Abstract
Cervical kreft celler vanligvis havn en defekt G
1 /S sjekkpunkt på grunn av samspillet mellom virale oncoproteiner med p53 og retinoblastom protein. Aktiveringen av G
2 /M kontrollpunktet kan således være avgjørende for å beskytte cancerceller fra genotoksiske fornærmelser, slik som kjemoterapi. I 52 livmorhalskreftpasienter som behandles med neoadjuvant kjemoterapi, undersøkte vi om nivåene av fosforylert Wee1 (pWee1), en nøkkel G
2 /M sjekkpunkt kinase, og γ-H2AX, en markør av DNA dobbelttrådbrudd, diskriminert mellom pasienter med en patologisk fullstendig reaksjon (pCR) og de med restsykdom. Vi testet også sammenhengen mellom pWee1 og fosforylert Chk1 (pChk1), en kinase opptrer oppstrøms Wee1 i G
2 /M sjekkpunkt veien. pWee1, γ-H2AX og pChk1 ble retrospektivt vurdert i diagnostiske biopsier ved immunhistokjemi. Grader av pWee1 og pChk1 uttrykket ble definert ved hjelp av tre ulike klassifiseringsmetoder, dvs. fargeintensitet, Allred poengsum, og en multiplikativ poengsum. y-H2AX ble analysert både som kontinuerlig og kategorisk variabel. Uavhengig av klassifisering som brukes, ble forhøyede nivåer av pWee1 og γ-H2AX signifikant assosiert med en lavere rate av PCR. I univariate og multivariate analyser, pWee1 og γ-H2AX ble begge assosiert med redusert PCR. Intern validering gjennomført gjennom en re-sampling uten utskiftingen bekreftet robustheten av multivariate modellen. Til slutt fant vi en signifikant sammenheng mellom pWee1 og pChk1. Meldingen formidles av dagens analyse er at biomarkører av DNA skade og reparasjon kan forutsi effekten av neoadjuvant kjemoterapi i livmorhalskreft. Videre studier er garantert å prospektivt validere disse oppmuntrende funn
Citation. Vici P, Buglioni S, Sergi D, Pizzuti L, Di Lauro L, Antoniani B, et al. (2016) DNA skade og reparer Biomarkører i livmorhalskreft pasienter behandlet med Neoadjuvant kjemoterapi: en utforskende analyse. PLoS ONE 11 (3): e0149872. doi: 10,1371 /journal.pone.0149872
Redaktør: Yanchang Wang, Florida State University, USA
mottatt: 03.12.2015; Godkjent: 07.02.2016; Publisert: 01.03.2016
Copyright: © 2016 Vici et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er innenfor papir
finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Forkortelser Kasino, Ataxia-telangiectasia mutert; ATR, ataksi telangiectasia og Rad3 relaterte protein; Chk1, Checkpoint kinase 1; Chk2, Checkpoint kinase 2; DDR, DNA skade respons; DSB, dobbel tråd pause; PCR, patologisk komplett respons; pChk1, hosphorylated Chk1; y-H2AX, fosforylert H2A Histone familiemedlem X; pRb, retinoblastom protein; pWee1, fosforylert Wee1; Wee1, Wee1-lignende protein kinase
Innledning
eukaryote celler er stadig utsatt for endogene og eksogene kilder til DNA-skader. Overføringen av uskadet DNA til avkommet sikres av en kompleks molekyl nettverk, den DNA-skade respons (DDR), som opererer gjennom koordinert aktivitet av cellesykluskontrollpunkter, DNA-reparasjonsmekanismer og apoptotiske reaksjonsveier [1, 2]. Tilstedeværelsen av genetiske lesjoner utløser kontrollpost-mediert arrest av cellesyklusen [2]. Denne hendelsen gjør at DNA-reparasjons effektorer og apoptotiske veier å reparere lesjon eller eliminere irremediably skadede celler, henholdsvis.
