Abstract
Bakgrunn
Lysine bestemt demetylase 1 (LSD1) har blitt identifisert og biokjemisk karakterisert epigenetikk, men de patologiske roller sin dysfunksjon i lungekreft fortsatt ikke klarlagt. Målet med denne studien var å evaluere den prognostiske betydningen av LSD1 uttrykk hos pasienter med ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) og å definere den eksakte rolle i lungekreft spredning, migrasjon og invasjon.
Metoder
protein~~POS=TRUNC nivåer av LSD1 i kirurgisk resected prøver fra NSCLC pasienter ble oppdaget av immunhistokjemi eller Western blotting. MRNA nivåene av LSD1 ble påvist ved QRT-PCR. Korrelasjonen av LSD1 uttrykk med kliniske karakteristika og prognose ble bestemt ved statistisk analyse. Celleproliferasjon Hastigheten ble bestemt ved MTS-analyse og immunfluorescens. Celle migrasjon og invasjon ble oppdaget av skrapetest, matrigel analysen og transwell invasjon analysen.
Resultater
LSD1 uttrykk var høyere i kreftvev lunge mer enn i normalt lungevev. Våre resultater viste at over-ekspresjon av LSD1 protein var forbundet med kortere total overlevelse av NSCLC. LSD1 ble lokalisert hovedsakelig til kreftcellekjernen. Avbrudd av LSD1 hjelp siRNA eller en kjemisk inhibitor, pargylin, undertrykt spredning, migrasjon og invasjon av A549, H460 og 293T celler. I mellomtiden, over-ekspresjon av LSD1 forbedret cellevekst. Endelig LSD1 ble vist å regulere epithelial-til-mesenchymale overgang i lungekreftceller.
Konklusjoner
Over-uttrykk for LSD1 var assosiert med dårlig prognose i NSCLC, og fremmet tumor celleproliferasjon, migrasjon og invasjon. Disse resultatene tyder på at LSD1 er en svulst fremmende faktor med lovende terapeutisk potensial for NSCLC
Citation. Lv T, Yuan D, Miao X, Lv Y, Zhan P, Shen X, et al. (2012) Over-Expression of LSD1 Fremmer spredning, migrasjon og invasjon i ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE 7 (4): e35065. doi: 10,1371 /journal.pone.0035065
Redaktør: Pan-Chyr Yang, National Taiwan University Hospital, Taiwan
mottatt: 22 november 2011; Godkjent: 11 mars 2012; Publisert: 06.04.2012
Copyright: © 2012 Lv et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er en av de viktigste årsakene til kreft død på verdensbasis. Ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) er den vanligste typen av lungekreft [1]. Den 5-års overlevelse for lungekreft er fortsatt dårlig. For å utvikle mer effektive behandlingsformer, er det viktig å få en bedre forståelse av molekylærbiologi av lungekreft.
Genetiske endringer er et kjennetegn på kreft hos mennesker. I de senere år har kreft genomikk feltet gjort betydelige fremskritt i å identifisere genetiske lesjoner i kreft. Videre har betydningen av epigenetiske endringer som skjer i løpet av lungekreft utvikling også blitt anerkjent [2]. Epigenetiske endringer er assosiert med både DNA-metylering og histonmodifikasjonene [3]. Histonmodifikasjonene, slik som acetylering, fosforylering og metylering, er bryterne som endrer kromatinstruktur for å tillate posttranskripsjonelt aktivering eller represjon av nedstrøms-proteiner [4]. Forstå disse epigenetiske endringene vil identifisere nye kreftrelaterte gener som kan representere attraktive mål for kreftbehandling og gi ny innsikt i biologi av lungekrefttilfellene. Dermed en integrerende tilnærming i lungekreft forskning, kombinere epidemiologisk, genetisk og epigenetisk informasjon, har dukket opp som et viktig begrep for kreftbehandling [5].
