Abstract
Kreft er fortsatt en ledende dødsårsaken i verden og totalt antall tilfeller globalt er økende. Nye behandlingsstrategier er derfor desperat nødvendig for radikal behandling av kreft og lang overlevelse av pasienter. En ny teknologi ved hjelp av høy pulserende elektrisk felt har kommet ut av militær bruk i biologi og medisin ved å bruke nsPEF som et middel for å hemme kreft. Men molekylære mekanismer for nsPEF på svulster eller kreft er fortsatt uklart. I denne artikkelen har vi funnet at nsPEF hatt omfattende biologiske effekter i kreft, og avklares dens mulige molekylære mekanismer
in vitro Hotell og
in vivo
. Det kunne ikke bare indusere celle apoptose via avhengig-mitokondrier indre apoptose bane som ble utløst av ubalansen av anti eller pro-apoptose-Bcl-2-familieproteiner, men også inhibere celleproliferasjon gjennom undertrykke NF-kB signalveien for å redusere uttrykk for cyklin proteiner . Videre nsPEF kan også inaktivere metastaser og invasjon i kreftceller ved å undertrykke Wnt /β-catenin signalveien til å nedregulere uttrykk for VEGF og MMP familie proteiner. Enda viktigere, nsPEF kunne fungere sikkert og effektivt som et anti-kreftterapi ved indusering av tumorcelle-apoptose, ødelegge tumor mikromiljøet, og trykke angiogenese i tumorvev
in vivo
. Disse funnene kan gi en kreativ og effektiv terapeutisk strategi for kreft
Citation. Ren Z, Chen X, Cui G, Yin S, Chen L, Jiang J et al. (2013) nanosekund Pulsed elektrisk felt hemmer kreft vekst Fulgt av Endring i uttrykk av NF-kB og Wnt /β-catenin signalmolekyler. PLoS ONE 8 (9): e74322. doi: 10,1371 /journal.pone.0074322
Redaktør: Irina U Agoulnik, Florida International University, USA
mottatt: Mai 10, 2013; Akseptert: 25. juli 2013, Publisert: 17.09.2013
Copyright: © 2013 Ren et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National S T Major Prosjekt of China (2012ZX10002-017, 2012ZX10002-004), NSFC for Innovative Research Group of China (81121002), Zhejiang Medical Research Funding (2008B079, LY13H180003), SRF for rocs, SEM (J20120279 ), og Xinjiang Science and Technology Bureau Project (2013911131). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft er fortsatt en ledende dødsårsaken i verden og sto for 7,6 millioner dødsfall (rundt 13% av alle dødsfall) i 2008 i henhold til WHO, og dødsfall fra kreft er anslått å stige til over 11 millioner kroner i 2030 [ ,,,0],1]. En betydelig andel av kreft kan kureres ved kirurgi, strålebehandling eller kjemoterapi, spesielt hvis de blir oppdaget tidlig. Men kan noen typer kreft ikke bli oppdaget i tidlig fase og har liten respons på strålebehandling og kjemoterapi, og dermed pasienter med slike kreftformer har en dårlig prognose. For eksempel har kreft i bukspyttkjertelen ca. 23% 1-års overlevelse etter diagnose og 5% 5 års overlevelse på beste [2]. Videre var det anslagsvis 43,140 nye tilfeller og 36, 800 dødsfall som følge av kreft i bukspyttkjertelen i USA [3,4]. Det er viktig å søke etter en ny terapi teknikk for å forbedre prognose og overlevelse av kreftpasienter.