Kreftceller abnormt bruke DNA-reparasjonsmekanismer for å overleve stressende forhold, som for eksempel eksponering for kjemoterapi [2]. Et felles trekk til en rekke forskjellige tumorer er den defekte naturen av G
1 /S-fase sjekkpunktet, som stammer fra mutasjoner eller funksjonell inaktivering av p53 eller retinoblastom protein (pRb) [3]. Når dette skjer, kreftcellene har blitt svært avhengig av G
2 /M sjekkpunktet for cellesyklus-stans og DNA-reparasjon [3]. Den ataxia telangiectasia og Rad3-relaterte protein (ATR) -Checkpoint kinase 1 (Chk1) -Wee1-lignende protein kinase (Wee1) kaskade utgjør kjernen av G
2 /M kontrollpunkt, hvis aktivering fører til hemming av cyclin-avhengig kinase 1 og kulminerer i sjekkpunkt-mediert cellesyklus arrest [3]. På en slik måte, kreftcellene har tid til å korrigere kjemoterapi-indusert DNA-lesjoner, unngå inntreden i en dødelig mitose kjent som mitotisk katastrofe [4]. G
2 /M sjekkpunkt avhengighet i en p53-defekt molekylære bakgrunnen er et konsept for tiden utnyttes for den kliniske utviklingen av syntetiske dødelighet baserte behandlingsformer. Når G
1 /S-fase sjekkpunkt-defekte celler blir utsatt for kjemoterapeutika, samtidig farmakologisk hemming av G
2 /M sjekkpunkt kinaser er skadelig for cellen trenings [3].
Vi resonnerte at G
2 /M sjekkpunkt «avhengighet» for å kompensere p53 eller pRb defekter ved eksponering for gentoksiske stoffer kan utnyttes i jakten på prediktive biomarkører forutså kjemoterapi følsomhet /resistens. I denne utforskende analyse vi fokusert på livmorhalskreft, prototypen av p53- og pRb-defekte svulster. Faktisk HPV E6 og E7 oncoproteiner fremme ubiquitin-formidlet nedbrytning av p53 og pRb, henholdsvis [5]. Vi dermed retrospektivt undersøkt sammenhengen mellom nivåene av DNA skade og reparasjon biomarkører, vurderes i bioptic prøver fra ubehandlede pasienter ved diagnosetidspunktet, og patologisk komplett respons (PCR) etter neoadjuvant kjemoterapi, dvs. kjemoterapi levert i tidsrammen mellom diagnose biopsi og kirurgisk reseksjon. Alle pasientene ble homogent behandlet med paclitaxel, ifosfamid og cisplatin (TIP regime). Vi fokuserte på fosforylert Wee1 (pWee1) som en proxy for G
2 /M sjekkpunkt aktivisering, og fosforylert H2A Histone familiemedlem X (γ-H2AX) som en markør av DNA dobbelttrådbrudd. Fosforylert Chk1 (pChk1) ble testet i en brøkdel av prøver for en signale studie.
Materialer og metoder
deltagerne og prosedyrer
femtito histologisk bekreftet livmorhalskreftpasienter (stadium Ib2-IIIa) som fikk neoadjuvant kjemoterapi ble inkludert i denne retrospektive analysen. Alle pasientene ble behandlet med TIP regime (paclitaxel 175 mg /m
2 på dag 1 + ifosfamid 2500 mg /m
2 på dag 1 og 2 + cisplatin 50 mg /m
2 på dag to hver 21 dager for tre eller fire sykluser) etterfulgt av radikal kirurgi. Pasientene ble ansett kvalifisert hvis de fullførte den planlagte behandlingen, data om kliniske funksjoner og behandlingsresultatene var tilgjengelige, og mengden av biologisk materiale i sine biopsier var tilstrekkelig for molekylære analyser. PCR ble definert som ingen restsykdom i kirurgiske prøver. Den immunhistokjemiske vurdering av pWee1, γ-H2AX, og pChk1 ble utført i formalinfiksert parafin-embedded (FFPE) vev, hentet fra de biologiske prøver innsamlet gjennom bioptic prosedyrer i ubehandlede pasienter, ved hjelp av følgende antistoffer: anti-fosfor-H2AX ( Ser139) (klon JBW301) mus monoklonalt antistoff (MAb) (Upstate, NY, USA) ved fortynning på 1: 500, anti-fosfo-Wee1 (Ser642) (klon D47G5) kanin MAb (Cell Signaling, Danvers, MA, USA ) ved fortynning på 1: 100, og anti-fosfo-Chk1 (Ser345) (klon 133D3) kanin