli 2012; Publisert: 22 august 2012
Copyright: © van Tilborg et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av EU sjuende rammeprogram FP7 /2007-2012, tilskuddsavtalen n ° 201663; Nederlandsk Kreftforeningen gir no. EMCR 2007-3863. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
mikroanalyse benytter korte, svært polymorfe gjentatte sekvenser i genomet. Antallet repetisjoner danner en bestemt mikro varierer ofte mellom mors og fars allel. Mikro brukes til å bestemme allelisk ubalanse (AI) eller tap-av-heterozygositet (LOH) på bestemte loci i tumor genomer, og kan brukes som en markør for tilstedeværelse av tumorceller. For dette formålet mikroanalyser sammenligne intensiteten av forsterkning produkter av faderlig og mors allel fra en tumorprøve mot prosenter fra et tilsvarende normal kontroll (for eksempel leukocytter). Når mikro markør er informativ (lengden av de to alleler avviker) mengden av produktet fra begge alleler vil være den samme. På en kapillær sekvens dette er vist som to topper på omtrent samme høyde. LOH eller AI av en kromosomal region i kreft er vanligvis avsluttet når forholdet mellom de allel toppene i tumor-DNA er mindre enn 0,5 til 0,7 eller over 1,5-2 når sammenlignet med kontrollen [1], [2], [3], [4].
Blærekreft (BC) er den femte vanligste kreftformen i den vestlige verden etter brystkreft, prostatakreft, tykktarms og lungekreft [5]. Mer enn 70% av primær BC manifest som lav karakter, ikke-muskel invasiv (PTA, PT1) svulster. Etter å ha fjernet disse svulstene etter transuretral reseksjon (TUR), er tilbakefallsraten høy (70%) og mange pasienter vil utvikle flere metachronous tilbakefall [6]. Progresjon fra en ikke-invasiv muskel (NMIBC) til en muskel invasiv kreft (MIBC) forekommer i 10-20% av tilfellene, spesielt hvis den opprinnelige tumor var av høy klasse [7], [8].
i dag er standard prosedyre for diagnostisering BC er cystoskopi. Cystoskopi er en invasiv diagnostisk metode som er ubehagelig for pasienten, som har til å gjennomgå slike kontroller hver 3-12 måneder i mange år etter reseksjon av den primære tumor. Vi anslår at mellom 1-2 millioner cystoskopier blir gjennomført per år i EU og USA for oppfølging av disse pasientene. Dessverre er det cytologisk undersøkelse av celler som er tilstede i latt urin alene ikke gir en sikker screening alternativ for systoskopi på grunn av sin lave følsomhet, spesielt for påvisning av lav grad av tumorer [9]. Tilsvarende dagens molekylære urinbaserte analyser som fluorescerende in situ hybridisering (FISH), NMP22 og BTA har sensitiviteter som er lavt for påvisning av det meste lav karakter og scene tilbakevendende BC [10], [11]. Som et resultat av dette har en rekke forskjellige molekylære analyser for DNA isolert fra celler som er tilstede i annulleres urinprøver er utviklet med det mål å forbedre følsomheten for påvisning og for å redusere hyppigheten av invasive cystoskopi undersøkelser. En av disse analysene innebærer påvisning av mutasjoner i
FGFR3
genet [12]. Mutasjoner i dette gen er meget hyppig i PTA blæretumorer (opp til 75% [13], [14]). Imidlertid er denne bestemmelse ikke er et alternativ for deteksjon av tumorer uten en mutasjon i dette genet, spesielt siden for pasienter med en
FGFR3
villtype primærtumor, hyppigheten av
FGFR3
mutasjoner i gjentagelse er mye lavere enn for pasienter med en
FGFR3
mutant primærtumor (19% og 81%, henholdsvis) [15].
