Abstract
microRNAs (miRNA) undertrykke messenger RNA etter transcriptionally gjennom binding til 3 «UTR av mRNA med miRNA frø regionen. Det er blitt påstått at større frø regioner har en større effekt på mRNA undertrykkelse. Vi testet denne hypotesen ved å evaluere differensial uttrykk for miRNAs involvert i å regulere immunresponsen, en viktig mekanisme i tykk- og endetarmskreft (CRC), av frø lengde kategori. Vi deretter evalueres differensial uttrykk for disse miRNAs «mål i colonic vev og virkningen av disse miRNAs på CRC overlevelse. Vi har bestemt sekvens komplementaritet mellom hver miRNA frø region og 3 «UTR av hvert eksperimentelt verifisert mRNA målgenet. Vi klassifisert mirnas i grupper basert på frø regioner matchende perfekt til en mRNA UTR med seks baser begynner i posisjon to, sju baser begynner i posisjon én, sju baser begynner i posisjon to eller åtte baser som begynner i posisjon én. Vi analyserte disse gruppene i form av miRNA differensial uttrykk mellom karsinom og normal kolorektal slimhinne, differensial colonic mål mRNA uttrykk, og risikoen for å dø av CRC. Etter korrigering for multiple sammenligninger, hvor stor andel av mirnas som var knyttet til differensial mRNA-ekspresjon var 0% for 6-mer, 13,64% for 7α-mer gruppe, 12,82% for 7β-mer gruppe, og 8,70% for 8-mer-gruppen. Andelen mirnas forbundet med overlevelse var 20% for 6-mer gruppe, 27,27% for 7α-mer gruppe, 10,23% for 7β-mer gruppe, og 21,74% for 8-mer-gruppe. Vi fikk ikke se en lineær sammenheng mellom frø lengde og miRNA uttrykk feilregulering, mRNA uttrykk, eller overlevelse. Våre funn støtter ikke hypotesen frøet regionen lengden alene påvirker mRNA undertrykkelse
Citation. Mullany LE, Herrick JS, Wolff RK, Slattery ML (2016) mikroRNA Seed Region Lengde Effekt på Target Messenger RNA uttrykk og Survival i tykktarmskreft. PLoS ONE 11 (4): e0154177. doi: 10,1371 /journal.pone.0154177
Redaktør: Geraldo A. Passos, Universitetet i São Paulo, Brasil
mottatt: 25 februar 2016; Godkjent: 08.04.2016; Publisert: 28 april 2016
Copyright: © 2016 Mullany et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. I samsvar med den signerte samtykkeerklæringer og etter godkjenning av datadelingsavtaler som bestemmes av University of Utah Institutional Review Board (https://irb.utah.edu/), kan data kun bli utgitt av studie etterforskere, i forbindelse med ikke- kommersiell, tykktarmskreft forskning, og må være i avidentifisert form. Ta kontakt [email protected] i forhold til deling av data
Finansiering:. Midler til denne studien ble gitt av National Cancer Institute, gir tall CA163683 og CA48998. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
microRNAs (mirnas) har blitt stadig under etterforskning for den rollen de spiller i biologiske prosesser, særlig når det gjelder utvikling og progresjon av kreft. Moden mirnas er små (~ 22-23 nukleotider lang), endogent uttrykt, ikke-protein-kodende RNA-molekyler som etter transcriptionally regulerer messenger RNA (mRNA) [1-3]. De gjør dette ved å binde seg til det 3′-ikke-translaterte region (UTR) av mRNA og forårsaker enten mRNA degradering, ved mer nøyaktig binding, eller hemming av mRNA translasjon, ved mindre nøyaktig binding [4, 5]. Mirnas er i stand til å regulere mange mRNA individuelt [4], og mer enn en miRNA kan målrette en individuell mRNA, og skaper en kompleks dynamikk samarbeidende regulering [6].