MAb (Cell Signaling, Danvers, MA, USA) ved en fortynning på 1: 100. Immunhistokjemisk farging ble utført i en automatisert Autostainer (BOND-III, Leica, Milano, Italia) med en biotin-fri polymer pepperrot (HRP) -linker antistoff konjugert system (Leica, Milano, Italia). For hver tumor ble tre forskjellige, 3 um parafinsnitt analysert og undersøkt ved lysmikroskopi. Immunoreaksjon av tumorceller ble telt i fire kraftige felt (400x forstørrelse) per seksjon. pWee1 og pChk1 ble betraktet som positive når ≥10% av neoplastiske celler viste en tydelig atom immunoreaktivitets. pWee1 og pChk1 ble gradert på en fire karakterskala basert på fargeintensitet (0: negativ, 1+: svak, 2+: moderat, 3+: sterk). Svulster ble klassifisert som negative (= pWee1
neg 0 og pChk1
neg) eller positive (1-3 = pWee1
pos og pChk1
pos) sikret Allred score ble oppnådd som tidligere beskrevet [6 ], vurderer fargeintensitet og prosentandel av tumor uttrykke celler, og rapportert i henhold til en skala fra 0 til 8. Svulster ble klassifisert som lav uttrykker om Allred stillingen var ≤ 2 (pWee1
Allred lav, pChk1
Allred lav), eller så høyt som uttrykker om Allred stillingen 2 (pWee1
Allred høy, pChk1
Allred høy). De multiplikative score ble oppnådd ved å multiplisere fargeintensitet x prosentandelen av tumor-uttrykkende celler, og ble uttrykt på en skala fra 0 til 300. Tumorene ble klassifisert som uttrykker lav (pWee1
multi lav og pChk1
multi lav) eller høy uttrykke (pWee1
multi høy og pChk1
multi høy) bruker median score på alle svulster som en cut-off point. γ-H2AX uttrykk ble ansett som prosentandelen av tumor-uttrykke celler og analysert både som kontinuerlig (γ-H2AX
forts) og som kategorisk variabel, som modalitet ble definert ved hjelp av median score på alle svulster (γ-H2AX
lav og γ-H2AX
høy). Tumorprøver ble evaluert uavhengig av to etterforskere (SB og MC) som ble blindet for behandlingsresultatene, og uharmoniske saker ble anmeldt (MM). Denne retrospektive studien ble gjennomført i samsvar med Helsinkideklarasjonen og ble godkjent av Ethic Komiteen «Regina Elena» National Cancer Institute of Rome, den koordinerende senter. Skriftlig informert samtykke ble sikret før kjemoterapi.
Statistisk analyse
Kreft og pasientrelaterte funksjoner ble deskriptivt preget for alle pasienter inkludert i denne analysen. Medianer og områder ble brukt til å rapportere om kontinuerlige variabler, mens kategoriske variabler ble uttrykt av frekvenser og prosentverdier. For å kunne vurdere forholdet mellom kategoriske variabler på Pearsons Chi-squared test av uavhengighet (2-tailed) og Fisher Exact test ble benyttet. Bruken av univariat logis regresjonsmodeller bidro til å identifisere variabler potensielt påvirker behandlingsresultat. Multivariate logistiske regresjonsmodeller ble bygget ved å inkludere variabler teste signifikante på univariate vurdering eller identifisert på grunnlag av den kliniske plausibilitet av sin rolle i å påvirke PCR. For å estimere risiko for en overfitted multivariatmodell og undersøke dens stabilitet, ble en intern validering utføres under anvendelse av en re-sampling prosedyre uten erstatning. For dette formål ble hundre datasett som genereres ved tilfeldig å fjerne ca 20% av den opprinnelige prøven. For hver simulering, gjentok vi den multivariate logistisk regresjonsmodell og Cohens Kappa koeffisient, den positiv prediktiv verdi (PPV), negativ prediktiv verdi (NPV), følsomhet og spesifisitet ble beregnet. Vi vurderte statistisk signifikante p-verdier mindre enn 0,05. Statistiske analyser ble utført ved hjelp av SPSS programvare (SPSS versjon 21, SPSS Inc., Chicago, IL, USA).
