Abstract
homolog rekombinasjon (HR) er nødvendig for restart av kollapset DNA replikasjon gafler og feilfritt reparasjon av DNA dobbel-tråd pauser (DSB). Imidlertid kan ikke planlagt eller hyperaktive HR føre til genomisk ustabilitet og fremme kreftutvikling. De cellulære faktorer som begrenser HR-prosesser i pattedyrceller er bare begynnelsen for å bli belyst. Svulsten suppressor p53 har vært innblandet i undertrykkelsen av HR selv om det har vært uklart hvorfor p53, som vokter av genomet, ville svekke en feilfri reparasjonsprosessen. Her viser vi for første gang at p53 nedregulerer foci dannelsen av RAD51 rekombinase som reaksjon på stress i replikativ H1299 lungekreftceller på en måte som er uavhengig av dens rolle som en transkripsjonsfaktor. Vi finner at denne nedregulering av HR er ikke bare helt avhengig av bindingssetet av p53 med replikering protein A, men også ATR /ATM serin 15 fosforylering nettstedet. Genetiske analyser tyder på at ATR men ikke ATM kinase modulerer p53 funksjon i HR. Undertrykkelsen av HR av p53 kan omgås under eksperimentelle forhold som forårsaker DSB enten direkte eller indirekte, i tråd med p53 rolle som vokter av genomet. Som et resultat, ikke-transaktivering inaktivt p53 ikke gå på akkord med motstanden av H1299-celler til interstrand tverrbindingsmidlet mitomycin C. Alt i alt har våre data understøtter en modell hvor p53 spiller en anti-recombinogenic rolle i ATR-avhengige pattedyr replikasjon sjekkpunktet, men gjør ikke svekke en celle evne til å bruke HR for fjerning av DSB indusert av cytostatika
Citation. Sirbu BM, Lachmayer SJ, Wülfing V, Marten LM, Clarkson KE, Lee LW, et al. (2011) ATR-p53 Begrenser homolog rekombinasjon i Response til replicative Stress men begrenser ikke DNA Interstrand Crosslink Repair i lungekreft celler. PLoS ONE 6 (8): e23053. doi: 10,1371 /journal.pone.0023053
Redaktør: Janine Santos, medisinske og odontologiske av New Jersey, USA
mottatt: 6 mai 2011; Godkjent: 05.07.2011; Publisert: 12. august 2011
Copyright: © 2011 Sirbu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av NCI tilskudd R01 CA58985 (SNP) og R01 GM076388 (LZ), NCI Dana-Farber /Harvard Cancer Center SPORE i Lung Cancer P50 CA090578 (HW, LZ), Department of Defense W81XWH-06-1-0309 (HW ), Federal Andel av programmet inntekt ved Massachusetts General Hospital på C06 CA059267, Proton Therapy Research and Treatment Center (HW), og Deutsche Krebshilfe (tysk Cancer Aid) 10-1843-Da (JDD). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Genetiske utvekslinger mediert av homologe DNA-sekvenser som må være nøye regulert for å opprettholde stabilitet genomiske [1]. En aktiv homolog rekombinasjon (HR) pathway er nødvendig for reparasjon og restart av skjulte DNA replikering gafler [2]. Celler med defekter i HR er svekket i sin evne til å fjerne DNA interstrand tverrbindinger (ICL) som produseres for eksempel ved mitomycin C (MMC). DNA dobbel-tråd pauser (DSB) som forekommer i S-fase post-replikasjon eller i G2 er reparert av HR i en typisk feilfritt måte fordi homolog DNA sekvensen på søsterkromatidutveksling kan tjene som en nøyaktig mal for reparasjon. I kontrast, spontane DNA-utveksling mellom homologe sekvenser i mitotisk voksende celler må være begrenset og HR-aktiviteter på fastlåste replikering gafler kan ikke alltid være ønskelig [1], [3], [4]. Den anti-recombinogenic faktorer som begrenser HR i pattedyrceller er bare begynnelsen for å bli belyst.