En ny teknologi ved hjelp av høy pulserende elektrisk felt har kommet ut av militær bruk i biologi og medisin ved nanosekund puls elektrisk felt søknad (nsPEF ) som et middel for å inhibere kreft [5]. De viktigste kjennetegn ved nsPEF er dens høy effekt og lav energi fører til svært lite varme produksjon og sin spesielle evne til å trenge inn i cellen for å påvirke intracellulære organeller [6,7]. Ganske forskjellig fra klassisk plasmamembran elektroporering kan nsPEF produsere svært komprimert strøm (milliarder av watt), ultra korte pulsvarighetene (nanosekund), rask økning ganger (nanosekund) og høye elektriske felter (kV /cm). Den resulterende nanosekunders puls kan trenge inn i cellen før plasmamembran er fullstendig ladet slik at nsPEF å ha minimal innvirkning på plasmamembranen således ikke forårsaker elektroporasjon [8]. Siste årene, studier har blitt gjort for å fastslå effekten av nsPEF i eksperimentelle og modell forskere. Resultatene viste at nsPEF kan indusere apoptose i ulike kreftcellelinjer
in vitro product: [9,10] og et fibrosarkom svulst
ex vivo product: [7], og utrydde B16F10 melanom svulst
in vivo product: [11,12,13]. Men molekylære mekanismer av biologiske effekter av nsPEF på svulster eller kreft er fortsatt uklart.
I denne forskningen, søkte vi å undersøke anti-kreft effekt av nsPEF og dens mulige molekylære mekanismer gjennom
in vitro
og
in vivo
eksperimenter. Her viste vi at nsPEF kan hemme kreft vekst
in vitro Hotell og
in vivo
via indusere apoptose, hemmer spredning, inaktivere invasjon og metastasering, og ødelegge svulstens mikromiljø, som vil gi en roman og effektiv terapeutisk strategi for kreft.
Materialer og metoder
celle~~POS=TRUNC kultur~~POS=HEADCOMP
Humant pankreatisk karsinom-cellelinje (PANC-1) og HCC cellelinje (Hep-3B) var kjøpt fra Cell Bank of Chinese Academy of Science (Shanghai, Kina). Begge cellelinjer ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM, Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS, SAFC Biosciences, Lenexa, KS, USA), 100 enheter /ml penicillin og 100 mg /ml streptomycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA).
Induksjon av celledød ved nsPEF
Som vår forrige beskrivelse [11], nsPEF generator med varighet på 100 -ns ble vist i figur S1. Elektriske felt varierte fra 20 kV /cm til 60kV /cm. Bølgeformer ble overvåket med en digital fosfor oscilloskop (Figur S1 A B, DPO4054, Tektronix, USA) utstyrt med en høy spenning sonde (P6015A, Tektronix, USA). PANC-1-celler ble høstet med trypsin og re-suspendert i friskt DMEM-medium med 10% FBS til en konsentrasjon på 5,0 x 10
6 celler /ml. 500 ul av cellesuspensjonen ble plassert i en kuvette 0.1cm gap (fig S1 C, Biosmith, aluminium plate-elektroder) og eksponert for 100 pulser på 0, 20, 40 og 60 kV /cm elektrisk feltstyrke respektivt. Mesteparten av påvisninger av celle responser ble utført på 1t etter behandling, hovedsakelig blant transwell analysen, celle TEM, DNA ladder analysen, celle TUNEL analysen, flowcytometri og western-blot. Celleviabilitet og proliferativ inhibering hastighet ble målt ved forskjellige tidspunkter etter behandling for å observere en gradvis aktiv prosess. Hele Eksperimentene ble gjentatt tre ganger.
Måling av cellelevedyktighet og proliferative inhiberingsraten
PANC-1-cellene ble utsatt for nsPEF og ble så dyrket. 2 x 10
5-celler ble utsatt for nsPEF med forskjellige intensiteter, og deretter dyrket til 0, 0,5, 1, 2, 24 og 48 timer henholdsvis. Cellene ble trypsinert og levedyktige celler ble tellet med en cellelevedyktighet analysator (Vi-celle, Backman). Etter inkubasjon i 24, 48 og 72 timer henholdsvis, ble cellene beregnes ved Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan) i henhold til produsentens instruksjoner, som gjenspeiler celle proliferativ hemming.
påvisning av cellemetastase og invasjon evne med transwell-analyse
i 1 t etter nsPEF behandling ble de behandlede overlevelses cellene ved det samme antall erholdt for å utføre Transwell analyser basert på Transwell kamre (Millipore, USA), som reflekterer cellemetastase og invasjon evne, slik som tidligere beskrevet [14].