metylering status for histone metyltransferaser og histone demethylases spiller en sentral rolle i reguleringen av genekspresjon [6]. Histon demetylase lysin spesifikk demetylase 1 (LSD1), den første histon-demetylase som ble oppdaget som en kjernefysisk homolog av aminoksydaser, fjerner metylgrupper fra mono- og dimethylated Lysin (Lys) 4 av histon H3 (H3K4me1 /2) og Lys9 av histon H3 (H3K9me1 /2) [7]. LSD1 er essensielt for utvikling av pattedyr og er involvert i mange biologiske prosesser, slik som celletype differensiering og genaktivering og undertrykkelse [8]. En fersk studie viste at LSD1 kan fremme cellefaseovergangen (mangel på LSD1 førte til delvis cellesyklus arrest i G
2 /M) og celleproliferasjon, noe som tyder på at det er over-uttrykk kan fremme tumorigenesis [9]. Ekspresjonen av LSD1 har vært forbundet med tumorresidiv under behandling av forskjellige krefttyper, ytterligere impliserer LSD-en som en svulst promoter [10] – [12]. Tissue cDNA microarray analyse avslørte også LSD1 trans i lunge og kolorektal karsinom [11]. Banket ned av LSD1 med små interfererende (SI) RNA resulterte i undertrykkelse av spredning av ulike blære- og lungekreft cellelinjer [11]. Imidlertid, selv om disse studiene viser at LSD1 kan være forbundet med patogenesen av lungekreft, er uttrykket og betydningen av LSD1 i NSCLC uklart.
I denne studien ble det forsøkt å undersøke ekspresjon og funksjon av LSD1 i NSCLC, sitt forhold til clinicopathological funksjoner, og dens prognostisk verdi for overlevelse av pasienter med NSCLC. Til slutt, vi også sikte på å fastslå den eksakte rolle LSD1 i lungekreft spredning, migrasjon og invasjon.
Materialer og Metoder
Pasienter og Prøvene
Kirurgiske prøver fra 80 NSCLC pasienter som oppnås ved Chest Hospital Nanjing og Jinling Hospital fra januar 2001 til desember 2003 ble retrospektivt samlet for studien. Disse besto av 38 plateepitel karsinom og 42 adenokarsinomer, sammen med pasient matchet tilstøtende ikke-tumor vevsprøver. Ingen av pasientene hadde fått strålebehandling eller kjemoterapi før operasjonen. Alle pasientene hadde blitt fulgt opp i fem år etter operasjonen, og komplette kliniske data ble elektronisk registrert. Alle tumorvev ble klassifisert i henhold til Verdens helseorganisasjons retningslinjer for klassifisering. Iscenesettelsen av svulstene fulgte 7
th Union International Classification ved Kreft kriterier definert i 2009. Denne studien ble godkjent av etisk komité i Jinling Hospital i Nanjing. Alle prøver ble anonymisert, og ingen av forskerne gjennomføre forsøkene hadde tilgang til clinicopathological data.
Immunhistokjemisk (IHC) Farging
Alle prøvene ble fiksert i 10% formalin, innstøpt i parafin, kåret etter hverandre på 5 um, og farget med hematoxylin og eosin. Seksjonene ble deparaffinized og rehydrert i henhold til rutine protokollen. Seksjonene ble inkubert i natten med de spesifikke primære LSD1 antistoffer (1:100 fortynning, Cell Signaling, Danvers, MA, USA). Platene ble inkubert i 30 minutter med geite-anti-kanin immunoglobuliner (E0432, cellesignalisering) etter å ha blitt vasket med Tris-bufret NaCl-løsning. Platene ble deretter inkubert i 30 min med strippet AB kompleks /AP (K0391, Dako, Peking, Kina). Kontra ble utført med hematoksylin. Prosentandelen av positive celler ble bestemt ved telling av 500 celler i fem tilfeldige områder avdeling. Nukleære immunofarging resultater for LSD1 ble evaluert ved anvendelse av en semi-kvantitativ Remmele scoring system [13], som beregnet fargeintensitet og prosentandelen av positive celler. IHC-farging ble bedømt i henhold til de følgende kriterier: -, ingen av celler farget; +, 1-40% av cellene farget; ++; 40-70% av cellene farget; +++, 70-100% av cellene farget. IHC score på LSD1 uttrykk var [0 (negativ) ≤ poengsum 2+] og [2 + ≤ poengsum ≤3 +], som representerte lav og høy uttrykk, henholdsvis.