I 2015, American Cancer Society rapportert at kolorektal cancer (CRC) er den nest største årsaken til kreft-relaterte dødsfall i USA når menn og kvinner vurderes samlet, og den tredje når de vurderes separat, drepte 100.000 mennesker i USA hvert år [7]. CRC har vist seg å være en kompleks sykdom som omfatter mange biologiske prosesser [8], og som sådan mirnas har vært foreslått som viktige regulatorer av CRC [9]. En sentral prosess i tumorigenesis som har blitt foreslått å være fremtredende i utvikling og progresjon av CRC er kronisk betennelse [10], og i videre forstand, involvering av immunresponsen [8, 11]. Tumorer er kjent for å være immunogene, i det de fremkalle en immunrespons [11]. I tillegg til å regulere ulike mRNA målrette gener som er involvert i immunrespons, har mirnas vært innblandet i differensiering av blodkreft linjene, spiller en viktig rolle i både B- og T-celle responser [3].
Selv om mange faktorer kan bidra til miRNA-mRNA-binding, den fullstendighet med hvilken miRNA binder til mRNA, og den resulterende innvirkning miRNA har på mRNA-ekspresjon, er generelt antatt å være bestemt av frøet sekvensen i miRNA [1, 12, 13 ]. Den nøyaktige definisjonen av frø-regionen er noe diskutert i litteraturen, men vanligvis kanoniske, eller «kjerne», er frø region antas å bestå av en sammenhengende streng av minst 6 nukleotider som starter ved posisjon to [13]. Mer spesifikt, har kjerne frøene blitt beskrevet som en 6-Mer (baser 2-7), 7-mer ( «7-mer-A1» blir baser 1-7, og «7-mer-m8″ blir baser 2- 8), og 8-mer (baser 1-8); i noen vurderinger de 7-mer-A1 og 8-mer frø er pålagt å ha en adenin, «A», som det første nucleotide [1, 13-16]. Ellwanger et al. fant at lengre frø, dvs. frø av 7 eller 8 nukleotider i lengde, var mer evolusjonært konservert enn kortere [13].
I denne studien ser vi på frø sekvenslikhet mellom mirnas og tilhørende verifiserte mRNA mål som deltar i immunresponsen, og vurdere lengden av frø kampene som gjelder miRNA uttrykket i normal kolorektal slimhinne, tykktarmskreft vev, og forskjells uttrykk samt miRNA innvirkning på overlevelse og colonic mRNA differensial uttrykk. Ved å evaluere en undergruppe av miRNAs, de som målrette immunrespons, fokuserer vi vår undersøkelse på mirnas involvert i fysiologiske responser som er viktige for kreft, og begrense antall interaksjoner vi evaluere, for en mer målrettet tilnærming. Som lengre frø regionene er påstått å ha en større effekt som det gjelder å mRNA undertrykkelse [1], og mer presise bindingen resulterer i mRNA degradering, hypoteser om vi at mirnas som bindes til målet gener med en lengre frø region vil bli mer signifikant assosiert med CRC-spesifikk overlevelse og mRNA degradering.
Materialer og Metoder
studie~~POS=TRUNC
data~~POS=TRUNC kommer fra deltakerne i populasjonsbasert kosthold, aktivitet og livsstil studie som ble rekruttert fra Utah eller Kaiser Permanente Medical Care Program of Northern California (KPMCP). Colon krefttilfeller ble identifisert som å ha en primær adenokarsinom diagnostisert i perioden 1. oktober 1991 til 30 september 1994, mens endetarmskreft tilfeller ble diagnostisert mellom mai 1997 og mai 2001. Alle kvalifiserte tilfellene var mellom 30 og 79 år på diagnose, og bor i studieområdet, snakket engelsk, var i stand til å fullføre et intervju, og hadde ingen tidligere historie med CRC, Crohns sykdom, ulcerøs kolitt, eller kjent familiær adenomatøs polypose. Denne studien ble godkjent av Institutional Review Board ved University of Utah; alle deltakerne undertegnet et informert samtykkeskjema.