Observasjon av celleultrastruktur med TEM
i 1 t etter nsPEF behandling, de behandlede celler ble oppnådd og fiksert med 2,5% glutaraldehyd for å observere celle ultrastructure av transmisjonselektronmikroskopi (TEM) i Imaging Facility av kjernefasiliteter, Zhejiang University School of Medicine, som tidligere beskrevet [15].
Bestemmelse av DNA-fragmentering med DNA ladder analysen
på en h etter nsPEF behandling, ble de behandlede cellene innhentet for å undersøke celle DNA fragmentering av DNA stigen analyse i henhold til produsentens instruksjoner som beskrevet tidligere [11].
Måling av encellede apoptose med TUNEL analysen
i 1 t etter nsPEF behandling ble de behandlede celler oppnådd for å bestemme enkeltcelle-apoptose ved hjelp av analysen av TdT-dUTP Nick-terminal ende merking (TUNEL) med
in situ
celledød Detection Kit (Millipore, USA) i henhold til produsentens instruksjoner, slik som tidligere beskrevet [14].
Påvisning av celle apoptose med flowcytometri
i 1 t etter nsPEF behandling, de behandlede celler ble oppnådd for å detektere celle apoptose etter Annexin V-FITC apoptose Detection Kit (BD Biosciences) som tidligere beskrevet [16].
Analyse av cellesyklus med flowcytometri
på en time etter nsPEF behandling, de behandlede cellene ble oppnådd i bestemme cellesyklus endring. Cellesyklusanalyse og analyse ble utført som tidligere beskrevet [17].
Western blot-analyse
I 1 t etter nsPEF behandling ble de behandlede celler erholdt for å ekstrahere protein. Proteinekstraksjon og Western blotting-analyse ble utført som tidligere beskrevet [18]. Primære antistoffer og detaljer finner du i Tabell S1.
Tumor induksjon i hårløse mus med Hep-3B celler
De 5 uker gamle nakne mus ble kjøpt fra Shanghai Experimental Animal Centre, Chinese Academy of Science . Forsøksdyr ble holdt i den sentrale dyre innretningen av Zhejiang University School of Medicine og holder til i laminar- fl ow skap under særskilte patogen frie forhold ved 22 ° C med en 12 timers lys /mørke syklus. Alle mus ble bedøvet med ketamin (100 mg /kg intraperitonealt). Tumorbærende mus modellene ble etablert ved injeksjon av 2 x 10
6-Hep 3B celler i høyre del av magen hos mus. På en uke etter celleinjeksjon, tumor var typisk 3 mm bred og hadde utstilt angiogenese. Når tumorene vokste til 10 mm bred eller mer — typisk ca. 4 uker etter celleinjeksjon, ble 50 tumorbærende mus modeller opprettet og delt i to grupper: Kontrollgruppe (n = 17) og nsPEF gruppe (n = 33) . Musene i nsPEF gruppe ble utsatt for nsPEF (figur S1 D . E farging og Immunhistokjemi
H E farging og Immunhistokjemi (IHC ) ble utført som vi har tidligere beskrevet [19]. Primære antistoffer og detaljer er angitt i tabell S1.
tumor in situ påvisning av apoptose med TUNEL assay
tumorcelle-apoptose ble målt ved bruk av TUNEL-analyse, utført som tidligere beskrevet [14].