Western blotting
lungekreft tumorvev og tilstøtende ikke-tumorvev ble homogenisert . Total proteiner (30 ug) fra kliniske prøver, eller cellekulturer ble separert ved natriumdodecylsulfat-polyakrylamid-gel-elektroforese, etterfulgt av Elektro-til en nitrocellulosemembran ved anvendelse av en overføring celle (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Western blotting ble utført ved sekvensiell inkubasjon i 5% ikke-fettholdig melk blokkerende buffer ved romtemperatur i 60 minutter, fulgt av primært antistoff mot enten LSD1 (1:500, cellesignalisering), AcH3K9, Twist1, E-cadherin, N- cadherin eller β-aktin ved 4 ° C over natten, og til slutt pepperrot peroksidase-konjugert anti-kanin-sekundært antistoff (1:5000) ved romtemperatur i 90 min. Immunreaktive bånd ble påvist ved reaksjon med ECL deteksjonssystemet reagenser (Amersham, Arlington Heights, IL, USA) og eksponering for røntgenfilm, som ble utviklet og fotografert.
mRNA Utvinning og kvantitativ revers transkripsjon ( QRT) -PCR
vev ble homogenisert og total cellulær mRNA ble isolert ved hjelp av TRIzol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). CDNA ble transkribert ved bruk av M-MLV revers transkriptase (Promega, Madison, WI, USA), i henhold til produsentens protokoll. QRT-PCR ble utført ved hjelp av Faststart Universal SYBR Grønn Master Mix kit (Roche, San Francisco, CA, USA). Relative mRNA nivåer av LSD1 ble normalisert til nivåer av husholdningsgenet GAPDH og beregnet av to-ΔΔCt metoden. De følgende primere ble anvendt: GAPDH, fremover: 5′-CCATGTTCGTCATGGGTGTGAACCA-3 «og omvendt: 5′-GCCAGTAGAGGCAGGGATGATGTTG-3′; LSD1, fremover: 5»-GAAACTGGAATAGCAGAGAC-3 «og omvendt: 5′-GGTGGACAAAGCACAGTATCA-3».
Cell Culture, Transfeksjon og behandling
A549, H460 og 293T celler ble hentet fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) og dyrket i RPMI-medium supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin og 100 mikrogram /ml penicillin /streptomycin. Plasmidet Flag-LSD1 (3ug); vennlig levert av Dr. Yang Shi, University of Southern California, Los Angeles, CA, USA), over-uttrykk plasmid LSD1 (3 mikrogram) og LSD1 siRNA (3 mikrogram) ble transfektert inn i A549 og H460 cellelinjer i 6-brønners plater (1 mg /ml) ved anvendelse av Lipofectamine-reagens (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. Pargylin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), en monoaminoksidase-inhibitor, ble anvendt for kjemisk å blokkere LSD1-mediert demetylering [14]. Celler ble behandlet med pargylin i 48 timer, og deretter ble utsatt for MTS analysen. Dataene presenteres som brette endringer i relative lette enheter /millienheter pargyllin, og representerer gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter.
Cell Proliferation, vekst, MTS Analyser
For cellevekstanalyse, 50.000 celler /brønn ble sådd ut i triplikat i en 24-brønns plate med komplett vekstmedium. Cellene ble telt over seks dager ved hjelp av en hemocytometer. For MTS assay (Promega), 500 celler /brønn ble sådd ut i triplikat i en 96-brønns plate for hver cellelinje. Ved 12, 24 og 48 timer ble 20 ul av MTS-reagens tilsatt til hver brønn, inkubert i 1 time ved 37 ° C, og resultatene ble analysert ved hjelp av en plateleser ved 490 nm. Prøven data ble normalisert til bakgrunnsavlesninger av media bare.
Tredimensjonal Cell Culture, Collagen Invasion analysen, og Scratch analysen
Tredimensjonal basalmembran kulturer ble etablert som tidligere beskrevet [15 ]. I korthet, 5000 celler /brønn ble dyrket i 2% matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) med epidermal vekstfaktor (EGF) på en 50% matrigel basislaget. Kollagen invasjonen analysen ble utført som tidligere beskrevet [16]. I korthet, 5000 celler /brønn ble sådd ut i 2% matrigel på et lag av kollagen 01:01 (BD Bioscience) til matrigel blanding. Kulturveksten ble registrert på dag 5. For scratch-analyse ble celler dyrket i fullstendig vekstmedium til 90-100% konfluens var nådd. En 3 mm sår ble innført på tvers av diameteren av hver plate. Cellemigrering ble observert ved mikroskopi etter 24 og 48 timer senere.