p53 tumor suppressor spiller en sentral rolle i opprettholdelsen av genomisk stabilitet og undertrykkelse av cellulær transformasjon [1], [5] . Som en konsekvens, er villtype p53-funksjon forstyrres av genetiske mutasjoner eller andre mekanismer i de fleste, om ikke alle, humane cancere [5]. p53 har dukket opp som en multifunksjonell regulator, som er i midten av flere veier som er involvert i apoptose, cellesyklus kontroll, og DNA-reparasjon. Mange av funksjonene til p53 er mediert av transkripsjonen aktivering av nedstrøms målgener [6]. Vi og andre har etablert et ekstra transaktivering-uavhengig rolle av p53 i undertrykkelse av HR-prosesser på tvers av en rekke cellesystemer og assays [7], [8], [9], [10], [11], [12] , [1. 3]. For eksempel har flere p53 mutasjoner som L22Q /W23S (p53QS), A138V, eller V143A, som svekker p53 evne til transactivate målgener inkludert p21, ikke kompromiss p53 evne til å nedregulere HR [10], [14]. p53 ser ut til å påvirke HR gjennom ulike direkte protein- og DNA-interaksjoner [8], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21], [22], [23 ]. En direkte interaksjon med den enkelt-trådet (ss) DNA-bindende Replication Protein A (RPA) ser ut til å hemme HR på et tidlig trinn, og ytterligere interaksjoner med BRCA2 og RAD51 kan tjene det samme formål [9], [10], [ ,,,0],24]. Nedregulering av HR er avhengig av intakte kjerne og tetramerization domener av p53 [7], [8], [12], mens den C-terminale ende vises unnværlig [12], [13]. Oppstrøms faktorer som regulerer p53-mediert HR undertrykkelse fortsatt i stor grad ukjent [25].
Flere observasjoner lenke p53 direkte til DNA replikasjon. p53 ko-lokaliserer med områder for replikasjon [26], [27], er uttrykt i parallell til DNA-syntese når cellene inn igjen i cellesyklus [28], og vandrer inn i kjernen i S-fase [29], [30] . Replication av skadet DNA er blokkert av p53
in vitro product: [31]. Etter hemming av replika forlengelse av hydroksyurea (HU), akkumulerer transcriptionally inaktive p53 i S-fase [32]. I samsvar med disse dataene, nedregulerer p53 HR hvis replikering forlengelse blokkert [11], [33]. Hva har vært ukjent er om p53 vill-type trans aktivitet er nødvendig for sin undertrykkende rolle i replika-assosiert HR.
P53 fosforyleres direkte eller indirekte av ATM (ataxia telangiectasia mutert) og ATR (ATM og Rad3 -relaterte) kinaser [34], [35], men har ikke blitt etablert de funksjonelle konsekvensene av disse endringene med hensyn til HR regulering. ATM reagerer først og fremst til DSB sin og fosforylerer et nettverk av substrater [36]. ATM påvirker både HR og utsatt for feil og feilfritt non-homolog ende begynte [37], [38], [39]. ATR kinase spiller en sentral rolle i respons til replikasjons stress, og fosforylering av ATR underlag kollektivt hemmer replikasjon og vedlikeholder replikering gafler, og dermed hindre genomisk ustabilitet [40], [41]. Viktigere er HR brukes til å re-starte replikasjon, men kan også forårsake upassende Strand-exchange hendelser på fastlåste gafler hvis ikke regulert ordentlig [40], [42]. Sammenlignet med gjær, er anti-recombinogenic funksjoner av replikasjonskontrollpost i pattedyrceller dårlig forstått, [40], [42].
Her har vi viser for første gang at transaktivering-manglende p53 nedregulerer HR i respons til replicative stress. Vi slå fast at HR undertrykkelse av p53 skjer innen kun timer replikative stress og er avhengig av både den RPA-bindingssetet og ATR-fosforyleringssetet serin 15, således plassere p53 i pattedyr replikering sjekkpunkt. I motsetning til p53 rolle i replikasjonsstressrespons, vises undertrykkelse av homologi-mediert reparasjon av direkte eller indirekte indusert DSB avslappet, i samsvar med p53 rolle som vokter av genomet.