Resultater
baseline karakteristikker av de 52 pasientene i denne studien er oppsummert i Tabell 1. Median tid mellom diagnostisk biopsi og radikal kirurgi var 4,99 måneder [IQ Range: 4,01 til 5,83]. Alle pre-kjemoterapi prøver, består i diagnostiske biopsier, ble undersøkt for pWee1 og γ-H2AX, mens pChk1 data var tilgjengelige for 37 prøver. Median prosenter av atom uttrykke celler for pWee1, pChk1 og γ-H2AX var 40% (min /max 10/80), 30% (min /max 10/80) og 30% (min /maks 0/80), henholdsvis . Representative immunhistokjemiske fargemønstre er illustrert i fig 1. Som vist i tabell 2, har vi funnet en statistisk signifikant sammenheng mellom forhøyet atom pWee1 ekspresjon og redusert pCR hastighet. Foreningen testet betydning for alle scoring metoder undersøkes (pWee1
pos vs pWee1
neg, p = 0,016; pWee1
Allred høy vs pWee1
Allred lav, p = 0,016; pWee1
multi høy vs pWee1
multi lav, p = 0,034) (tabell 2). Likeledes ble det forhøyede nivåer av kjernefysiske γ-H2AX assosiert med redusert pCR hastighet, både når den betraktes som kategoriske og kontinuerlige variable (p = 0,037 og p = 0,026 i tabell 2 og figur 2, henholdsvis). Ved vurdering av kombinasjon av de to markørene, bare en pasient av 16 med doble positive tumorer opplevde en PCR, 9 ut av 16 pasienter med doble negative tumorer oppnå en PCR, og en mellomliggende resultat ble observert hos pasienter med tumorer uttrykte bare en biomarkør (p = 0,009) (tabell 3). Seks av 8 dødsfall ble observert i doble positive tumorer (p = 0,013) (Tabell 3). I univariate logistisk regresjonsmodell ble pWee1 og γ-H2AX direkte forbundet med PCR (pWee1
pos vs pWee1
neg: Odds Ratio (OR) 5,31, 95% konfidensintervall (CI): 1,42 til 19,87, p = 0,013; y-H2AX
høy vs γ-H2AX
lav: OR 4,20, 95% KI: 1,13 til 15,59, p = 0,032, henholdsvis) (tabell 4); den multivariate modellen bekreftet prediktiv rolle pWee1 og γ-H2AX (tabell 4). Den interne validering utføres gjennom en re-sampling prosedyre bekreftet robustheten av multivariate modellen. Konkordans, positiv prediktiv verdi, negativ prediktiv verdi, Sensitivitet og spesifisitet er vist i tabell 5. Til slutt, når undersøker co-uttrykk mønstre, gjorde vi ikke observere noen sammenheng mellom pWee1 og γ-H2AX (data tilgjengelig på forespørsel), mens en statistisk signifikant sammenheng ble rapportert mellom pWee1 og pChk1 (fig 3).
Tre påfølgende seksjoner for hver svulst blir viste. (AC) En trippel positiv tumor med atom γ-H2AX (A), pWee1 (B) og pChk1 (C) immunoreaktivitet. (DF) en svulst som ikke uttrykker γ-H2AX (D), og det co-uttrykte pWee1 ( E) og pChk1 (F). (GI) En svulst uttrykker atom γ-H2AX (G) som manglet både pWee1 (H) og pChk1 (I) uttrykk
I figuren. Den øvre horisontale linjen i boksen er 75- persentil; den nedre horisontale linjen merket den 25. persentil; den horisontale linjen innenfor boksen er medianverdien; den øverste horisontale linjen utenfor sekstenmeteren for maksimal verdi; den nedre horisontale linjen utenfor sekstenmeteren for minimumsverdiene.
