Abstract
Den trans og utskilt protein delta-lignende en homolog (
DLK1
) tilhører EGF-familien. Det er allment akseptert at
DLK1
spiller viktige roller i å regulere celledifferensiering, som adipogenesen og osteogenesis. Avvikende uttrykk for
DLK1
er funnet i ulike typer kreft hos mennesker, inkludert lungekreft. En tidligere studie i denne lab har avdekket at
er DLK1
forbundet med tumorinvasjon, selv om mekanismen er fortsatt ukjent. For å utforske de potensielle effektene som
DLK1
kan ha på invasjon,
DLK1
ble overexpressed eller slått ned i den menneskelige lunge kreft cellelinjer. Proteinets innflytelse på celle invasjon ble deretter evaluert. En transwell analysen viste at
DLK1
overekspresjon betydelig forfremmet kreftcelle invasjon. Western blotting og gelatin zymografi analyse indikerte at
DLK1
kan påvirke både matriksmetalloproteinase-9 (
MMP9
) Uttrykket og ekstracellulære aktivitet. En analyse av
NOTCH1 Hotell og
HES1
genekspresjon og Notch intracellulært domene (NiCd) kjernefysisk trans under
DLK1
stimulering eller uttømming vist at
DLK1
kunne aktivere Notch signalering i lungekreftceller. I tillegg forhøyet uttrykk for
MMP9
indusert av
DLK1
stimulering kan bli betydelig redusert ved å hemme Notch signalering ved hjelp av γ-sekretase inhibitor (GSI). Dataene som presenteres i denne studien tyder på at
DLK1
kan fremme invasjonen av lungekreftceller ved oppregulering
MMP9
uttrykk, som avhenger av Notch signale
Citation. Li L Tan J, Zhang Y, Han N, Di X, Xiao T, et al. (2014)
DLK1
Fremmer Lung Cancer Cell invasjon gjennom oppregulering av
MMP9
Expression Avhengig Notch signalering. PLoS ONE 9 (3): e91509. doi: 10,1371 /journal.pone.0091509
Redaktør: Yunli Zhou, Harvard Medical School, USA
mottatt: 15 november 2013; Godkjent: 11 februar 2014; Publisert: 12 mars 2014
Copyright: © 2014 Li et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av Stiftelsen Natural Science of China (30930042 og 81301852) og Specialized forskningsfond for doktorgradsutdanning av høyere utdanning (20111106110017). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er den ledende årsak til kreft dødsfall på verdensbasis, og tumor metastase er sterkt assosiert med prognosen for kreftpasienter [1], [2]. Våre tidligere studier på forskjellig uttrykt gener i human lunge plateepitelkarsinom (SCC) med eller uten lymfeknutemetastase ved hjelp av DNA microarray analyse fant et sett med metastaseassosierte gener (FDR 0,05, ikke data vist). Blant disse genene,
DLK1
viste mer enn to ganger høyere uttrykk i primære svulster med lymfeknutemetastase, noe som tyder på at
DLK1
kan spille roller i kreft metastasering. Men både forholdet mellom
DLK1 Hotell og tumor metastase og dens mekanisme er dårlig karakterisert.
delta-lignende en homolog (
DLK1
) genet, med aliasene
FA1
,
ZOG Hotell og
PREF-en
, koder for et trans og utskilt protein (DLK1) inneholder seks epidermal vekstfaktor (EGF) domener som er medlem av EGF -lignende familien. Dette proteinet er svært homolog med Notch ligand DLL1 men mangler Delta /Serrate /Lag (DSL) motiv som er avgjørende for å kommunisere med Notch reseptorer [3], [4]. Studier på
DLK1
har avslørt sin rolle i celledifferensiering. For eksempel,
DLK1
kan fungere ved modulering av adipogenese [5], [6], [7], som regulerer osteoblastdifferensierings [8], [9] og inhibering av differensiering og proliferasjon av hematopoietiske celler [10]. Den nonclassical ligand
DLK1
ble funnet å være avvikende uttrykt i flere humane kreftformer, inkludert neuroblastom [11], hepatocellulært karsinom [12], [13], [14] gliomer og human prostatakreft [15]. Vår tidligere arbeid fant også at
DLK1
er sterkt uttrykt i menneske ikke-småcellet lungekreft og fungerer som et onkogen [16]. Oppregulert uttrykk for
DLK1
i ikke-småcellet lungekreft er forbundet med lymfeknutemetastase, men mekanismen er fortsatt ukjent.