Statistisk analyse
dataene er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. Graph Pad Prism 5-programvaren ble brukt for statistisk analyse. Cell apoptose og cellesyklus ble analysert ved FlowJo 7.6.1 Software. Relativ intensitet av hver proteinbånd ble analysert ved Photoshop CS4. IHC Resultatene ble analysert ved hjelp av Image Pro Plus-programvare. Én-veis analyse av varians (ANOVA) med Dunnetfs multiple sammenligninger og en uparet, to-halet Student «s t-test ble anvendt for dataanalyse. Statistisk signifikans ble satt til P-verdi 0,05.
Diskusjon
Resultater og
Til tross for intensiv innsats i kreft behandling praksis, overlevelse for enkelte typer kreft har ikke blitt vesentlig forbedret i de siste årene, for eksempel kreft i bukspyttkjertelen [2], prostata karsinom [20] og lungekreft [21]. Nye behandlingsstrategier er derfor desperat som kreves for behandling av kreft og lang overlevelse av pasienter. Under flertrinns utvikling, menneske kreft skaffe ti biologiske kjennetegn inkludert motsette celledød, opprettholde proliferative signal, aktivere invasjon og metastasering, slik at replicative udødelighet, gå utenom vekstdempere, indusere angiogenese, omprogrammering av energi metabolisme, unndra immune ødeleggelse, tumor-fremme betennelse, og genom instabilitet og mutasjon [22,23]. Disse kjennetegnene utgjør en organiserende prinsipp for å rasjonalisere kompleksiteten i neoplastisk sykdom og også blitt store mål for kreftforskning og terapeutiske strategier. Som en relativt ny teknologi for å tolke kreft, er nsPEF effektivt i forskjellige cellelinjer
in vitro product: [5,9,10], og B16F10 melanom og hepatocellulært karsinom [11,24], så vel som humant pankreatisk karsinom [25]
in vivo
, demonstrere potensiell anvendelse utsiktene til nsPEF for kreftbehandling. Men inntil nå, er det fortsatt uklart om molekylære mekanismer nsPEF på kreft.
I denne studien brukte vi kreft modeller både
in vitro
og
in vivo
eksperimenter til søk etter mulige molekylære mekanismer.
NsPEF indusert kreft celler død og proliferativ hemming
in vitro
for å møte effekten av nsPEF i Panc-1 celler, celler ble utsatt for nsPEF med elektrisk felt på 0, 20, 40 og 60 kV /cm henholdsvis (figur 1A). Frekvensen av levedyktige celler /kontroll ble detektert ved å telle trypanblått-negative celler ved 0h, 0,5 timer, 1 time og 2 timer post puls (figur 1B). Vi fant at levedyktige celler legge puls ble signifikant redusert sammenlignet med kontrollgruppen (p 0,001), men tidsavhengig måte og doseavhengig måte av denne reduserte tendens ble ikke observert i løpet av kort tid etterpuls, i det minste i løpet av 2 timer. Videre behandlede celler ble dyrket i 24 timer og 48 timer, og deretter beregnet respektivt. Vi fant at de levedyktige celler ble også merkbart redusert i forhold til kontroll (både p 0,001) (figur 1C 0,001. (C og D) antall levedyktige celler ble beregnet etter eksponering for nsPEF med forskjellige intensiteter for henholdsvis 24 timer og 48 timer. * P 0,05, *** p 0,001. (E) Ifølge CCK-8-analysen, hemming priser av celler spredning indusert av nsPEF med forskjellige intensiteter ble oppdaget. ** P. 0,01
NsPEF indusert celle apoptose via den avhengig-mitokondriene indre apoptotiske sti
in vitro
Først, for å etterforske døds egenskaper indusert av nsPEF i bukspyttkjertelen karsinomceller, vi har oppdaget morfologi endringer av celler etter behandling med TEM (figur 2A). Apoptotiske karakteristika av celler ble sjelden observert i kontrollgruppen (0kV /cm). Men behandlede celler med 20 kV /cm nsPEF begynte å presentere cellemorfologi endring av tidlig apoptose: atom krymping, kjernekraft hakk, kromatin kondens og margination, og mindre mitokondrier degenerasjon. Under effekten av 40 kV /cm nsPEF, ble ytterligere endringer observert, hovedsakelig blant kromatin klumper, cytoplasma kondense og noen vakuoler vises på cellemembranen eller i cytoplasma. I mellomtiden ble atom fragmenter og cytoplasma bestanddeler pakket inn apoptotiske legemer, og mitokondrier viste vacuolar degenerasjon. Når elektriske felt økes opp til 60kV /cm, behandlede celler presenteres membran lyse, kjernemembranen blebbing, kjernekraft lyse og fragmentering samt mitokondrier skade, som ble vanligvis betraktet som nekrose.