miRNA Processing
RNA ble ekstrahert fra formalinfiksert parafin innebygd vev og behandlet som tidligere beskrevet [17]. 100 ng total RNA ble merket med Cy3 og hybridisert til Agilent menneskelige miRNA mikromatriser V19.0 og ble skannet på en Agilent Surescan microarray scanner modell G2600D hjelp Agilent Feature Extract programvare v.11.5.1.1. Data ble pålagt å passere strenge QC parametrene fastlagt av Agilent som inkluderte tester for overdreven bakgrunn fluorescens, overdreven variasjon mellom sonde sekvens gjentak på tabellen, og tiltak av den totale genet signal på tabellen for å vurdere lavt signal. Hvis prøvene ikke klarte å møte QC standarder, ble prøven gjentas, og hvis en prøve mislyktes QC vurdering en gang prøven ble ansett for å være av dårlig kvalitet og ble ekskludert fra nedstrøms analyse. Agilent plattform ble funnet å være svært pålitelig (r = 0,98), for å ha rimelig avtale med NanoString [18] samt utmerket avtale med QRT-PCR (Pellatt, in press). For uparede prøvene på grunn av manglende normale skanner, tillagt vi verdier for normal slimhinne som tidligere beskrevet i [19]. For å minimere forskjeller som kan tilskrives rekken, mengden av RNA, plassering på rekke, eller andre faktorer som feilaktig kan påvirke uttrykket, ble totalt genet signal normalisert ved å multiplisere hver prøve med en skaleringsfaktor som var medianen av 75
th persentiler av alle prøvene delt på 75
th persentil av hver enkelt prøve [20]. Denne skaleringsfaktor ble gjennomført ved bruk av SAS 9.4.
mRNA Sekvense Bibliotek Forberedelse, Sekvensering og Data Processing
RNA bibliotek konstruksjonen ble gjort med Illumina TruSeq Stranded Total RNA Sample Preparation Kit med Ribo-Zero . Prøvene ble så fragmentert og primet for cDNA-syntese, adaptere ble deretter ligert til cDNA, og de resulterende prøver ble deretter amplifisert ved hjelp av PCR; den forsterkede biblioteket ble deretter renset ved hjelp Agencount AMPure XP perler. En mer detaljert beskrivelse av metodene kan bli funnet i vår tidligere arbeid [21].
Sekvensering ble gjort ved hjelp av en Illumina TruSeq v3 enkelt lese flyt celle og en 50 syklus enkelt lese sekvens løp ble utført på en Illumina HiSeq instrument. Leser ble deretter justert til en sekvens database som inneholder det humane genomet (bygge GRCh37 /hg19, februar 2009 fra genome.ucsc.edu) og innretting ble utført ved hjelp av novoalign v2.08.01. Python og en pysam biblioteket ble brukt til å beregne teller for hver ekson og UTR av genene ved hjelp av en liste med genet koordinater hentet fra https://genome.ucsc.edu. Vi falt funksjoner som ikke var uttrykt i våre data eller for hvilken uttrykket manglet for de fleste prøver. En mer detaljert beskrivelse av metodene kan bli funnet i vår tidligere arbeid [21].
Bioinformatikk Analyse
En liste over mRNA gener ble hentet fra Ensembl hjelp Ensembl sin Biomart verktøy, bruker versjon kartlagt til menneskelige genom GRCh38. Vi ba om en liste over Ensembl Gene IDer og tilknyttede Gene Navn som hadde GO sikt attributten «immunrespons». Dette ga en liste over 1,762 Ensembl IDer, tilsvarende 1,355 unike genet navn. En liste over miRNA-genet foreninger ble deretter generert ved hjelp av Homo sapiens depotet fra miRTarBase, som benytter miRBase 21. mirnas som var knyttet til gener som finnes i den «immunrespons «liste og ble eksperimentelt verifisert ved hjelp av enten» reporter analysen «,» QRT -PCR «, eller» western blot «, da disse fremgangsmåter er ansett sterkere ved miRTarBase, ble ytterligere analysert. Disse restriksjonene ga 1.413 miRNA-målet foreninger som omfatter 395 unike «immunrespons» gener og 327 unike miRNAs. Agilent plattform tilsvarer miRBase 19 nomenklatur, og ved å bruke denne versjonen for fasta sekvenser vi kan se hvilke