Notch veien er et velkjent signaltransduksjonsbane løpet av utviklingsprosess og celle skjebne besluttsomhet. Selv om mangler DSL-motivet, har
DLK1
blitt vist å virke som en inhibitor av Notch signalering in vitro [17], [18]. Både membranbundet og utskilt DLK1 kan samhandle med NOTCH1 [17], som fører til endret cellulær fordeling av NOTCH1 og inhibering av Notch-regulert genekspresjon [4], [5], [19]. Det har blitt rapportert at
NOTCH1
kan regulere uttrykket av matriksmetalloproteinase-9 (
MMP9
) i prostatakreftceller, som spiller viktige roller i kreft invasjonen [20]. Med disse funnene sammen, hypotese vi at Notch signalering kan være involvert i
DLK1
indusert kreft celle invasjon.
Undersøkelsen som vi presenterer her gir holdepunkter for at
DLK1
forbedret evne til lungekreftceller å invadere den ekstracellulære matriks (ECM), som validert vår forrige gene expression profilering resultatene utledet fra microarray analyse. Videre våre data viste at
DLK1
fremmet kreftcelle invasjon gjennom oppregulering av
MMP9
uttrykk og forbedring av sin ekstracellulære aktivitet, noe som er avhengig av Notch signalveien.
materialer og metoder
celle~~POS=TRUNC kulturer~~POS=HEADCOMP og behandling
den menneskelige lungekreft cellelinje H520, ble H1299 og A549 oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Cellene ble dyrket i RPMI 1640-medium (Life Technologies, Grand Island, NY) med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 100 pg /ml penicillin-streptomycin i en fuktet inkubator med 5% CO
2 ved 37 ° C . Den Notch inhibitor L-685458 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ble satt til kulturmedier 12 timer etter transient transfeksjon med
DLK1
uttrykk plasmid eller nullvektor (pcDNA3.1), med en endelig effektiv konsentrasjon av 5 mikrometer i RPMI 1640 medium som inneholder 1% FBS.
DLK1
uttrykk plasmid og små interfererende RNA (siRNA)
DLK1
eukaryot ekspresjonsplasmid ble konstruert, og deretter stabilt transfektert inn i H520-celler, som tidligere beskrevet [16].
DLK1
uttrykk plasmid ble også forbigående transfektert inn i H520 og H1299 celler ved hjelp Lipofectamine-2000 transfeksjon reagens (Invitrogen, Carlsbad, California); og en Invitrogen Stealth siRNA duplex (Carlsbad, California) mot
DLK1
ble benyttet for genet Slå hjelp Lipofectamine RNAiMAX reagens (Invitrogen, Carlsbad, California), å følge produsentens instruksjoner.
In vitro ECM invasjonen assay
Celler enten stabilt (H520) eller forbigående (H1299) transfektert med
DLK1
eller null vektor ble dyrket separat inntil 80% samløpet. Cellene ble deretter vasket tre ganger med fosfat-bufret saltvann (PBS) og dyrket i serumfritt medium over natten før de blir utsatt for en ECM-invasjon analyse in vitro. Den chemoinvasion Analysen ble utført ved bruk av BioCoat Matrigel Invasion Chambers med 8 mikrometer porer (BD Biosciences, Bedford, MA) i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet, 2,5 x 10
4 celler ble resuspendert i friskt serumfritt medium og sådd ut i det øvre kammer i en 24-brønners transwell plate, mens det nedre kammer inneholdt friskt kulturmedium med 20% FBS som et kjemotiltrekkende. Cellene ble tillatt å invadere i 22 timer (37 ° C, 5% CO
2 atmosfære), og kamrene ble deretter vasket med PBS. De celler som ikke invaderer gjennom membranen ble fjernet. Invaderende celler på den nedre overflate av membranen ble fiksert med kald metanol, farget med 0,2% krystallfiolett og undersøkt. Cellene på hver membran ble talt opp i ikke mindre enn fem felt under et lysmikroskop.