(A) Morfologi endringer av kreft celler eksponert for nsPEF med forskjellige intensiteter ble observert ved celletransmisjonselektronmikroskopi (TEM). N: kjernefysiske endringer, inkludert atom svinn, kjernemembranen blebbing og atomlyse. M: mitokondrier degenerasjon eller vacuolar degenerasjon. (B) En celle apoptose av kreftceller eksponert for nsPEF med forskjellige intensiteter ble beregnet ved celle TUNEL assay. Original forstørrelse, 400 ×. *** P 0,001. (C) Cell DNA-fragmentering av kreftceller eksponert for nsPEF ble observert ved apoptose DNA stige assay. (D) apoptose forekomst av kreftceller eksponert for nsPEF med forskjellige intensiteter ble testet med PI og Annexin V-farging assay ved strømningscytometri. Resultatene ble analysert ved FlowJo 7.6.1 Software. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001. (E) Protein uttrykk for anti- /pro-apoptose Bcl-2-familien, Cytokrom C og Caspase-3 i kreftceller etter eksponering for nsPEF med forskjellige intensiteter ble påvist ved Western-blot-analyse. Relative intensiteten av hvert protein ble analysert ved hjelp av Photoshop CS4. * P 0,05, ** p 0,01, *** p. 0,001
Deretter studerte vi DNA-skade og fragmentering av TUNEL analysen og apoptose DNA ladder analysen. I TUNEL flekker, etikettene kombinert skadede områder av DNA, og apoptotiske celler ble farget brun-gule. Vi har observert at TUNEL positiver ble åpenbart stiger opp i PANC-1-celler legge puls på 20, 40, og 60 kV /cm sammenlignet med kontrollgruppen, henholdsvis (all p 0,001) (figur 2B). I samsvar med Tünel resultater, DNA fragmentering presentert i PANC-1 celler eksponert for nsPEF på 20 og 40 kV /cm i forhold til positiv kontroll og negativ kontroll fra DNA ladder analysen (figur 2C).
For ytterligere å undersøke apoptotiske grad i kreftceller poste puls, vi testet apoptotiske priser av behandlede celler med Annexin-V /PI farging av flowcytometri (figur 2D). Sammenlignet med kontrollgruppen, frekvensen av Annexin V
-PI
– celler (levedyktige celler) ble signifikant redusert etter eksponering for nsPEF, men frekvensen av Annexin V
+ PI
– celler (tidlig apoptose) ble merkbart øket ved 20 kV /cm (p 0,001), og deretter betydelig redusert ved 40 kV /cm (p 0,05) og 60kV /cm (p 0,01). I skarp kontrast, ble frekvensen av Annexin V
+ PI
+ celler (sent apoptose eller nekrose) stadig øker i dose-avhengighet 20, 40 og 60 kV /cm (alle p 0,01). Disse data foreslåtte celler død indusert av nsPEF presenteres fra tidlig apoptose til sent apoptose eller nekrose med økt intensitet av nsPEF, med andre ord, dose-avhengighet. Disse resultatene var identisk med våre funn via mobil TEM.