A, B) LSD1 ekspresjon ble oppregulert i lunge squamous kreftvev. Pilene angir LSD1-positive cancerceller, som ble lokalisert i cellekjerner. Forstørrelse: A, × 20; B, × 60. (C, D) LSD1 ekspresjon ble oppregulert i lunge adenokarsinom kreftvev. Forstørrelse: C × 20; D, × 60. (E, F) IHC viste at LSD1 ekspresjon var svakt i normalt lungevev. Forstørrelse: E, × 20; F, × 60. IHC score til LSD1 uttrykk var: lav, [0 (negativ) ≤ poengsum 2+]; høy, [2+ ≤ poengsum ≤3 +].
P
. 0,05 indikerte statistisk signifikante forskjeller mellom gruppene
(A) Proteininnholdet av LSD1 i kreftvev lunge var betydelig høyere enn i normalt vev (
P
0,01), som oppdaget av Western blot. β-tubulin ble anvendt som en kontroll lasting. (B) Eksempel 122, 206 og 207 er vist som representanter for de tre grupper: N, normal lunge vev: C, NSCLC vev; P, paracarcinoma vev. (C) Et mRNA-nivået av LSD1 ble påvist ved QRT-PCR, og mRNA-ekspresjon av LSD1 var signifikant høyere i svulstvev enn i normalt vev (
P
0,05).
Blå linjer viser høye nivåer av LSD1 uttrykk, og røde linjer viser lave nivåer av LSD1 uttrykk i NSCLC prøvene. (A) NSCLC pasienter med lavere LSD1 protein nivåer hadde bedre prognose. (Ujustert
P
verdi = 0,0003; lave uttrykk tilfeller, n = 52 og høye uttrykk tilfeller, n = 28). (B) Pasienter med lavere mRNA nivåer av LSD1 hadde også lengre overlevelse (
P
0,05).
Statistical Analysis
Student
t
-Test og ANOVA ble brukt for å undersøke sammenhenger mellom LSD1 uttrykk og kliniske faktorer (alder, kjønn, røyking, tumor stadium, histologi, tumor størrelse, lymfeknutestatus, og total overlevelse). Pearsons korrelasjonsanalyse ble anvendt for å vurdere graden av lineær korrelasjon mellom to variabler. Kaplan-Meier overlevelsesanalyse ble utført for å bestemme den prognostiske verdien av LSD1, og log-rank test ble brukt for å sammenligne likheten av to overlevelseskurver. En
P
-verdi 0,05 ble ansett som statistisk signifikant og
P
0,01 ble vurdert som svært viktig. Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av SPSS programmet v17.0 for Windows (SPSS, Chicago, IL, USA).
Resultater
LSD1 Expression ble oppregulert hos NSCLC tumorvev
Vi først undersøkt uttrykk nivåer av LSD1 i 80 NSCLC tumorvev og 20 normal lunge vev ved IHC farging. Høy LSD1 ekspresjon ble påvist i kjernen av maligne celler, mens svak farging ble observert gjennom de ikke-neoplastiske vev (Fig. 1). Nærmere bestemt, ble ekspresjonen av LSD1 observert hos 90,0% av lungekarsinomer (72/80) og 10,0% av benigne lunge prøver (2/20). Høye nivåer av LSD1 uttrykk (Poeng: ++ – +++). Ble påvist hos 37 (46,3%) tumorvev fra NSCLC pasienter
Vi neste undersøkt LSD1 uttrykk i 40 tilfeldig utvalgte NSCLC tumorvev, paracarcinoma lunge vev og normalt lungevev ved hjelp av Western blotting. Resultatene viste en statistisk signifikant økning av LSD1 ekspresjon i tumorer, sammenlignet med de normale lungevevet ved hjelp av β-tubulin som referanse (to-halet sammenkoblet
t
-test er n = 40,
P
0,01) (figur 2A).. Proteininnholdet av LSD1 i prøvene 122, 206 og 207 er vist i figur 2B.