Mange svulster displayet genomiske forandringer som genmutasjoner og numeriske avvik som påvirker kort genomisk regioner til hele kromosomer. Disse tumor-spesifikke genomiske forandringer kan påvises ved molekylære teknikker som FISH [16], [17], eller ved mikroanalyse (MA). Analyser oppdage disse endringene viser seg å være spesielt nyttig i identifisering av kreftpasienter via ikke-invasiv eller lite invasive metoder [18], [19], [20], [21]. I blærekreft for eksempel, er tap av deler eller total kromosom 9 ofte observert som de oppstår tidlig i utviklingen av svulsten [22]. Progresjon av sykdommen er vanligvis ledsaget av flere numeriske forandringer som involverer kromosom 8p, 10, og 17p [23], [24], [25]. Vi og andre har tidligere vist at påvisning av tilbakevendende blærekreft kan forbedres ved mikroanalyse av i celler oppnådd fra annulleres urinprøver [4], [26].
I løpet av dette arbeidet vi observert at PCR-produktene fra mikro med dinukleotidpolyfosfater gjentar ofte hatt flere (stutter) topper på grunn av dissosiasjon av DNA-trådene og avvikende nytt bandt. I tillegg har mange mikro markører hadde avvikende forhold mellom topphøyder i kontroll DNA, muligens på grunn av kopiantall variasjoner i genomet. Videre er det behov for å analysere blod kontroll-DNA gjort mikroanalyse (MA) dyrt [27]. For å løse disse problemene mer systematisk, har vi valgt tri- og tetranukleotid gjentar i genomiske regioner som vanligvis berørt i blærekreft og designet primere rundt disse gjentar for forsterkning [28]. Disse nye mikro markørene ble deretter testet for konstant topp høyde-forhold og teknisk ytelse (dvs. ingen stutter topper, rettferdig forsterkning) i en serie av blod DNA-prøver. De 12 beste resultater markører ble deretter analysert i urin DNA fra friske individer for å bestemme de avskårne verdier av forholdet mellom topphøyder for å oppnå en spesifisitet på 95%. Til slutt, vi validert markører i urin DNA fra pasienter diagnostisert med en tilbakevendende blære svulst.
Materialer og metoder
Samples
Blodprøver ble samlet inn fra 50 pasienter med blærekreft . Urinprøver ble samlet inn fra 106 individer uten historie neoplastisk sykdom. Disse tumor-negative prøver ble hentet i løpet av en screeningundersøkelse i eldre menn (over 50 år) uten tidligere symptomer på blærekreft [29]. DNA fra 104 primære svulster var tilgjengelig for LOH analyse. Alle tumorer var ikke-muskel-invasiv (89% Ta, 11% T1). Alle svulster var karakteren 1 eller 2. Urinprøver fra pasienter som skal TUR ble samlet før reseksjon av en histologisk påvist residiv av tumor fra 102 pasienter. Informert skriftlig samtykke ble innhentet fra alle pasienter, og forskningsprotokoller ble godkjent av institusjonelle gjennomgang styrene eller etiske komiteer i de to involverte landene (de Region Midtjylland komiteer på Biomedisinsk forskningsetiske Danmark og The Medical Etisk komité i Erasmus MC (METC) , Nederland). Clinicopathological data for disse prøvene er gitt i tabell S1.
DNA-ekstraksjon og LOH analyse
Etter samling, urinen ble sjekket for mengden av leukocytter, erytrocytter og nitritt med peilepinnen (Siemens Multistix ® 10 SG). Celler ble pelletert ved sentrifugering ved 3000 rpm i 10 minutter ved 4 ° C. Cellepelletene ble vasket to ganger med 10 ml PBS, resuspendert i 1 ml PBS, overført til et Eppendorf-ampulle, og samlet ved sentrifugering i 5 minutter ved 6000 rpm. Supernatanten ble kastet og cellepelleten ble lagret ved -20 ° C inntil DNA-isolasjon. DNA ble ekstrahert fra blod, svulstvev (formalinfiksert parafin innebygd (FFPE)) og urin og renset med passende sett (Qiagen, Hilden, Tyskland) etter produsentens anvisninger. Konsentrasjoner av DNA ble målt med en Quant-iT PICOGREEN® dsDNA Assay Kit (molekylære prober, Leiden, Nederland). PCR av forskjellige mikro markører ble utført med separate primerpar hvorav ett oligonukleotid ble merket ved 5′-enden med fluorescerende fargestoffer 6-FAM (Invitrogen). Amplifikasjon av spesifikke DNA ble utført i et reaksjonsvolum på 15 ul, inkludert 0,2 mM dNTPs, 2,5 mM MgCl2, og 0,5 U AmpliTaq. Sykling ble utført med en Biometra thermocycler ved hjelp av følgende temperaturbetingelser: 95 ° C i 5 minutter, 28 sykluser ved 95 ° C i 45 s, 55 ° C i 45 s, og 72 ° C i 45 s etterfulgt av en endelig forlengelse trinn på 10 minutter ved 72 ° C. PCR-produktene ble deretter denaturert i 1 min ved 95 ° C i hidi formamid (Applied Biosystems) og separert på en ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer utstyrt med en 36 cm kapillaroppstillingen lastet med POP-7 polymer. 500-Liz ble anvendt som intern standard størrelse (Applied Biosystems). Analyse av prøvene ble gjennomført med GeneMarker programvare versjon 1.7 fra SoftGenetics (State College, PA).