Nyere undersøkelser har vist at apoptose spilt en viktig rolle i celledød indusert av nsPEF [11,26]. I samsvar med disse studiene, fant vi apoptotisk kropp og mitokondrier degenerasjon av TEM etter nsPEF behandling. Videre resultatene av TUNEL analysen, apoptose DNA ladder analyse og Annexin-V /PI flekker også vist apoptose indusert av nsPEF i PANC-1 celler. Noen studier [5,9] rapporterte at kreft celledød indusert av nsPEF skyldes i hovedsak apoptose, og tolkes som økning av Annexin V
+ PI
+ celler i doseavhengighet kan tilskrives en spesiell «ligne nekrose «at høy dose puls indusert større hull i cellemembraner og deretter PI flekken angitt celler. Men vår ytterligere bevis via mobil TEM bevist at celledød presenteres fra tidlig apoptose til sent apoptose eller nekrose med økt intensitet av nsPEF, ikke bare celle apoptose.
Den iboende apoptose indusert av stress-induserende stimuli og ytre apoptose via død reseptor aktivering er to hovedveier av apoptose. Mitokondrier funksjon og anti /pro-apoptose BCL-2 proteiner familie spille viktige roller i indre apoptose vei [27]. Anti /pro-apoptose BCL-2 proteiner familiemedlemmer er i utgangspunktet integrerte membranproteiner som finnes i mitokondriene, endoplasmatiske retikulum (ER), eller kjernemembranen [28]. En stor aktiverende område av BCL-2 proteiner er mitokondriemembranen [27]. For å undersøke mulige mekanismer for apoptose indusert av nsPEF, vi har oppdaget slektning proteiner uttrykk for indre apoptotiske sti, som pro-apoptose Bcl-2 familien proteiner (Bad, p-Bad, Bax, Bik, Bim, BID, Bak og Puma) , pro-overlevelses Bcl-2-familieproteiner (p-Bcl-2, Bcl-2, Bcl-xL og Mcl-1), og apoptose direkte relative proteiner (Cytokrom-C og Caspase-3) (figur 2E). Sammenlignet med kontrollen, ble uttrykk for anti-apoptose-Bcl-2-familieproteiner, hovedsakelig inkludert p-Bcl-2, Bcl-XL og MCL-1, bemerkelsesverdig redusert i forskjellig grad, mens uttrykk for pro-apoptose-Bcl-2-familieproteiner , hovedsakelig blant Bax, Bim og BID, ble signifikant forhøyet i ulik grad med økt intensitet av nsPEF. I mellomtiden uttrykk av cytokrom-C og Caspase-3 ble tydeligvis økes etter eksponering for nsPEF. Vi konkluderte med at apoptose indusert av nsPEF ble utløst ved å regulere ubalansen av anti- eller pro-apoptose Bcl-2 familien proteiner på mitokondrie membran. Disse resultatene var i samsvar med mitokondrier degenerasjon og skader i celle ultra-struktur. Sammen er disse apoptotiske data indikerte at nsPEF indusert apoptose i Panc-1 celler via avhengige mitokondriene iboende apoptose bane som ble utløst av ubalanse av anti- eller pro-apoptose Bcl-2 familien proteiner.
NsPEF hemmet celledeling via undertrykke NF-kB signalveien
in vitro
i tillegg apoptose, nsPEF hadde en bemerkelsesverdig innflytelse på celleproliferasjon fra vår CCK-8 analysen at hemming frekvensen av celleproliferasjon ble bemerkelsesverdig økt på en måte av dose-avhengighet og tidsavhengighet etter 48t post puls. I cellesyklus, til omregning fra fase G1 fase S og prosentandel av fase G2 /M reflekterer typisk celle proliferativ evne. Vi undersøkte cellesyklus av behandlede celler, og fant at andelen av fasen G1 er åpenbart økt (p 0,01), mens prosentandelen av fasen G2 /M ble redusert (p 0,05) etter eksponering for nsPEF (figur 3A), som indikerer at nsPEF kunne stanse fase G1 av cellesyklus for å inhibere celleproliferasjon.