Resultater
Differensial regulering av HR ved transaktivering synte p53
Det har tidligere vært vist at p53 undertrykker HR etter induksjon av replikative spenning [11], [33]. Det var imidlertid ikke kjent hvorvidt p53 transaktivering største aktivitet er nødvendig for denne funksjon. For å løse dette spørsmålet, benyttet vi p53-null-celler som stabilt transfektert med en tidligere preget transsynte p53 mutant, p53QS [10]. Vi induserte dannelsen av subnuclear RAD51 foci ved behandling av celler med inhibitorer for replikasjon forlengelse, tymidin og HU (figur 1A, og data ikke vist). Som svar på enten stoffet, var det en statistisk signifikant undertrykkelse av RAD51 foci-dannelse i p53QS-uttrykkende celler, sammenlignet med p53-null-kontroller (figur 1BC, fig S1A). Som en kontroll, størrelsen av denne effekten var lik den HR-undertrykkende evne til endogent villtype p53, selv om dette eksperimentet ble utført i en annen cellelinje, A549 (fig S1B). I motsetning til dette, viser figur 1D at p53QS ikke modulerer RAD51 foci induksjon i celler eksponert for ioniserende stråling (IR), som produserer DSB gjennom cellesyklus, med søsterkromatidutveksling DSB som forekommer post-replikasjon og i G2 repareres av HR.
(A) Representative bilder av subnuclear RAD51 foci-dannelse i H1299-celler som stabilt uttrykker p53QS eller p53-null-celler som ble behandlet med 5 mM thymidin (TdR) i 24 timer. (B) Virkning av p53 status (null versus QS) på RAD51 foci-dannelse i H1299 celler behandlet med 5 mM TdR i 24 timer. Barer representerer mener med standard feil basert på 3 uavhengige repetisjoner. (C) Virkning av p53 status på RAD51 foci-dannelse i H1299 celler behandlet med 1 mM hydroksyurea (HU) i 24 timer. Barer representerer mener med standard feil basert på 5 uavhengige repetisjoner. (D) Effekt av p53 status på RAD51 foci formasjon i H1299 celler 6 eller 16 timer (h) etter behandling med 2 Gy ioniserende stråling (IR). Barer representerer mener med standard feil basert på 2-5 uavhengige repetisjoner. Alle y-aksen indikerer prosent av behandlede celler med minst 10 RAD51 foki pr kjernen etter trekke prosentandelen av ubehandlede celler med bakgrunnsnivåer av RAD51 foci. P-verdier er basert på t-test (to-halet).
For å modellere DSB reparasjon på underlag som ligner justert søsterkromatider, vi endret en tidligere brukt rekombinasjon analyse som gjør celler resistente mot mykofenolsyre etter vellykket HR. Bakterie
GPT
genet i rekombinasjon underlaget pDT219 ble inaktivert ved innsetting av en I-SCEI gjenkjenningssete i KpnI området (figur 2A). Tilpasning en tidligere preget murine modell for å studere transuavhengige egenskaper p53 [13], uttrykte vi transsynte p53-A135V i mus embryonale fibroblaster (MEFs) som bærer pDT219 underlaget som havner en gjenkjenningssete for den sjeldne gående site regissert I-SCEI meganuclease (data ikke vist). Vi har tidligere vist at denne mutant p53 er i stand til å undertrykke spontan HR hendelser, analogt med p53QS i humane celler [10], [13]. Vi først vurdert effekten av denne mutant for å undertrykke DSB-indusert HR ved hjelp av den homologe donorsekvensen pΔ2, som er ko-transfektert en I-SCEI meganuclease ekspresjonsvektor. I dette system blir homologi-mediert reparasjon mediert ved strekninger med uavbrutt homologi på 202 bp og 2333 bp oppstrøms og nedstrøms av I-SCEI område, henholdsvis. Vi oppdaget ikke en statistisk signifikant forskjell i DSB-indusert HR frekvenser mellom celler med og uten p53-A135V (figur 2B). Det var ingen forskjell i transfeksjonseffektiviteter mellom de forskjellige kloner (data ikke vist). Deretter modifiserte vi donor plasmid for å redusere lengden på delt sekvens homologi med bare 188-250 bp (pKEB1). Med denne modifikasjon, ble den undertrykkende virkning av p53 statistisk signifikant økt til 10 ganger (p 0,01). Tilsvarende, i en vanlig brukt GFP-baserte rekombinasjon substrat, PDR-GFP, hvori HR er mediert av ca. 400 bp av delte uavbrutt sekvenshomologi flankerer I-SCEI stedet, transaktivering svekket human eller murin p53 undertrykte DSB-indusert HR etter flere ganger (fig S2).