RNA ekstraksjon og kvantitativ revers transkripsjon-PCR
Total RNA ble isolert fra celler med TRIzol reagens (Invitrogen , Carlsbad, CA), og 1 ug total RNA ble brukt for revers transkripsjon med et Superscript II-revers transkripsjon-sett (Invitrogen, Carlsbad, CA) ifølge produsentens instruksjoner. Real-time PCR-analyse av
MMP9 Hotell og
HES1
uttrykk ble utført med følgende primere: MMP9-F 5′-TTTGACAGCGACAAGAAGTG-3 «, MMP9-R 5′-CAGGGCGAGGACCATAGAGG-3′ , HES1-F 5»-TAGCTCGCGGCATTCCAAG-3 «og HES1-R 5′-AAGCGGGTCACCTCGTTCA-3». Husholdningsgenet
18S
ribosomalt RNA ble plukket ut som en intern kontroll i denne studien, med primerne som 18S-F 5′-GAAACGGCTACCACATCC-3 «og 18S-R-5′-ACCAGACT2TGCCCTCCA-3». En SYBR Premix Ex Taq sett (Takara, Shiga, Japan) ble brukt for real-time PCR-analyse med en standard amplifikasjonsprotokoll: 95 ° C i 10 s, etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 5 s og 60 ° C i 30 s og en endelig forlengelse ved 72 ° C i 3 minutter. Etter forsterkning, ble en standard smeltekurve prosedyren utføres for hvert gen å undersøke spesifisiteten av forsterkning.
Western blotting-analyse
Totalt protein ble ekstrahert fra ca 2 × 10
6 kultivert celler med RIPA buffer, og kjernefysisk protein ble hentet ved hjelp av NE-PER kjernefysiske og cytoplasmatiske utvinning reagenser (Pierce, Rockford, IL) etter produsentens levert protokoll. I alt ble 40-80 ug av proteinene separert ved elektroforese, og deretter overført til en PVDF-membran, som tidligere beskrevet [21]. Membranen ble blokkert med 5% fettfri melk og inkuberes med et primært antistoff mot DLK1 (Proteintech Group, Chicago, IL), NOTCH1 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA), kløyvde NOTCH1 (Val1744, Cell Signaling Technology, Danvers, MA) eller MMP9 (Aviva Systems Biology, San Diego, California). Den anti-Notch intracellulære domenet (NiCd) antistoff brukt i denne studien kan bare gjenkjenne spaltet og aktivert NOTCH1 men ikke full-lengde NOTCH1. Etter vasking med PBS inneholdende 0,1% Tween-20 (PBST), ble membranen inkubert med pepperrot-peroksidase-konjugert sekundært antistoff (Dako, Glostrup, Danmark), og den overflod av proteiner ble påvist med Chemiluminescence reagenser. Membranen ble reprobed med et antistoff mot GAPDH (KangChen Bio-Tech, Shanghai, Kina) eller TBP (Abcam, Cambridge, MA) som interne kontroller for tilsvarende protein lasting.
Gelatin zymografi
stabilt
dLK1
-expressing H520-dlk1 celler, sammen med null-kontroll H520-pcdb og foreldre H520 celler ble dyrket separat i 10 cm retter inntil 80% samløpet. De kondisjonerte medier ble oppsamlet og konsentrert ved bruk av en Amicon filter (Millipore, Bedford, MA) i henhold til produsentens protokoll. I alt ble 20 mikrogram av konsentrerte proteiner elektroforese etter ikke-reduserende betingelser, og gelatinolytisk aktivitet MMP9 ble deretter analysert ved hjelp Zymografi reagenser (Bio-Rad, Hercules, CA) etter produsentens anvisninger.