(A) celle~~POS=TRUNC syklus av kreftceller eksponert for nsPEF med forskjellige intensiteter ble undersøkt med PI farging assay ved strømningscytometri, og resultatene ble analysert ved FlowJo 7.6 0,1 Software. * P 0,05, ** p 0,01. (B) Protein uttrykk for NF-kB signalveien inkludert IKK-α, IKK-β IkB-α, p65 og p-p65 i kreftceller etter eksponering for nsPEF med forskjellige intensiteter ble detektert ved Western-blot-analyse. (C) Protein uttrykk for Cyclin proteiner, inkludert Cyclin D1 og syklin A hos kreftceller etter eksponering for nsPEF med forskjellige intensiteter ble påvist ved Western-blot-analyse. Relative intensiteten av hvert protein ble analysert ved hjelp av Photoshop CS4. * P 0,05, ** p 0,01, *** p. 0,001
NF-kB signalveien spiller en viktig rolle i celleproliferasjon [29]. Kreftvekst-inhibering via inhibering av NF-kB veien har nylig blitt rapportert i flere humane karsinomer, slik som kolon [30], lunge [31] og bryst [32]. Målgenene regulerer celleproliferasjon via NF-kB sti inkluderer c-myc, CyclinD1, Cyclin E og CDK2 som spiller en viktig rolle i positiv eller negativ regulering av cellesyklus [33,34]. For ytterligere å undersøke mulige mekanismer for proliferativ aktivitet av pulserende celler, vi har oppdaget uttrykk for NF-kB signalveien proteiner og cyclin proteiner i PANC-1 celler. Våre resultater viste at uttrykkene for NF-kB pathway proteiner, inkludert IKK-α, IKK-β, IkB-α, NF-kB p-65 og p-p65 var åpenbart minsket etter eksponering til nsPEF versus kontroll (alle p 0,01 eller 0,001) (figur 3B). Høyere intensitet av nsPEF ført til mye lavere uttrykkene for disse proteinene, sammenlignet med kontrollen. I mellomtiden uttrykk for cyklin proteiner, inkludert CyclinD1 og syklin A ble også signifikant redusert etter eksponering til nsPEF versus kontroll (p 0,01, 0,001 eller 0,05) (figur 3C). Så vi vurdert at nsPEF kunne hemme NF-kB signalveien for å redusere uttrykk for cyclin proteiner.
Disse data antydet at nsPEF hemmet celledeling gjennom å undertrykke NF-kB signalveien for å redusere uttrykk for cyclin proteiner, og dermed arrestere fase G1 av cellesyklus.
NsPEF inaktivert celle migrasjon og invasjon via undertrykke Wnt /β-catenin signalveien
in vitro
Aktivering av metastaser og invasjon er et viktig kjennetegn på kreft [22,23]. Graden av metastase og invasjon er en standard for å klassifisere stadium av ondartet svulst, og også direkte bestemmer terapeutiske strategier kreft og overlevelse av pasienter [35]. , Så vi har oppdaget muligheten for migrasjon og invasjon av kreft celler etter behandling. I vår studie, migrasjon evne til kreftceller legge puls ble kraftig kuttet ned sammenlignet med kontrollgruppen av Trans-vel-analyse (p 0,001) (Figur 4A). Videre har vi funnet at kreftceller eksponert for nsPEF besatt en betydelig svak evne til å invadere sammenlignet med kontrollgruppen ved hjelp av matrigel invasjon assay (p 0,001) (figur 4B). Resultatene viste at nsPEF kunne redusere celle metastaser og invasjonen i kreft.