aktuelle sekvenser ble forskjellig uttrykt i vårt datasett. Som miRTarBase v6.0 er basert off av miRBase 21, gjør dette oss til å kjenne til de mest aktuelle foreninger, og bare de mirnas som passet i navn ble båret frem i analysen. MRNA 3 «UTR fasta sekvenser ble oppnådd for de genene som ble verifisert mål for mirnas fra Ensembl sin Biomart; vi brukte et filter kravet om «CCD-ID» for å få bare konsensussekvenser. Seed regioner ble samlet for hvert miRNA ved å beregne den motsatte DNA-komplementet av nukleotidene 2-7, 1-7, 2-8 eller 1-8 av 5′-enden av den miRNA for å gjøre 6-mer, 7α-mer ( også kalt 7-mer-A1 i litteraturen), 7β-mer (også kalt 7-mer-m8 i litteraturen), og 8-mer frø hhv. Vi deretter søkt 3»-UTR av mRNA som ble eksperimentelt bekreftet å være rettet ved miRNA fra hvilken de ble samlet for hver av de frø sekvenser. Mirnas som skjedde i bare ett frø kategorien ble gjennomført på i analysen; Dette ble gjort for å polarisere funnene samt redusere tvetydighet i inferred miRNA-genet foreninger. Et diagram av denne fremgangsmåte kan ses i figur 1. De endelige miRNA grupperinger besto av 99 mirnas: 15 22, 39, og 23 mirnas for 6-mer, 7α-mer, 7β-mer, og 8-mer frø hhv. Antallet mirnas som svarer til hver gruppe kan ses på fig 2. Etter å bestemme hvilke mirnas var signifikant forskjellig uttrykt mellom normal tykktarmsslimhinne og kolorektal karsinom vev, identifiserte vi et nytt sett av målgener for disse mirnas. Den resulterende listen var ikke «immunrespons» -spesifikk, selv om det gjorde inkluderer «immunrespons» gener, som mirnas in vivo ville trolig ikke begrense deres handling på mRNA de målet. Disse genene ble så analysert, som beskrevet nedenfor, for foreninger med sine respektive målretting mirnas til å undersøke effekten av frø-type binding på mRNA uttrykk.
statistiske metoder
Vår utvalget besto av 1893 pasienter med miRNA uttrykk nivåer for både kreft og normale slimhinner vev. Vi sammenlignet logge basis to forvandlet miRNA uttrykket nivåer mellom paret carcinoma vev og normal kolorektal slimhinne samlet, stratifisert etter undersøkelse ved hjelp betydningen analyse av mikromatriser (SAM) teknikk i R pakken siggenes [22]. P-verdier generert fra SAM var basert på 1000 permutasjoner med en falsk funnrate (FDR) satt på 0,05 [23]. Vi analyserte fire frø regioner, 6-mer, 7α-mer, 7β-mer, og 8-mer, i fellesskap. For de mirnas som ble vesentlig forskjellig uttrykt rapporterer vi den gjennomsnittlige nivået av uttrykk og fold endring (på ikke-log transformerte data) mellom tykktarmskreft vev og normal kolorektal slimhinne.
Deretter undersøkte vi effekten av differensial miRNA uttrykket i overlevelse ved hjelp av Cox-modell i 1855 forsøkspersoner med overlevelsesdata tilgjengelig. Vi beregnet hazard ratio (HR) og tilsvarende 95% konfidensintervall (KI) med enheten av endring er det interkvartile området (IQR), justert for alder, kjønn og AJCC scenen samlet samt stratifisert ved studium og scene. Vi testet CRC spesifikk overlevelse basert på måneder mellom diagnose dato og død eller siste oppfølging dato. Personer som dør av andre årsaker eller som ble tapt for oppfølging ble sensurert på sitt dødstidspunktet eller dato for siste kontakt. R pakke overlevelse ble brukt for å beregne p-verdier basert på 10.000 permutasjoner av sannsynligheten forholdet test. Fordi en rekke mirnas ble sjelden til uttrykk, som vi har definert som ekspresjon på mindre enn 50% av individene, beregnet vi HR for disse miRNA basert på en hvilken som helst uttrykk uten å bruke permutasjoner for å beregne p-verdiene i SAS 9,4 (SAS Institute, Cary , NC). Vi kombinerte p-verdier på både de mer vanlige uttrykk mirnas og sjelden uttrykt mirnas og justert for multiple sammenligninger ved hjelp av en FDR på 0,05.