Statistisk analyse
forskjeller mellom tellinger av invaderende celler i hver gruppe i invasjonen analysen og forskjeller i forhold til uttrykk i real-time PCR-analyse ble evaluert ved hjelp av en t-test. Alle testene var tosidig, og en p-verdi 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Alle statistiske tester ble utført med SPSS programvarepakken, versjon 13.0 (SPSS, Chicago, IL).
Resultater
Overuttrykte
DLK1
forbedret ECM invasjon av lungekreftceller
for å møte enten
DLK1
har potensielle roller i kreft metastasering lunge, lunge cancercell linjene H520 og H1299 ble ansatt som in vitro modell der endogen uttrykk for
DLK1
var mangler. H520-celler med stabil ekspresjon av eksogene
DLK1 plakater (H520-dlk1) ble samlet som tidligere, sammen med H520-pcdb-celler, stabilt transfektert med vektoren (pcDNA3.1) som nullkontrollen [16]. H520-dlk1 celler ble utsatt for invasjonen analysen, med H520-pcdb og foreldre H520 celler som kontroller. Som vist i figur 1 panel A og B, etter en 22-timers periode av invasjon, var det signifikant flere H520-dlk1 celler invaderte gjennom kammeret membranen belagt med Matrigel, sammenlignet med H520 og H520-pcdb celler (p-verdi 0,05). Et lignende fenomen ble observert i H1299 celler. Mer
DLK1
transient transfektert H1299-celler (H1299-dlk1) ble funnet invadert gjennom membranen i forhold til H1299-celler transfektert med nullvektor (H1299-pcdb), som vist i figur 1C og D. Disse resultatene tyder på at overekspresjon av
DLK1
kunne bemerkelsesverdig styrke cellenes evne til å invadere ECM.
A, representative photomicrographs av de invaderende cellene som migrerte gjennom Matrigel-belagte membran av transwell, tatt fra tre grupper: H520, foreldre celler, H520-pcdb, nullvektor-kontrollceller og H520-dlk1, cellene stabilt uttrykker DLK1. B, et histogram for grevene av trekk celler fra H520, H520-pcdb og H520-dlk1 grupper. C, representative photomicrographs viser H1299 celler, som ble transient transfektert med
DLK1 plakater (H1299-dlk1) eller null vektor (H1299-pcdb), som invaderte gjennom Matrigel-belagte membran av transwell. D, et histogram for grevene av trekk celler fra H1299-dlk1 og H1299-pcdb grupper. Forsøkene ble utført i tre eksemplarer (* t-test, p-verdi 0,05).
Overuttrykte
DLK1
oppregulert MMP9 uttrykk og aktivitet
Basert på hypotesen om at
DLK1
indusert kreft celle invasjon ble formidlet av oppregulering av
MMP9
, uttrykk for
MMP9
på
DLK1
stimulering ble analysert av både real-time PCR og Western blotting. Resultatene viste at
MMP9
ekspresjon ble forbedret i H520-dlk1-celler sammenlignet med H520 og H520-celler pcdb både på mRNA og proteinnivå (figur 2A og B). En samme trend ble også observert da
DLK1
ble overuttrykt i et annet lungekreft cellelinje H1299. Etter transient transfektert med
DLK1
, sterkt uttrykt
MMP9
ble påvist i både mRNA og proteinnivåer (figur 2D og E). Som MMP9 protein fyller sin funksjon i en aktivert form i det ekstracellulære rom, ble kondisjonert medium samlet, og gelatin zymografi ble ansatt for å teste MMP9 aktivitet. I figur 2C, er det vist at
DLK1
kan også forbedre MMP9 aktivitet i det ekstracellulære rom, mens aktiviteten av MMP2 var uforandret. For ytterligere å bekrefte forholdet mellom
DLK1 Hotell og
MMP9
, RNA interferens ble ansatt for å utarme
DLK1
uttrykk i A549 celler, og
MMP9
uttrykk var undersøkt sekvensielt. Resultatene viste at DLK1 ekspresjon ble effektivt undertrykt av RNAi på proteinnivå (figur 2G), og MMP9-ekspresjon ble betydelig hemmet både på mRNA og proteinnivå (figur 2F og G). Disse resultatene antydet at
DLK1
kan fremme celle invasjon gjennom regulering MMP9 uttrykk og aktivitet.