For ytterligere å bekrefte de ovenfor angitte protein resulterer, vi også undersøkt mRNA-nivåene av LSD1 i disse 40 utvalgte NSCLC tumorvev og normal lungevev etter QRT-PCR ved bruk av GAPDH som referanse. Vi fant at mRNA nivået av LSD1 i kreftvev (Ct = 19,9 ± 1,01) var signifikant høyere enn i normalt lungevev (Ct = 22,1 ± 0,9) (to-halet sammenkoblet
t
-test, n = 40,
P
0,05) (figur 2C)
LSD1 Expression var assosiert med Total overlevelse
for å evaluere den kliniske betydningen av LSD1 over-uttrykk i.. lungekreft, analyserte vi om uttrykket nivåer av LSD1 var assosiert med total overlevelse i NSCLC. Som vist tabell 1, ble høyt proteinnivå LSD1 signifikant assosiert med overlevelse (χ
2 = 12,87,
P
= 0,0003), men ikke korrelert med noen av de clinicopathologic egenskaper (inkludert alder, røykevaner , sex, tumor diameter, histologisk type visceral pleura invasjon, patologisk stadium, eller type operasjon, alt,
P
0,05). I løpet av fem-års oppfølgingsperiode, 52 av 80 (65%) NSCLC pasienter døde som følge av sykdomsprogresjon. Kaplan-Meier-kurver indikerte at pasienter med økt LSD1 uttrykk (28 tilfeller) hadde en betydelig kortere total overlevelse enn de med nedsatt LSD1 uttrykk (52 tilfeller) (
P
= 0,0003) (fig. 3A).
uttrykk for LSD1 i A549 og H460 lungekreft celler var høyere enn i 293T celler. Proteinnivået i H460-cellelinjen var høyere enn i A549-cellelinjen. β-aktin ble benyttet som kontroll lasting.
serie av kurver representerer celleproliferasjonen ved 0 timer til 48 timer etter eksponering for forskjellige konsentrasjoner av pargylin behandling og transfeksjon med de forskjellige plasmider. (A) LSD1 inhibitor, pargylin (fra topp til bunn: 1 mM, 2 mM, 3 mM og 4 mM), og LSD1 siRNA hemmet proliferasjonen av A549-cellelinjen. Den A549-celleformering ble signifikant redusert i de forskjellige gruppene, sammenlignet med kontrollene (*
P
0,05). (B) pargylin hemmet H460 cellelinje overlevelse. Dessuten ble en sterkere inhiberende virkning observert i H460-cellelinjen, men det var ingen signifikant forskjell mellom de to cellelinjer. Den H460 celleformering ble signifikant redusert i de forskjellige konsentrasjonsgruppene, sammenlignet med kontrollene (*
P
0,05). (C) pargylin hemmet overlevelsen av 293T cellelinje. (D) Spredning kurve etter transfeksjon av Flag-LSD1 plasmid inn i A549 cellen og transfeksjon av LSD1 siRNA plasmid inn i H460 cellen. I A549-celler, spredning var betydelig høyere etter transfeksjon av flagget-LSD1 plasmid, sammenlignet med den pCMV5-transfekterte kontroll (*
P
0,05). I H460-celler, var den signifikant lavere spredning etter transfeksjon av LSD1 siRNA plasmid, sammenlignet med celler transfektert med plasmid siRNA kontroll (*
P
0,05).
bildene vises på × 20 forstørrelse. Grønn, rød og blå fluorescens representerer LSD1, BrdU og Topro-3, henholdsvis. Utbredelsen betydelig økt i A549 celler etter transfeksjon av Flag-LSD1 plasmid. Imidlertid redusert proliferasjon i H460-celler etter transfeksjon av LSD1 siRNA plasmidet. Pargylin behandling redusert proliferasjon i begge cellelinjer. TOPRO-tre flekker viser kjernefysiske lokalisering, og BrdU flekker viser prolifererende celler.
migrasjon hastigheten gradvis redusert fra 6 timer til 48 timer etter transfeksjon av LSD1 siRNA plasmid i H460-celler, som ble signifikant forskjellig fra hastigheten på 24 timer og 48 timer (*
P
0,05). Migrasjonen hastigheten gradvis økt etter transfeksjon av Flag-LSD1 plasmid inn i A549 celler, som var signifikant forskjellig fra hastigheten på 24 timer og 48 timer (*
P
0,05). Alle transfeksjon gruppene var signifikant forskjellig fra kontrollgruppene (*
P
0,05).