(A) Plasmid substrat pDT219 bærer en kopi av bakterie gpt-gen inaktivert ved innskudd av en i-SCEI gjenkjenningssete inn i det unike Kpnl-stedet av pSV2-gpt. HR hendelsene ble indusert i 10,1 mus embryo fibroblaster bærer pDT219 av co-transfeksjon av en I-SCEI uttrykk vektor og en homolog donor. pΔ2 er preget av 202 bp og 2333 bp av uavbrutt sekvens homologi delt med pDT217, mens pKEB1 bare inneholder 188 bp og 250 bp av homologi flankerer pause nettstedet. Etter samtidig transfeksjon av pKEB1 eller pΔ2 sammen med en I-SCEI uttrykk vektor, ble rekombinanter scoret i en koloni formasjon analysen. (B) I-SCEI-indusert HR frekvenser som oppnås med kromosomalt integrerte pDT219 er plottet mot p53 status, (-) indikerer p53-null, (+) som indikerer den av transaktivering-manglende p53-A135V mutant som er funksjonelt analoge med p53QS. Barer representerer geometrisk gjennomsnitt med SEM av 3-6 uavhengige eksperimenter. Den relative undertrykkelse av HR i nærvær av p53-A135V sammenlignet med p53-null-celler er angitt for hver av de to giver plasmider. Den relative undertrykkelse av HR ble sammenlignet ved bruk av uparet t-test (to-halet).
Til sammen tyder disse data på at transaktivering-svekket p53 nedregulerer HR som reaksjon på replikative stress, men påvirker ikke homologi -mediert reparasjon av DSB sin hvis lengden av felles homologi stiger 250-400 bp som ville være typisk for utveksling mellom søsterkromatider. Den observerte undertrykkelse av DSB-indusert HR i nærvær av korte homologies kan være relatert til p53 rolle i regulering av replikering-forbundet HRR og ble ikke fulgt opp videre.
HR undertrykkelse krever serin 15 stedet p53
Som svar på replikasjonsgaffelen steiling, er p53 fosforylert på serin 15 (figur S3A, B) [34], [43]. Men de funksjonelle konsekvenser av denne modifikasjon var ukjente. Vi skapte en fosfor-mutant av p53QS ved å introdusere en serin 15 til alaninmutasjon (p53QS-S15A) (figur 3A). Vi har også generert en RPA-bindende mutant av p53 (p53QM) ved i tillegg å muterende aminosyrer 53 og 54, som tidligere ble vist å være viktig for HR undertrykkelse [10]. Når stabilt uttrykt i p53-null-celler (figur S4), ble alle disse mutanter i forbindelse med tilsvarende cellesyklus-profiler som respons på behandling tymidin (figur 3B). Som forutsagt, p53QM var ute av stand til å undertrykke RAD51 foci-dannelse i tymidin-behandlede celler, og dette ble observert i flere subkloner (figur 3C, og data ikke vist). Påfallende, blokkerer serin 15 fosforylering også helt avskaffet evne p53QS å nedregulere RAD51 foci.
(A) Illustrasjon av N-terminale p53 mutasjoner introdusert av seterettet mutagenese. Mutant konstruksjonene ble stabilt uttrykt fra en vanlig kromosomal integrering nettstedet i H1299 celler (se Materialer og metoder). (B) Cell cycle fordelingene for H1299 kloner som stabilt uttrykker et p53 N-terminale mutanten. TdR, 5 mM tymidin i 24 timer. (C) Virkning av p53 status på tymidin-indusert RAD51 foci formasjon, analogt med forsøkene er vist i figur 1. p-verdi, på grunn av t-test (to-halet) å sammenligne p53QS til p53-null-celler.
for å vurdere hvor tidlig i respons til replicative stress S15 stedet av p53 er nødvendig, vi studerte kinetikken av foci formasjon. Figur 4 viser at RAD51 foci formasjonen var allerede svekket innen 6 timer tymidin behandling i p53-null og p53QS-S15A uttrykker celler. I samsvar med denne observasjonen, ble S15 fosforylering i p53QS uttrykker celler observert innen 6 timer etter behandling (figur S3C). Videre p53QS trykkes den lokale akkumulering av RPA i 6 timer, i samsvar med tidligere data på p53 evne til å inhibere RPA binding til enkelt-trådet DNA, som er et nødvendig trinn for initiering av HR (figur S5).
tidsforløpet av indusert RAD51 foci i tymidin behandlet H1299 kloner ble målt analogt forsøkene er vist i figur 1.