Statistisk analyse
Statistiske Package for samfunnsvitenskap 18 (SPSS, Inc.) ble brukt for dataanalyse. Sensitivitet, spesifisitet og prediktive verdier ble bestemt for hver markør og for alle markører. Diagnostisk nøyaktighet for modellen med metylering markører som bestemmes av AUC (areal under kurven). Resultatene ble ansett som statistisk signifikant på p. 0,05
Resultater
Valg av mikro
Vårt prosjekt besto av ulike faser (figur 1). Vi har tidligere brukt en gruppe på 20 mikro markører for deteksjon av tilbakevendende blærekreft i annullert urinen til pasienter under overvåking for mulige tilbakevendende svulster [4], [18], [30], [31], [32]. Men med flere av disse markørene vurdere allel forholdet var vanskelig på grunn av stamme topper. Også disse markørene ikke nøyaktig dekker de mest interessante områdene i LOH i blæren svulster. I tillegg, i mange pasienter allelet forholdet i kontroll-DNA varieres muligens på grunn av genomiske kopi tallvariasjoner som vist i figur 2A. Basert på denne erfaringen bestemte vi oss for å velge en ny panel av mikro markører med en relativt konstant forhold mellom alleler og dermed utslette behovet for en kontroll blod DNA-prøve. For å redusere sjansen for stamme topp formasjon, valgte vi 49 tri- og tetranukleotid gjenta inneholder mikrosatellitter fra UCSC genom nettleser (https://genome.ucsc.edu), og Généthon panel (http: //cedar.genetics. soton.ac.uk/pub) i områder av kromosomer 8, 9, 10, 11 og 17 som viser LOH i blære kreft [28]. De mikro markører måtte ha et minimum av heterozygositet på 65% og et fragment lengde mellom 100-300 bp for å redusere forsterknings vanskelighetene med tilskåret DNA.
På Y-aksen, forholdet mellom to alleler er gitt. På X-aksen, blir de forskjellige mikrosatellittmarkører oppført. A. boksplott viser at noen tidligere brukte markører har en stor variasjon i sine allel grad basert på en analyse av blod DNA-prøver fra 50 individer. B. Behavior av de 12 utvalgte markører, noe som indikerer at de har svært liten variasjon i sine allel forholdet når testet på normal blod og urin fra friske individer. C. I primærtumor DNA er allelet forholdet mye mer variable på grunn av LOH /AI.
Teknisk reproduserbarhet og kuttet av verdier for hver markør
Markørene ble deretter testet på 50 blodprøver og 12 mikro markører med den høyeste andelen av heterozygositet og en topp forhold mellom alleler som var nær en ble valgt for videre studier (tabell 1, figur 2B). Informasjon om de andre 37 markører er gitt i Tabell S2. Figur 3 viser electropherograms av markørene. Vi bestemte de beste innstillingene for reproduserbarhet ved å variere innspill DNA konsentrasjon og antall sykluser. Basert på dette valgte vi å bruke 5-10 ng av innspill DNA i 28 PCR-sykluser for senere eksperimenter. For å bestemme kuttet verdiene slik at hver markør ville bli 95% bestemt i en diagnostisk urinprøve, analysert vi dem i to eksemplarer på urin DNA fra 106 ikke-kreft kontroller på 50 år og eldre. De 12 markører med sine øvre og nedre kuttet av verdiene er oppført i tabell 2. Tabell 2 viser også at standardavvikene er under 10%.