I overensstemmelse med dette, vi også bestemt at høyere mRNA uttrykk for LSD1 var assosiert med redusert total overlevelse hos NSCLC pasienter (
P
0,05). (.. figur 3B)
LSD1 Fremmes spredning i Lung Cancer Cell Lines
uttrykk for LSD1 ble lavere i A549 cellen enn i H460-cellelinjen, som vist i figur 4. Derfor ble Flag-LSD1 plasmidet transfektert inn i A549 celler og den LSD1 siRNA plasmidet ble transfektert inn i H460-celler. De 293T normale epitelceller ble anvendt som en negativ kontroll.
Vi oppdaget OD-verdien av A549, H460 og 293T-celler ved MTS til å generere cellevekstkurver. I alle tre cellelinjer, falt den cellulære proliferering sammen med pargylin behandling på en konsentrasjonsavhengig måte. Det var særlig lavere i 4 mM-behandlede gruppen enn i o 1 mm- eller 2 mM-behandlede grupper. I tillegg var det også lavere i 1 mM-behandlede gruppen enn i de tre mM-behandlede gruppe; imidlertid var det ingen forskjell mellom en mm- og 2 mM-behandlede grupper eller 3 mm- og 4 mm-behandlede grupper (
P
0,05)., som vist i figur 5A-C
transversed celle beløpet var betydelig høyere for A549 celler transfektert med flagget-LSD1 plasmid; imidlertid transfeksjon av LSD1 siRNA plasmid inn i H460 celler førte til redusert mengder invasive celler. Antallet invasive celler fra begge transfeksjonsteknologier gruppene var signifikant forskjellig fra kontrollgruppen (*
P
0,05).
uttrykk for total H3K9 endret seg ikke bemerkelsesverdig. Når LSD1 aktiviteten var oppregulert, økt Twist1 og N-cadherin uttrykk og AcH3K9 og E-cadherin uttrykk redusert. Når LSD1 aktivitet ble nedregulert, Twist1 og N-cadherin uttrykk redusert og AcH3K9 og E-cadherin uttrykk økt. Den Flag-LSD1 plasmid ble transfektert inn i A549-cellelinjen, og den LSD1 siRNA plasmidet ble transfektert inn i H460-cellelinjen. β-actin ble brukt som lasting kontroll
Spredning betydelig økt i A549 gruppen etter transfeksjon av Flag-LSD1 plasmid (
P
0,05).; Men det betydelig redusert i H460 gruppen etter transfeksjon av LSD1 siRNA plasmid (
P
0,05). Den pCMV plasmidet ble anvendt som kontroll i det A549 transfeksjon gruppe, og den LSD1 siRNA styre plasmid ble anvendt i det H460 celle transfeksjon gruppe (fig. 5D).
Vi identifiserte ytterligere rolle LSD1 i A549 og H460 celleproliferasjon ved immunfluorescens farging. Endringen i antall prolifererende celler ble observert ved BrdU farging. Resultatene viste at celleformering ble signifikant økt etter transfeksjon av de over-uttrykke LSD1 plasmid inn i A549-cellelinjen. I mellomtiden ble redusert celleproliferasjon i H460-celler transfektert med den LSD1 siRNA plasmidet. Det ble redusert i begge cellelinjene etter pargyllin behandling, som vist ved immunfluorescens farging (Fig. 6), som også bekreftet at LSD1 er involvert i tumorcellevekst.
LSD1 fremmet Migrering av lungekreft celler
celle~~POS=TRUNC migrering~~POS=HEADCOMP ble undersøkt ved cellen scratch-analysen. Sammenlignet med kontrollgruppen, var antallet og frekvensen av migrerte celler gradvis reduseres etter transfeksjon med plasmid LSD1 siRNA i H460-cellelinjer. De migrerende cellene nådde en topp etter 48 timer, som vist i figur 7A. I motsetning til dette, ble antallet migrerte celler signifikant økt i A549-cellelinjen etter transfeksjon med flagg-LSD1 plasmid, sammenlignet med kontrollgruppen (
P
0,05). Den relative hastigheten på migrering er vist i figur 7B.