Avhengighet av p53-mediert HR undertrykkelse på ATR
S15 området av p53 er modifisert ved ATM og ATR-kinaser [34], [44], [45], og begge kinaser har blitt vist å fremme HR i celler med nedsatt eller går tapt vill-type p53-funksjon [39], [46], [47]. Som forventet, ved behandling med koffein, som hemmer ATR så vel som ATM, evnen til cellene til å danne RAD51 foci i respons til tymidin ble sterkt redusert (figur 5A). Påfallende, ble evnen til p53QS å redusere RAD51 dannelse i forhold til p53-null eller p53QS-S15A celler avskaffet. For å skille mellom funksjonen til ATM versus ATR, behandlet vi cellene med ATM inhibitor KU55933. I denne innstillingen ble HR undertrykkende effekt av p53QS bevart, noe som indikerer en avhengighet av ATR snarere enn ATM. For å bekrefte dette funnet, behandlet vi cellene med siRNA rettet mot ATR som ingen spesifikk ATR inhibitor er tilgjengelig. Tilstrekkelig ATR protein uttømming ble oppnådd følgende dobbel siRNA transfeksjon, og cellene beholdt normal vekst i løpet av 48 timers varighet av eksperimentet (figur 5B, og data ikke vist). Som observert tidligere, var det en p53-uavhengig reduksjon av HR i ATR siRNA behandlede celler: prosentandelen av RAD51 foci positive p53-null-celler ble redusert med 16% sammenlignet med celler transfektert med kontroll siRNA, dvs. fra 40% til 24% (Figur 4C). Sammenlignet med kontroll siRNA transfekterte celler, den relative p53-mediert undertrykkelse av HR i ATR siRNA transfekterte celler var mindre uttalt men ikke fullstendig opphevet som er i overensstemmelse med rest p53QS funksjon. Til sammen tyder disse data på at ATR regulerer HR via p53-avhengig og-Uavhengig mekanismer.
(A) H1299 kloner ble behandlet med tymidin (5 mM i 24 timer) med eller uten samtidig koffein (5 uM) eller KU55933 (20 mm) behandling. (B) Western blot illustrerer siRNA mediert uttømming av ATR i H1299 celler. sc, egge siRNA kontroll. (C) Effekt av p53QS status og ATR utarming på RAD51 foci induksjon, målt analogt Figur 1.
p53 ikke går ut over RAD51 respons til DSB etter tymidin eller MMC
HR benyttes til replikering gaffel reparasjon og ny start [2], en prosess som ikke skal imøtegått av p53 som det er nødvendig for vedlikehold av genomisk stabilitet og celleoverlevelse. Ved frigjøring fra en 24-timers inkubering med tymidin (som vist i figur 4), ble det observert en økning i γ-H2AX foci, i samsvar med forekomsten av DSB ved skjulte replikasjonsgafler (figur 6A). Det var en lignende relativ økning i RAD51 foci som var uavhengig av p53 status og i samsvar med HR-mediert gaffel omstart (figur 6B). Derfor, i denne innstillingen, p53QS ikke utøve en undertrykkende effekt på RAD51 foci formasjon.
(A) Farging for γ-H2AX som en markør av DSB formasjon, illustrerer økningen i DSB i begge H1299 kloner innen 4 timer etter løslatelse fra tymidin (5 mm i 24 timer). (B) Tidsforløp av RAD51 foci induksjon, analogt med figur 4, etter fjerning av tymidin. For å illustrere den tilsvarende økning i RAD51 foci induksjon uavhengig av p53 status, ble prosentandelen av celler med foci normalisert til 0 ved 0 timer (h), dvs. ved tidspunktet for fjerning av tymidin. (C) Effekt av p53 status på RAD51 foci indusert 4 timer etter behandling med mitomycin C (MMC) (0,5 mikrogram /ml for en time). Y-aksen indikerer prosent av celler med minst 10 induserte RAD51 foki pr kjerne. Lignende resultater ble sett etter 24 timer (data ikke vist). (D) Effekt av p53 status på γ-H2AX foci formasjon 24 timer etter behandling med MMC. Y-aksen indikerer prosent av celler med minst 20 induserte foci pr kjerne. (E) klonogene overlevelses av H1299 kloner med varierende p53 status. Alle datapunkter er basert på 2-3 uavhengige gjentatte forsøk.