A, et histogram for den relative mRNA uttrykk for
MMP9
i H520 celler transfektert med
DLK1 plakater (H520-dlk1) eller null vektor (H520-pcdb) oppdaget av real-time PCR-analyse. Ekspresjonsnivået av
MMP9
i den tomme H520-celler ble anvendt som en kontroll og innstilt på 1. B, protein ekspresjon av MMP9 i H520-dlk1, H520-H520-celler pcdb og evaluert ved Western blotting-analyse. C, gelatin zymografi viser aktiviteten skilles MMP9 og MMP2 i H520-dlk1, H520-pcdb og H520 celler. D, real-time PCR-analyse av den relative mRNA uttrykk for
MMP9
i H1299 celler transfektert med
DLK1 plakater (H1299-dlk1) eller null vektor (H1299-pcdb) vist i et histogram. E, Western blotting som viser proteinuttrykk av MMP9 i H1299-dlk1 og H1299-pcdb celler. F, et histogram som viser den relative mRNA uttrykk for
MMP9
i
DLK1
siRNA (A549-si-dlk1) eller null kontroll siRNA (A549-NC) transfekterte A549 celler evaluert av sanntid PCR-analyse. G protein uttrykk for MMP9 i A549-si-dlk1, A549-NC og tomme A549 celler oppdages av Western blotting. Alle eksperimenter ble utført in triplo.
18S
ribosomalt RNA ble anvendt som en intern kontroll i real-time PCR-analyse, mens GAPDH ble anvendt som en intern kontroll i Western blot-analyse (* t-test, p-verdi 0,05).
Overuttrykte
DLK1
aktivert Notch signalveien
for å bekrefte sammenhengen mellom
DLK1 Hotell og
NOTCH1
, vi først testet NOTCH1 ekspresjon i hel-cellelysater ved Western blotting. Det ble funnet at overekspresjon av
DLK1
kan oppregulere NOTCH1 ekspresjon i både H520 og H1299 celler (figur 3A og D). Fordi NOTCH1 aktivering etterfølges av sin spalting til NiCd og translokasjon av NiCd inn i kjernen for ytterligere transkripsjonsregulering, kan mengden NiCd i kjerner reflektere Notch pathway aktivitet. Vi hentet kjerneproteiner fra H520 celler transient transfektert med
DLK1
eller null-vektoren og undersøkt hvor mye som NiCd ved hjelp av Western blotting. Resultatene viste at NICD translokert til kjernen mer intenst etter overekspresjon av
DLK1
sammenlignet med null-kontroll (figur 3B). Videre uttrykk for
HES1
, en eksplisitt Notch sti målet genet, ble også undersøkt av real-time PCR i H520 og H1299 celler. Det var en betydelig oppregulering av
HES1
etter stimulering av
DLK1
ekspresjon sammenlignet med null-kontroll i begge celler (p-verdi 0,05, figur 3C og E). I motsetning til dette, redusert ekspresjon av NOTCH1 og HES1 ble påvist ved Western blotting og real-time PCR, henholdsvis, når DLK1 ekspresjon ble oppbrukt av RNAi i A549-celler (figur 3F og G).
A, Western blotting som viser NOTCH1 uttrykk i H520 celler etter transfeksjon med
DLK1 plakater (H520-dlk1) eller null vektor (H520-pcdb) undersøkt i hel-cellelysater. GAPDH ble anvendt som en intern kontroll. B, Western blotting vurdere atom NICD uttrykk i H520-dlk1 andH520-pcdb celler. TBP ble anvendt som en intern kontroll. C, et histogram for den relative mRNA uttrykk av Notch målet genet
HES1
i H520-dlk1 og H520-pcdb celler oppdages av real-time PCR-analyse. H520-pcdb celler ble anvendt som en kontroll, og dens ekspresjon nivå på
HES1
ble satt til 1.