(A) Migrasjon evne til kreftceller eksponert for nsPEF ble testet av trans-godt-analysen. De migrerte celler eksponert for nsPEF ble farget lilla med 0,1% krystallfiolett løsning, observert under lett mikroskop for 40 eller 400 forstørrelser, og regnes for statistisk analyse. Original forstørrelse, 40 × 400 ×. *** P 0,001. (B) invasjon evne av kreftceller eksponert for nsPEF ble påvist ved anvendelse av Matrigel invasjon assay. Etter nsPEF behandling, de cellene som besatt invasjon evne trengt gjennom matrigel, ble farget lilla med 0,1% krystallfiolett løsning, og ble regnet for statistisk analyse. Original forstørrelse, 40 × 400 ×. *** P 0,001. (C) Protein uttrykk for Wnt /β-catenin signalveien inkludert hDPR1, β-catenin og c-myc i kreftceller etter eksponering for nsPEF med forskjellige intensiteter ble oppdaget av Western-blot analyse. (D) Protein uttrykk for MMP’er familie og VEGF i kreftceller etter eksponering for nsPEF med forskjellige intensiteter ble påvist ved Western-blot-analyse. Relative intensiteten av hvert protein ble analysert ved hjelp av Photoshop CS4. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001
Akkumulert bevis har vist at Wnt /β-catenin signalveien spiller en avgjørende rolle i fosterutviklingen og menneske ulike kreftformer. [36]. Handlingene til Wnt /β-catenin signalveien på målceller i hovedsak omfatte endringer i genuttrykk, celle polarisering, migrasjon og invasjon gjennom regulering av ulike nedstrøms responsive molekyler [37]. Som nedstrøms effektor av Wnt /β-catenin signalveien, MMP’er familie proteiner og VEGF spiller en kritisk rolle i tumorinvasjon og metastase [38]. Dermed har vi oppdaget proteinuttrykk av Wnt /β-catenin signalveien, MMP familie og VEGF. Vi fant at uttrykk for Wnt /β-catenin signalveien proteiner hovedsakelig inkludert hDPR1, β-catenin og c-myc i kreftceller eksponert for nsPEF var bemerkelsesverdig redusert med doseavhengighet versus kontrollgruppen (p 0,05 på 20 kV /cm, p 0,001 ved 60kV /cm) (Figur 4C). Videre resultatene indikerte også at uttrykk av VEGF og MMP familie proteiner hovedsakelig blant MMP1, MMP2, MMP9, MMP11, MMP12, MMP14 og MMP21 ble betydelig redusert ved ulike grader med forskjellige intensiteter av nsPEF sammenlignet med kontrollgruppen (figur 4D). Så vi tenkte at nsPEF kunne undertrykke Wnt /β-catenin signalveien til ned-regulere genekspresjon av VEGF og MMP familie proteiner.
Disse resultatene sterkt antydet at nsPEF kunne inaktivere metastase og invasjon evner av kreftceller ved å hemme Wnt /β-catenin signalveien til ned-regulere genekspresjon av VEGF og MMP familie proteiner.
NsPEF fungert trygt og effektivt som en anti-tumor terapi
in vivo
på bakgrunn av
in vitro
eksperiment, nsPEF kan indusere celle apoptose, hemmer celledeling, og inaktivere metastase og invasjon. For ytterligere å identifisere anti-tumor funksjon av nsPEF, utførte vi nsPEF eksperiment i ektopisk tumor-bærende mus-modellen. Ektopisk tumor-modellen er en pilotstudie for mer dyptgående orthotopic modell som nærmere reflekterer kliniske applikasjoner.
Under hele dyreforsøk, 2 mus i nsPEF gruppen døde av over-dosert anestesi og en i kontroll døde av tvetydige årsaker. Vi observerte overlevelses tilstanden til resten 47 tumorbærende mus (16 i kontroll og 31 i nsPEF gruppe), og bemerket at nsPEF opprettholdt mus normal fysisk aktivitet og hadde ingen innflytelse på mus vekt (figur 5A), noe som indikerer at anti- svulst funksjon av nsPEF var trygt for kroppen selv
in vivo
.