Vi har også utsatt celler til fornetningsmiddel MMC, noe som fører til generering av DSB på kollapset replikering gafler. I samsvar med dataene i figur 6B, har p53QS ikke undertrykke RAD51 foci-dannelse i respons til MMC (figur 6C). Viktigere var det ingen forskjell i rest γ-H2AX foci i p53-null og p53QS uttrykke celler 24 timer etter MMC eksponering, noe som tyder på at p53 ikke kompromiss DSB reparasjon (Figur 6D). Til slutt, ekspresjon av p53QS svekket ikke overlevelsen av MMC-behandlede celler i overensstemmelse med den tilsvarende RAD51 og γ-H2AX foci nivåer -expressing celler (figur 6E). Det motsatte, var det en liten, men robust økning i motstanden mot MMC ved ekspresjon av enhver av de p53 mutante former. Interessant nok var et lignende resultat når sett som uttrykker p53-A135V mutant i mus embryonale fibroblaster (fig S6). Mekanismer som trans-inaktive p53 kan fremme MMC overlevelse fortsatt ikke bestemt (se diskusjon).
Diskusjoner
Mens p53 rolle som en transkripsjonsfaktor som styrer apoptose og cellesyklusprogresjon er fast etablert, et utall av studier over de siste 15 årene har tilskrevet et mangfold av ytterligere biokjemiske og cellulære funksjoner til p53 [1], [6]. En transaktivering-uavhengig rolle av p53 i den nedregulering av HR har blitt reproduserbart beskrevet ved flere laboratorier, inkludert vår egen [7], [8], [10], [14], [48]. Fordi nøye kontroll av HR-aktiviteter er viktig for responsen på fastlåste eller kollapset replikering gafler, belyse rollen til p53 i HR er kritisk for en bedre forståelse av startfasen og progresjon.
Vi viser her for første gang at p53 nedregulerer HR som reaksjon på replikative stress på en måte som er uavhengig av dens rolle som en transkripsjonsfaktor (figurene 1, 2, 3). Våre data er i overensstemmelse med ideen om at p53 rolle i HR er avhengig av interaksjon med RPA og ATR-kinase, således impliserte p53 i ATR-replikasjonskontrollpunktet (figur 3, 5). Totalt sett er anti-recombinogenic funksjonene til replikering sjekkpunkt gjenstår å bli fullt etablert [40], [49]. I fisjon gjær, inhiberer Chk1 homolog Mus81 og Rad60 funksjon, for derved å forhindre uønsket rekombinasjon [50], [51]. I høyere eukaryoter, fosforylerer ATR BLM, et kjent anti-recombinogenic faktor [52], [53]. På den annen side har ATR vist seg å fremme HR [46], [47]. I samsvar med disse dataene, våre funn antyder at både ATR og ATM fremme RAD51 foci formasjon som svar på replikative stress i en p53-uavhengig måte (figur 5). Dermed kan det eksistere en positiv og negativ (via p53) regulering av HR av ATR.
Med hensyn til potensielle begrensninger i vårt arbeid, en iboende begrensning av foci studiene er at de ikke kan direkte måle protein aktiviteter på replikering gafler (figur 1, 3, 4). Imidlertid er foci endepunkter utbredt i litteraturen for å bestemme molekylære mekanismer og genetiske determinanter av HR [15], [46], [54]. For det andre, dersom en tilsvarende begrensning til vårt system plasmid (figur 2), som kanskje ikke er et nøyaktig mål på fysiologiske HR hendelser som er under kontroll p53. For det tredje, mens alle våre og andre data tyder på at de humane p53QS mutant og mus p53-A135V (eller human homologe) er funksjonelt ekvivalente når det gjelder å undertrykke HR i et transaktiverings-uavhengig måte (for eksempel figur S2) [7], [10], [12], [13], kan vi ikke utelukke at ukjente forskjeller kan forekomme. Til slutt, vi også forsiktig at resultater oppnås med en cellelinje, for eksempel H1299 lungekreftceller i denne studien, kan ikke være lett generaliseres til andre cellelinjer.