18S
ribosomalt RNA ble anvendt som en intern kontroll. D, Western blotting viser uttrykk for NOTCH1 i H1299 celler transfektert med
DLK1 plakater (H1299-dlk1) eller null vektor (H1299-pcdb). GAPDH ble anvendt som en intern kontroll. E, et histogram presenterer den relative mRNA uttrykk for
HES1
i H1299-dlk1 og H1299-pcdb celler oppdages av real-time PCR-analyse. F, uttrykk for NOTCH1 i cytoplasma ble evaluert av Western blotting i A549 celler transient transfektert med
DLK1
siRNA (A549-si-dlk1) eller null kontroll siRNA (A549-NC). GAPDH ble anvendt som en intern kontroll. G, real-time PCR-analyse av den relative mRNA uttrykk for
HES1
i A549-si-dlk1 og A549-NC celler, og presentert i et histogram. Forsøkene ble utført i tre eksemplarer (* t-test, p-verdi 0,05).
DLK1
regulert
MMP9
uttrykk delvis gjennom Notch signalveien
For å finne ut om
DLK1
oppregulert
MMP9
uttrykk i et hakk signalavhengig måte, L-685458 ble brukt, som er en γ-sekretase inhibitor (GSI) som undertrykker NOTCH1 interdomene spalting av γ-sekretase, og dermed hemme Notch signale aktivitet. Den relative uttrykk for
MMP9
under stimulering av
DLK
en uttrykk med eller uten GSI behandling ble analysert ved real-time PCR. Resultatene viste at når Notch signale ble blokkert ved behandling med L-685 458,
DLK1
stimulert
MMP9
oppregulering ble betydelig redusert (figur 4A), noe som indikerer involvering av Notch signalering i denne forskrift prosess. Videre ble det også lagt merke til at selv om Notch signale aktivitet ble undertrykket til et nivå sammenlignbart med en mangel på
DLK1
overekspresjon (merket med
HES1
uttrykk i figur 4B, dlk1 + /GSI + sammenlignet med dlk1 – /GSI +, t-test p-verdi = 0,078), uttrykk for
MMP9
ikke følger den samme trenden, noe som tyder på at
DLK1
kan også regulere
MMP9
uttrykk gjennom signaleoverføringsveier annet enn Notch. Ekspresjonen av
HES1
, som er et mål gen av Notch signalveien, ble evaluert i parallell som en indikator på Notch signale aktivitet (figur 4B).
A, et søylediagram av mRNA uttrykk for
MMP9
oppdaget av real-time PCR i H520 celler med eller uten
DLK1
overekspresjon og med eller uten GSI behandling. Gruppen med verken
DLK1
stimulering eller GSI behandling (dlk- /GSI-) ble brukt som en kontroll, og uttrykket nivået av
MMP9
ble satt til 1.
18S
ribosomalt RNA ble anvendt som en intern kontroll. B, uttrykk for
HES1
evaluert av real-time PCR parallelt med
MMP9
uttrykket vises i et søylediagram som indikerer Notch signale aktiviteter på
DLK1
overekspresjon eller GSI behandling. Forsøkene ble utført i tre eksemplarer (* t-test, p-verdi 0,05).
Diskusjoner
Studier på
DLK1
har avslørt sine funksjoner i celledifferensiering og proliferasjon [5], [6], [10]. Det har også blitt rapportert at
DLK1
er abnormt uttrykt i ulike typer kreft hos mennesker, inkludert ikke-småcellet lungekreft [14], [16], [22], [23]. Disse studiene i kreft hos mennesker hovedsakelig fokusert på unormal uttrykk for
DLK1
men ikke utforske sin tilknytning til kreft metastasering. Vår tidligere arbeid med metastaseassosierte gener i human lunge SCC antydet at
DLK1
kan fungere i metastase (data ikke vist). I denne studien validert vi at overekspresjon av
DLK1
kunne forbedre invasiv evne lungekreftceller (som figur 1 vist), som er konsistent med våre tidligere funn som stammer fra genuttrykk profilering og utvider vår kunnskap om dlk1 funksjon i kreft hos mennesker.