(A) Association ifølge fargeintensitet basert klassifikasjon (positiv vs negativ). (B) Association ifølge Allred scorer klassifisering (høy vs lav). (C) Association ifølge en multiplikativ poengsum klassifisering (høy vs lav).
Ett hundre mindre drevne simulerings datasett ble generert, hver ca 80 % av den opprinnelige størrelsen.
Diskusjoner
i denne studien vi retrospektivt utforsket den prediktive betydning pWee1 og γ-H2AX uttrykk, evalueres i diagnostiske biopsier relatert 52 livmorhalskreftpasienter som fikk neoadjuvant kjemoterapi. Vi har også undersøkt sammenhengen mellom pWee1 og pChk1 for å gi ledetråder om Wee1 aktivering i livmorhalskreft er mediert av Chk1. Så vidt vi vet, er dette den første studien rapporterer om DNA skade og reparasjon biomarkører i livmorhalskreft som utnyttet konseptet med den defekte natur G
1 /S-fase sjekkpunkt. Samlet, observerte vi en statistisk signifikant sammenheng mellom forhøyet uttrykk for pWee1 og γ-H2AX og redusert sats på PCR. Derfor tilbyr vi første hint om at den forhøyede uttrykk for DDR biomarkører i diagnostiske prøver kan være forbundet med suboptimal effekt av kjemoterapi, evalueres gjennom PCR i kirurgisk resected svulster. Vi har også observert en positiv sammenheng mellom pWee1 og pChk1 uttrykk som antyder effektiv G
2 /M sjekkpunkt aktivering. Vi er klar over at våre resultater er hypotesen generer i naturen gitt den retrospektive design av studien. . Likevel, utover den enkle analytisk tilnærming, har vår studie noen viktige styrker
Først neoadjuvant innstillingen tilbyr flere fordeler for identifisering og utvikling av kreft biomarkører: i) analyse av potensielle markører i en molekylær bakgrunn ikke «forurenset» av eksponeringen av tidligere kreft behandlinger, ii) identifisering av prediktive markører for å velge pasienter som vil mer sannsynlig nytte av kjemoterapi, iii) identifisering av biomarkører som også holder prognostisk betydning, selv om bevis på sammenhengen mellom pCR og langsiktige overlevelse utfall i livmorhalskreft er ikke like robust som den er i brystkreft [7, 8].
for det andre, så langt, i livmorhalskreft jakten på prediktive biomarkører knyttet til økt evne for kreft celler til å beskytte deres genom når utfordret med kjemoterapi eller strålebehandling har vært utelukkende fokusert på nucleotide excision repair (NER) proteiner, og særlig på excision reparasjon cross-komplemente group1 (ERCC1) protein [9-13]. NER er deputed å korrigere voluminøse helix-forvrengt lesjoner, slik som de som er påført på DNA av platinabasert terapi. Men innenfor rammen av DDR, er NER en av de mange distale effektorer som er tilordnet til å opprettholde integritet genom. Et antall molekylære nettverk beskytte genomet, enskjønt deres engasjement avhenger av type av lesjon. DNA reparasjons veier inkluderer også basen excision reparasjon (BER), mismatch reparasjon (MMR), direkte reparasjon, og dobbel tråd pause (DSB) recombinational reparasjon. Sistnevnte omfatter feilfritt homolog rekombinasjon reparasjon (HRR) og utsatt for feil non-homolog ende-sammenføyning (NHEJ) [1]. Derfor kan nivået av biologisk kompleksitet DDR undervurderes når utelukkende vurderer en, eller få, komponenter samlokalisert i et bestemt reparasjon nettverk. Videre bekymringer ble reist på pålitelighet og biologisk betydning, av ERCC1 deteksjonsmetoder [14, 15]. Motsatt vår studie fokusert på mester DDR komponenter, hvis aktivering er kjent for å være spesielt effektiv i livmorhalskreft.