The Role of LSD1 i Lung Cancer Invasion
Evnen til cellene til å krysse matrigel indikerte invasivitet av A549 og H460 cellelinjer. H460-celler transfektert med plasmid LSD1 siRNA var mindre inngrep enn kontrollgruppen (
P
0,05). A549-celler transfektert med flagg-LSD1 plasmid var mer omfattende enn kontrollceller og celler behandlet med pargylin (begge,
P
0,05). Mengden av invadere celler krysser gjennom matrigel basalmembran er vist i figur 8.
LSD1 regulert epithelial-til-mesenchymale Transition (EMT) i lungekreft celler
For å undersøke om LSD1 regulerer EMT overgang i lungekreftceller, undersøkte vi uttrykket av nøkkelen EMT transcriptional repressor TWIST1 og EMT markører E-cadherin og N-cadherin i LSD1-over-uttrykke A549 celler (transfektert med flagg-LSD1 LSD1 over-uttrykker plasmid) og LSD1 slått ned H460 celler (transfektert med LSD1 siRNA plasmid, eller behandlet med 4 mM pargyllin). Virkningene på H3K9, AcH3K9, Twist1, E-cadherin og N-cadherin uttrykk indusert ved endring av LSD1 aktivitet ble undersøkt. Mens uttrykk for total H3K9 var upåvirket, LSD1 over-uttrykk førte til nedgang i H3K9 acetylering og E-cadherin uttrykk og øker i Twist1 og N-cadherin uttrykk. I mellomtiden ble H3K9 acetylering nivåer og E-cadherin ekspresjon økes i LSD1 knock down-celler, noe som antyder at LSD1 ekspresjon kan bli korrelert med AcH3K9, Twist1, E-cadherin og N-cadherin uttrykk, slik som vist i figur 9.
diskusjon
i de senere årene har epigenetikk blitt et hett tema i kreftforskning. Balansen av metylering og demetylering i epigenetisk modifikasjon påvirker genekspresjon og cellulær aktivitet. Studier har vist at avvikende histon lysin metylering i kreft er assosiert ikke bare med undertrykkelse av kromatin relatert til spesifikke gener, men også med undertrykkelse av store kromosomale regioner. Epigenetiske forandringer i LSD1 har vist seg å spille en nøkkelrolle i kreftutvikling [17]. LSD1 kan hindre opphopning av dimetylderivatene grupper av p53, undertrykke p53-mediert transcriptional oppregulering, hindrer apoptose, og bidra til menneskelig kreft via en kromatin modifisering mekanisme.
Til dags dato, bare noen få studier har implisert LSD1 i NSCLC. Hayami
et al.
Vist at LSD1-spesifikke sirnas signifikant slått ned LSD1 ekspresjon og resulterte i trykkes spredning av forskjellige lungekreftceller [11]. Men sammenhengen mellom LSD1 og overlevelse av NSCLC pasienter ble ikke godt definert, og rollen til LSD1 i spredning, migrasjon og invasjon i NSCLC var uklar. Vår studie undersøkte sammenslutninger av LSD1 uttrykk og kliniske trekk ved NSCLC pasienter diagnostisert som stadium I /II. For å demonstrere at epigenetiske endringene var assosiert med genetiske endringer i lungecancer, vi først undersøkt ekspresjonen av LSD1 i NSCLC-kliniske prøver.