Hva er de molekylære mekanismer som S15 fosforylering av p53 kunne undertrykke HR? I en tidligere utgitt modell, vil lagring av RPA fra ssDNA hemme den påfølgende lasting av RAD51, og dermed er en midler som p53 undertrykker HR [10]. P53 N-terminus konkurrerer med ssDNA for OB-fold domene av RPA1 sin N-terminale ende [55]. Således, spekulere vi at mekanismene kan eksistere ved hvilken N-terminal fosforylering av p53 fremmer binding til RPA1, og dermed påvirke den ssDNA-bindende affinitet av de DNA-bindende domener av RPA. For eksempel, endret ssDNA-RPA binding kan føre til ukontrollert utslipp av RPA fra ssDNA svekke med riktig RAD51 lasting eller p53 kan felle RPA på ssDNA og forsinke RAD51 lasting. Det er sterke avhengighetsforhold mellom de N-terminale p53 fosforyleringsseter [56], [57]. I H1299 celler, mutere S15 fører til redusert S37 fosforylering etter bestråling [57]. Interessant, Lowry et al. nylig funnet bevis for en kollapset region i bunn og ustrukturert p53 domene med en løkke struktur sentrert rundt rester 34-36 [58]. Disse forfatterne foreslo at S37 fosforylering kan føre til en åpen konformasjon av dette domene og derved fremme binding til RPA1. Dermed vil mutasjon av S15 svekke HR indirekte gjennom en hemmende effekt på tilstøtende S37 fosforylering.
Den oppfatningen at p53 kan undertrykke DSB reparasjon har kommet fra en rekke studier som ser på effekten av p53 på seterettet DSB i kromosomalt integrerte plasmid substrater [7], [12], [59]. Vi har funnet at størrelsen av den undertrykkende virkning p53 er korrelert med lengden av sekvenshomologi til stede (figur 2, S2). Vi postulere at pDT219 /pΔ2 system (figur 2) er representativ for søsterkromatidutveksling reparasjon på grunn av omfanget av tilgjengelig sekvens homologi er i kilobase område. Mens vi erkjenner at en sammenligning mellom ulike rekombinasjon systemer har begrensninger, en avhengighet av p53 er undertrykkende effekt på homologi lengde er i utmerket avtale med en tidligere studie av Wiesmüller et al. [12]. Disse forfattere, som brukte et panel av kromosomale EGFP-baserte substrater, viste at nedregulering av genet konverteringsarrangement med p53 var særlig markert når lengden av felles homologi ble redusert til 168-233 bp. Det er mulig at p53 danner en terskel mellom korte og lange homologier, noe som kan hjelpe til å hindre utsatt for feil reparasjon og skadelige rearrangementer ved forskyvning av repeterende DNA. En slik modell vil være i overensstemmelse med den observasjon at cellulære p53 status ikke har noen direkte effekt på genet målretting og Søsterkromatidutbytting utveksling, som typisk blir mediert av lange homologier i størrelsesorden kilobaser [60]. Denne modellen spår også at p53 ikke vil negativt påvirke reparasjon av kromatid DSB forårsaket av ioniserende stråling eller andre midler, som er i tråd med celleoverlevelsesdata [61]. Våre data tyder også på at HR ferdigheter målt med en I-SCEI basert plasmid system som PDR-GFP (figur S2) er ikke alltid en god surrogatmarkør for HR-avhengige reparasjon av eksogene DNA-skader. Videre, de senere data tyder på at HR reparasjon av kromosomalt I-SCEI-indusert DSB er cellesyklusavhengig og utsatt for transkripsjonsregulering av p53 (Rieckmann et al., Upublisert 2011). Således er det mulig at HR-aktiviteter i respons til replikering stress eller frank DSB er differensielt regulert av villtype og muterte p53 varianter. Vi kan heller ikke utelukke at de regulatoriske effekter kan variere mellom cellelinjer.