Deretter vi en hypotese som har blitt stadig av endogene nivåer av DNA-skade, speiles av γ-H2AX, bør økt uttrykk av pWee1 og pChk1.Even om ATR-Chk1-Wee1 aksen er primært aktiveres ved strukket av enkelt-strandet DNA, kan disse unormale strukturer generere DSB sin ved replikasjonsgaffelen kollaps [16]. Videre har vi begrunnet at aktiveringen av G
2 /M sjekkpunktet bør være spesielt dyktig i nærvær av høye basalnivåer av endogene DNA-skade, som tilsvarer en adaptiv mekanisme som kreftceller motvirke oncogen-indusert replikasjon spenning [16] . Faktisk er det kjent at ATR og Chk1 undertrykke den apoptotiske respons følgende DNA-replikasjon spenning [17], og at svulster er karakterisert ved forhøyede nivåer av replikative stress, for eksempel myc-drevne kreftformer, er svært sårbare for den farmakologiske målretting av G
2 /M sjekkpunkt kinaser [18-23]. Vi observerte ikke noen sammenheng mellom pWee1 og γ-H2AX, men heller disse endepunktene var uavhengig assosiert med PCR. Vi kan spekulere at to uavhengige reparere veier, særlig effektive i livmorhalskreft, ble fanget i denne studien. En passende kandidat er Ataxia-telangiectasia mutert (ATM) -Checkpoint kinase 2 (Chk2) sti, som hovedsakelig er aktivert av DSB sin [16]. Et omfattende samarbeid mellom den ATM-Chk2 sti og ATR-Chk1-Wee1 signalering, og ATM phosphorylates også H2AX [16].
Et annet aspekt som kommer ut fra denne studien er knyttet til sammenhengen mellom pWee1 og pChk1 uttrykk. Wee1 er plassert nedstrøms Chk1 [3], og Wee1 fosforylering ved Ser642 øker dets stabilitet i kjernen og fremmer cellesyklus-stans i G
2 /M overgang [24, 25]. Men til vår kunnskap formelt bevis på at denne reguleringsmekanisme, nemlig Chk1 drevet fosforylering av Wee1 på Ser642, opererer i pattedyrceller mangler fortsatt. Nåværende bevis for det meste stammer fra studier med
Xenopus
ekstrakter og
Schizosaccharomyces pombe
som modellsystemer [26, 27]. Selv om studien ikke var designet for å generere mekanistiske innsikt i dynamikken som styrer Wee1 aktivering, resultatene gir et forslag for fremtidige prekliniske undersøkelser.
Et siste punkt som fortjener betraktning refererer til den beskyttende rollen G
2 /M sjekkpunkt aktivering i sammenheng med kreft stamceller [28]. Aktivering av aksen har vært assosiert med terapeutisk motstand i forskjellige kreft stilk cellemodeller, inkludert hjerne, lunge og tykktarm kreft [29-31]. Multiplisere innsatsen for å etablere en samling av pasient avledet livmorhalskreftstamceller for omfattende molekylær karakterisering er en strategi som bør forfølges for ytterligere å dissekere forholdet som eksisterer mellom G
2 /M sjekkpunkt aktivering og kjemoresistent funksjoner. Relevansen av denne tilnærmingen er enda tydeligere når de vurderer behovet for mer nøyaktige cellulære og dyremodeller i lys av antall Chk1 og Wee1 hemmere som trådte klinisk utvikling [3, 32]. For eksempel, en fase I studie med den første i klassen Wee1 hemmer AZD1775 (MK1775) i forbindelse med cisplatin og strålebehandling er pågående (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT01958658), og en fase I /II studie i kombinasjon med topotekan /cisplatin resultater som fullført (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT01076400). Dessuten har en fase I-II studie av AZD1775 i kombinasjon med kjemoterapi er initiert hos pasienter med TP53-mutert epitelovarialcancer, eggleder eller primær peritoneal kreft [33].
Konklusjoner
for å oppsummere, pWee1 andγ-H2AX uttrykk i pre-kjemoterapi prøvene viste evne til å forutse pCR i livmorhalskreftpasienter som behandles med neoadjuvant paclitaxel, ifosfamid og cisplatin. Basert på svært lovende resultater her presenteres prospektiv validering eller, alternativt, er hjelpe molekylære analyser i forbindelse med potensielle forsøk garanteres å bedre karakterisere prediktiv evne til disse biomarkører.
Takk
Vi takker Tania Merlino for teknisk assistanse.