På Y-aksen, toppintensiteten er gitt. På X-aksen, er det fragmentstørrelse gitt i basepar. På venstre side, er resultatene fra normalt vev vist. Merk at disse markørene har få eller ingen topper og stutter en forholdsvis konstant forhold (nær 1) mellom høydene av de to allelene. På høyre side, er resultatene fra representative tumorprøver med LOH vist.
Utførelse av mikro analysen i tumorer
Deretter markørene ble testet på DNA fra de primære blæren svulster 104 pasienter. Ninety-to svulster var PTA, 11 var PT1, og av en svulst uten stadium informasjon var tilgjengelig. Tjuefire svulster var grad 1, 79 klasse 2, mens klasse informasjonen manglet i ett tilfelle. LOH eller allelisk ubalanse ble definert når forholdet mellom toppene var høyere enn den øvre kant eller lavere enn den nedre grense som er angitt for hver markør i tabell 2. LOH for en eller flere markører ble funnet i 59 tumorer (57%), mens 45 tumorer har ikke LOH for noen av markørene testet. De hyppigst tapt markører var alle på kromosom 9, D9S299, D9S252, og D9S752 (LOH i 29-37% av alle prøver) (tabell 3). Enhver LOH ble funnet i 53/92 (58%) PTA, 6/11 (55%) PT1 og i 12/24 (50%) og G1 47/79 (60%) G2 tumorer. Allelet prosenter i tumor-DNA var mye mer variable enn i normalt blod eller urin-DNA, på grunn av LOH /AI (figur 2C).
Bestemmelse av sensitiviteten av markørene for å detektere tilbakevendende i urine- avledet DNA
Deretter bestemmes vi følsomheten av markører for påvisning av tilbakevendende svulster i de samme pasientene hvorav vi analysert den primære svulsten. Totalt 102 urinprøver var tilgjengelig, innhentes før reseksjon av en tilbakevendende svulst i disse pasientene. Mikroanalyser ble utført i duplikat. LOH ble antatt da allelet topp forhold på begge testene var utenfor kuttet av verdiene som er vist i tabell 2. Markers D9S752, D9S252, D9S304, D9S299 og G10693 vises LOH i ca 20% av prøvene (tabell 4). Av de 102 prøvene, fikk 43 prøvene ikke viser tap for noen av de testede markører. Hvis vi antar at falske positive tester er ikke mulig siden alle pasientene hadde et tilbakefall, følsomheten av de 12 merkene sammen er 58%. Følsomhet i henhold til klasse av primærtumor er gitt i File S1. Spesifisiteten til testen er per definisjon 100% fordi alle urinprøver ble forbundet med en tilbakevendende tumor. Hvis vi valgt urinprøver fra pasienter som har primærtumor hadde LOH i minst en markør, følsomhet for deteksjon av tilbakefall i urinen DNA økt til 63%. Når det kombineres med cytologi data, økte denne følsomheten til 80% (Fil S2).
Diskusjoner
I denne studien beskriver vi en tilnærming for å velge mikro markører for å bestemme kopiantall og tumor -associated LOH som har en utmerket teknisk ytelse. Tilnærmingen ble tidligere brukt av Frigerio et al., Som implementert markør-spesifikke terskler ved å vurdere normale DNA fra blod og vev kontroll [1]. Imidlertid skiller vår tilnærming ved at vi forhåndsvalgt våre markører for konstant allel forholdstall derved forbedrer nøyaktigheten og ved det faktum at vi valgt tri- og tetranukleotid gjentar som har ingen eller få stutter topper. Ved forhånd vurdere nedre og øvre cut off verdier basert på en analyse av kontroll DNA, behovet sammenligne pasientprøver med tilsvarende blod er derfor unngås. Dette valget fremgangsmåte kan anvendes på en hvilken som helst tumor type. Denne tilnærmingen muliggjør også retrospektiv analyse av arkivtumorprøver for allel ubalanse.