Til slutt, p53 ikke kompromittere RAD51 foci respons og celle overlevelse etter eksponering for kryssbindingsmiddel MMC (figur 6). Tvert i mot var det til og med en liten økning i celleoverlevelse ved ekspresjon av transaktivering-manglende mutanter p53 (figur 6E, S6). Den underliggende mekanismen gjenstår å fastslå, men kan forholde seg til en mulig stabilisering av multi-proteinkomplekser ved replikasjonsgaffelen av p53 (LMM, HW, upubliserte data). Den observerte økningen i MMC motstand er i overensstemmelse med andre rapporter som viser at, i fravær av apoptose, er tilstedeværelsen av p53 assosiert med cisplatin motstand [62], [63], [64]. I motsetning til dette, i cellesystemer eller analyser som er mottakelige for apoptose, motstand overfor DNA-ødeleggende midler vanligvis er forårsaket av tap av villtype p53 [65], [66]. Totalt sett er rollen til p53 i å bestemme celleoverlevelse i respons til DNA-skade klart kompleks og en refleksjon av p53 er flere funksjoner i apoptose, cellesykluskontroll, og DNA-rekombinasjon. Studiet av disse spørsmålene i definerte cellesystemer er en lovende avenue av etterforskningen med potensial klinisk relevans for behandling av ondartede svulster de fleste som har mistet p53-funksjon. I tillegg den biologiske betydningen av p53 funksjon i HR regulering, særlig med hensyn til sin rolle i tumor undertrykkelse, gjenstår å bli etablert.
Materialer og Metoder
Cellelinjer
NCI-H1299 lungekreftceller (p53-null) ble oppnådd fra ATCC og deres bruk er tidligere publisert [10]. A549 lungekreftceller ble også erholdt fra ATCC. Muse embryonale fibroblaster (BALB /c 3T3 10,1 klone, p53-null) var en gave fra Dr. Arnold Levine og bruken har blitt publisert [14], [61]. H1299 /FRT kloner som bærer forskjellige p53 mutanter ble generert i henhold til produsentens instruksjoner (Flp-In, Invitrogen). I korthet ble H1299-celler ble transfektert med elektro pFRT /LacZ, etterfulgt av Zeocin (100 ug /ml, Invitrogen) valg for å etablere kromosomale integranter. Løssalgs integranter med lav transkripsjonen aktivitet basert på co-integrert β-galaktosidase reporter ble valgt for transfeksjon med ulike pcDNA5 /FRT-p53 konstruksjoner, samtidig med pOG44 for målrettet integrering i FRT akseptor nettstedet. Etter valg med 400 ug /ml Hygromycin (Invitrogen) ble kolonier ekspandert og helcellelysater erholdt å vurdere proteinekspresjon. For noen eksperimenter, H1299 celler bærer en tilfeldig integrert p53QS konstruere (PRC /CMV- L22Q /W23S, vennlig levert av Anindya Dutta) ble brukt. MEFs ble transfektert med en ekspresjonsvektor for p53-A135V og valgt med 500 ug /ml G418 (Fisher Scientific), som tidligere beskrevet [13]. Alle cellelinjer testet mycoplasma-free.
RNA interferens
ATR ble angrepet av en tidligere brukt og validert siRNA oligonukleotid, 5’CCUCCGUGAUGUUGCUUGAtt -3 «(Applied Biosystems) [67]. Eksponensielt voksende H1299 cellene ble utplatet i 16 timer før transfeksjon. ATR siRNA eller en kryptert kontroll ble fortynnet i 100 ul Opti-MEM (Roche) for å gi en sluttkonsentrasjon på 100 nM, og blandet med 10 ul av X-tremeGENE transfeksjon reagens (Roche) i 100 pl i Opti-MEM. Kompleksdannelse ble tillatt å fortsette i 20 minutter ved romtemperatur før dråpevis tilsetning til cellene. siRNA-komplekser ble inkubert med cellene i 4 timer, ved hvilket tidspunkt cellene ble endret til det normale vekstmediet. Transfeksjon ble gjennomført to ganger, med 24 timers mellomrom, for å oppnå optimal knockdown. Helcellelysater ble oppnådd ved 24 og 48 timer. Lysater ble denaturert og redusert, og deretter kjørt på 3-8% Tris-acetat gel (Invitrogen) i 2,5 timer ved 150 V. Prøvene ble overført til en PVDF-membran med en halvtørr apparat (BioRad) i 1 time ved 12