Selv om DLK1 protein mangler DSL motiv, som antas å spille en nøkkelrolle i ligander «interaksjoner med Notch reseptorer, en interaksjon mellom DLK1 og NOTCH1 reseptoren har vært vist i en gjær to-hybrid system [19]. Det er imidlertid fremdeles kontroversiell DLK1 effekt på Notch signalveien [4], [5], [19]. Baladron et al. antydet at effekten av
DLK1
på Notch signalering er forskjellig mellom
DLK1
varianter. Mens utskilt DLK1 kan fungere som en Notch antagonist, kan membranen DLK1 aktivere Notch. Våre funn viser at en blanding av membran og utskilt DLK1 kan aktivere hakk signalering i humane lungekreftceller. Anvendelsen av en blanding av
DLK1
variantene her ble utført i et forsøk på å etterligne situasjoner in vivo. I tillegg til Notch signale aktivering, vi også observert en oppregulering av NOTCH1 uttrykk under stimulering av
DLK1
overekspresjon. Spesielt, aktivering av Notch signalering av
DLK1
kan være en kombinert effekt av oppregulering av NOTCH1 uttrykk og NOTCH1 cleavage stimulert av DLK1 bindende. I tillegg er avvikende ekspresjon av NOTCH1 funnet i ulike typer av kreft hos mennesker [24], [25], inkludert ikke-småcellet lungekreft [26], [27]. Fordi vår studie antyder en regulatorisk sammenheng mellom
DLK1 Hotell og
NOTCH1
, er det naturlig å hypoteser om at den unormale uttrykk for NOTCH1 i kreftformer er delvis en konsekvens av avvikende uttrykk for DLK1.
Vi fant at
DLK1
-promoted invasjon av lungekreft celler var assosiert med oppregulering av MMP9 uttrykk og sin ekstracellulære aktivitet (figur 2), som er involvert i ECM sammenbrudd og sterkt knyttet til tumorinvasjon [ ,,,0],20]. Vi videre undersøkt om Notch signale var involvert i
DLK1
-regulated MMP9 uttrykk ved hjelp av en GSI å blokkere Notch signalering og deretter evaluere responsen MMP9 under stimulering av
DLK1
uttrykk. Vi har observert en signifikant reduksjon i den forhøyede MMP9 uttrykk når Notch signale ble blokkert (figur 4). Interessant, vi også observert at
DLK1
kunne fortsatt moderat oppregulere MMP9 uttrykk når Notch signalveien ble blokkert, noe som tyder på at
DLK1
kan fungere i kreft invasjon i både Notch signaleavhengig og-uavhengig manerer. Til tross for interaksjonen av DLK1 og NOTCH1, har det også blitt rapportert at DLK1 kunne fungere i andre signalveier. For eksempel kan interagere med DLK1 IGFBP1 /IGF-1-komplekser og aktiverer IGF-reseptor-signalisering [6], og kan også øke fosforyleringen av MEK /ERK og aktiverer MEK /ERK-signalisering [28], [29]. Vårt arbeid også foreslått at DLK1 kunne aktivt NF-kB signale (data ikke vist). Tatt i betraktning at signalveier i en celle har betydelig krysstale og at genet transkripsjon er regulert av en kombinasjon av ulike baner, som vi mener er både logisk og doseavhengig, er det ikke overraskende at
DLK1
kunne forbedre celle invasjon gjennom flere veier.
i konklusjonen, de data som presenteres i denne studien viste seg rollen som
DLK1
i kreft invasjon og utforsket den molekylære mekanismen bak denne funksjonen, noe som gjør
DLK1
en ny kandidat genet i kreft metastase studier.