Vi undersøkte mengden av input DNA og det optimale antall PCR-sykluser. Mengden av inngangs DNA er viktig på grunn av for lave konsentrasjoner kan medføre preferensiell forsterkningen av en av de to alleler som fører til falske positive Lohs [33]. Mikrosatellittmarkører er ideelle for å bestemme tap eller forsterkning av genomiske regioner på FFPE-avledet DNA fordi begge allelene til en markør vil bli påvirket på samme måte av kvaliteten av DNA (lengde), forutsatt at forskjellen i lengde mellom alleler ikke er for stor. Mikroanalyse er billig med kostnader i størrelsesorden ca 1 euro per analyse. For et panel av 10 markører, kostnader, inkludert DNA, vil beløpe seg til mindre enn 15 euro. En ulempe er at mikro er ikke egnet for multipleksing. Vår erfaring er dette alltid fører til ineffektiv forsterkning av noen av markørene og dette resulterer i større standardavvik i duplikate eksperimenter.
Tap på kromosomene 8, 9, 10, 11 og 17 er vanlig i blærekreft og kan påvises ved mikroanalyse. Denne undersøkelsen bestemmer potensialet av blærekreft påvisning av mikro analyse på et sett av urinprøver tatt før transuretral reseksjon av den ledsagende tumor (pre-TUR urin). Etableringen av markør-spesifikke terskelverdier basert på målinger av allel-forhold i urinprøver fra 106 friske individer har tillatt oss å definere det spesielle ved fremgangsmåten for den etterfølgende undersøkelsen. Siden de individuelt bestemt terskelverdiene sikret optimal spesifisitet for hver av markørene ble analysert, tolket vi et LOH ved en enkelt locus allerede som indikativ for tilstedeværelse av tumorceller. Bruk av denne regelen, vi oppnådd for pre-TUR-urinprøver samlet en sensitivitet på 58% for påvisning av tilbakevendende tumorer, og 63% når pasientene ble lagdelt for LOH i sin primære tumor. Denne følsomhet er sammenlignbar med den følsomhet som vi tidligere har funnet med det første sett av mikrosatellittmarkører selv om den nye panel av markører er spesielt utformet for å dekke for de genomiske regioner som viser LOH i ikke-invasive muskel blæretumorer (NMIBC). Diagnostisk treffsikkerhet for modellen med alle 12 markører var 73% som bestemt ved AUC (areal under kurve). Denne nøyaktigheten var fortsatt 73% når bare seks markører ble testet (D9S252, D9S752, D9S304, D8S1125, D8S1130, G10693). Med dette valget, var vi i stand til å identifisere 95% (56 av 59) av alle prøver som viser LOH testing for alle 12 markører. Den største fordelen med å bruke et mindre utvalg av mikrosatellittmarkører er, ved siden av en reduksjon i kostnader, reduksjon av mengden av inngangs DNA er nødvendig, noe som gjør denne analysen også er tilgjengelig for de prøver hvor bare en meget begrenset mengde av vev er tilgjengelig.
i andre studier brukte vi mutasjon analyse av
FGFR3
genet for å diagnostisere vendende svulster [34] [35].
FGFR3
mutasjoner er funnet i 60-70% av NMIBC og dermed gi et ideelt verktøy for overvåking av pasienter siden mutasjonsanalyse er 100% bestemt. Følsomhet, men avhenger av tilstedeværelsen av tilstrekkelige tumorceller i urinen, og dette er også en påminnelse for mikro analysen. Følsomhet øker når flere urinprøver er analysert. Med en følsomhet på 50% analysert 2 prøver ville øke følsomheten for 75% etc. En kombinasjon av mikroanalyse med markører som presenteres her og
FGFR3
test er gjenstand for en langsgående undersøkelse av urinprøver fra 800 147 pasienter (Zuiverloon et al., under forberedelse).
Hjelpemiddel Informasjon
fil S1.
LOH i pre-TUR urin i henhold til Grad av primærtumor
doi:. 10,1371 /journal.pone.0043345.s001 plakater (docx)
File S2. Host Sammenligning av LOH og cytologi på forhånds TUR urinprøver
doi:. 10,1371 /journal.pone.0043345.s002 plakater (docx)
Tabell S1. .
Pasientdata
doi: 10,1371 /journal.pone.0043345.s003 plakater (XLSX)
Tabell S2.
Detaljer markører ikke inkludert i studien
doi:. 10,1371 /journal.pone.0043345.s004 plakater (XLSX)