Tidligere studier har vist at LSD1 protein og mRNA-nivåer kan fungere som biomarkører for pasientene med mer aggressive tumorer i bryst kreft, prostatakreft, og neuroblastom [18] – [20]. I vår studie, vi har oppdaget LSD1 av IHC analyse, Western blotting, og QRT-PCR. En sterk poenget med denne forskningen er funn som uttrykk for LSD1 var signifikant korrelert med total overlevelse av NSCLC pasienter. Vår nåværende forskning undersøkt hvilken rolle LSD1 i NSCLC. Videre studier på LSD1 i andre krefttyper kan avsløre at pasienter med høyere nivåer av LSD1 (uavhengig av mRNA eller protein og /eller uavhengig av primær tumortype) har dårligere overlevelse enn pasienter med lavere nivåer av LSD1.
videre demonstrert at LSD1 var viktig for kreftcelleformering og invasjon. LSD1-indusert aktivering av proliferasjon, migrering og invasjon i tumorcelle ble inhibert av pargylin. Nedregulering av ekspresjon av LSD1 siRNA i tumorcellelinjer førte til økt cellevekst, migrering og invasjon. Disse data antyder at LSD1 kan påvirke transformasjon av tumorceller, og kan også fremme EMT i lungen epitel. Ytterligere forskning må utføres for å bestemme hvorvidt overekspresjon av LSD1 er en tidlig eller sen hendelse i lunge tumorigenese og hvilken mekanismen av over-ekspresjon er. Vi har presentert data som antyder at LSD1 er oppregulert i lungecancer tumorvekst-reaksjonsveien, og at den virker til å øke cellevekst, migrering og invasjon, og for å gjenopprette en transformert fenotype epitel. Farmakologisk undertrykkelse av LSD1 kan representere en lovende metode for NSCLC behandling.
Videre funksjonell analyse er nødvendig for å fastslå den regulatoriske nettverk av LSD1. Transkripsjonell analyse viste at LSD1 /Nurd komplekser regulere flere cellulære signalveier [21], inkludert TGFβ1 signalveien som er kritisk involvert i celle spredning, overlevelse, og epitelial til mesenchymale overgang. Vi viste at LSD1 fremmet invasjonen og metastatisk potensial av lungekreftceller
in vitro
. Vi fant også at LSD1 er oppregulert i lungekarsinom og at nivået av uttrykket er negativt korrelert med at av AcH3K9, Twist1 og N-cadherin og positivt korrelert med at av E-cadherin. Våre data gir et molekylære grunnlaget for samspillet mellom histone deacetylering i kromatin remodeling, noe som indikerer at LSD1 kan påvirke EMT og acetylering av H3K9.
Den avvikende over-uttrykk for LSD1 i lungekreft kan gjøre det en god kandidat som et terapeutisk molekylære mål [11]. Denne type informasjon indikerer også at vi bør fortsette utviklingen av romanen kreftbehandling basert på epigenetisk status. Som det har implikasjoner for oppdagelsen av epigenetiske markører, et viktig spørsmål å løse er hvordan man skal definere potensielle mål for epigenetisk terapi. Første generasjon legemidler rettet mot de relativt promiskuøse DNA metylering og histone acetylering modifikatorer har hatt suksess i behandling av hematologisk kreft [22]. Hvis LSD1 hemming fører til betydelig de-undertrykkelse av noen gener, kan LSD1 være et viktig alternativ mål for terapi. Epigenetisk kontroll av genregulering er et felt i rask utvikling med betydelig potensial, og onkologi er sannsynlig å være terapeutisk anvendelse der den raskeste fremgangen er gjort. Hittil har syntetiske hemmere av klassiske histone deacetylases blitt mye brukt som biologiske verktøy for epigenetiske studier, og noen har avansert til kliniske studier. I tillegg har utviklingen av histon-metyltransferase og demetylase inhibitorer nylig blitt rapportert [21], [23]. I lungekreft, over-ekspresjon av LSD1 skal bidra til undertrykkelse gen for å hemme cellevekst og progresjon ondartet, men hvor det er en faktisk Formålet med LSD1 fortsatt ukjent. Vi planlegger å undersøke dette i fremtidige studier.
I konklusjonen, fant vi at LSD1 var over-uttrykt i NSCLC pasienter, gjennom tidlig til sene stadier av kreftutvikling. LSD1 er til stede i kjernen og fremmer proliferasjon, eventuelt gjennom regulering av en lang rekke av kromatin funksjoner. I mellomtiden, over-ekspresjon av LSD1 fremmes tumorcelle-proliferasjon, migrering og invasjon. Ytterligere validering med funksjonelle analyser av dette proteinet i sammenheng med menneske karsinogenese kan bidra til utvikling av nye terapeutiske strategier for lungekreft.