Til slutt, vi undersøkt forholdet mellom forskjellig uttrykt mirnas og deres respektive mRNA mål gener ved å evaluere de 302 kombinasjonene som er identifisert i miRTarBase ved fremgangsmåten beskrevet ovenfor i den undergruppe av 148 pasienter med mRNA-data tilgjengelig. Vi genererte lineære regresjonsmodeller justert for alder og kjønn på 1000 bootstrap [24] prøver. Vi beregnet differensial mRNA uttrykk som forskjellen i log base 2 av RPKM (Leser per kilobase per million) for karsinom og normal slimhinne vev. P-verdier ble samlet fra fordelingen av de p-koeffisienter for hver miRNA og evaluere H
0: β = 0 vs. H
1: ß ≠ 0 ved hjelp av støvelen pakken i R. Vi justert for multiple sammenligninger ved hjelp et FDR nivå på 0,05. Vi standardisert bakkene generert fra den samlede datasettet for å sammenligne resultatene på tvers av miRNA.
Resultater
En samlet oppsummering av miRNAs inkludert i analysene og ekskludert fra analyse etter at frø generasjon kan finnes i S1 tabell.
Førti-tre mirnas signifikant forskjellig uttrykt mellom normal kolorektal slimhinne og tykktarmskreft vev (tabell 1). I tillegg til de forskjellig uttrykt for tykktarmskreft, ble tre mirnas uttrykt forskjellig for bare tykktarmskreft og tre ble uttrykt forskjellig for bare endetarmskreft. Av de 49 totalt feilregulert mirnas, 18 ble oppregulert og 31 ble nedregulert i carcinoma vev versus normal kolorektal slimhinne. Seks av miRNAs ble klassifisert som 6-mer forpliktende, 12 ble klassifisert som 7α-mer, 19 som 7β-mer, og 12 som 8-merer. Seksten av disse miRNAs hadde en fold endring av ≥1.5 eller ≤0.67 representert med en 6-mer, fire 7a-merer, fire 7p-merer, og syv 8-merer.
Atten mirnas var signifikant assosiert med endret overleve; 17 av disse miRNAs ble assosiert med overlevelse etter diagnose med endetarmskreft og en ble forbundet med total CRC overlevelse etter justering for multiple sammenligninger (tabell 2). Av de 18 mirnas som var knyttet til endrede overlevelse, 15 også signifikant forskjellig uttrykt mellom normal kolorektal slimhinne og tykktarmskreft vev. Ingen mirnas endret overlevelse for tykktarmskreft bare. Tre av disse miRNAs ble klassifisert som 6-merer, fem som 7a-merer, fire som 7p-merer, og tre som 8-merer.
Nitten mirnas var assosiert med uttrykk av sine kjente målrettede mRNA (Tabell 3); 12 av disse forble signifikant etter justering for multiple sammenligninger. Av disse 12 ble seks mirnas omvendt assosiert med målrettet mRNA uttrykk og seks ble direkte knyttet til målrettet mRNA uttrykk. Av de mirnas som viste en direkte sammenheng med differensial uttrykk for mRNA, ble en klassifisert som en 7α-mer, to som 7p-merer, og tre som 8-merer. Av de mirnas som viste en invers assosiasjon med differensial mRNA uttrykk to ble klassifisert som 7a-merer og fire ble klassifisert som 7p-merer.
En oppsummering av antall mirnas vesentlig forskjellig uttrykt, i forbindelse med risikoen for å dø av tykktarms eller endetarmskreft, og i forbindelse med differensial mRNA uttrykk er vist for hvert frø kategori i tabell 4. Mens seedet gruppe 7α-mer hadde den høyeste andelen av miRNAs i hvert statistisk test, prosenter for hver kategori var veldig tett, noe som tyder på ingen sann forskjell i proporsjoner. Som det totale antall av mirnas i hver kategori er forholdsvis liten, kan en eller to mirnas forklare forskjellen i andeler.
Overlappingen av mirnas representert ved hver av analysene kan sees i figur 3. fra dette diagrammet, ser vi at bare fire mirnas var betydelig forskjellig uttrykt, var assosiert med endret overlevelse, og var signifikant assosiert med endret mRNA-ekspresjon etter justering for multiple sammenligninger. Av disse fire mirnas, to ble klassifisert som 8-merer, en som 7β-mer, og en ble klassifisert som 7α-mer. Bare én av disse fire, HSA-MIR-150-3p, ble omvendt assosiert med mRNA uttrykk, resten var direkte tilknyttet.
Diskusjoner
Mange mirnas i denne studien var forskjellig uttrykt mellom tykktarmskreft vev og normal kolorektal slimhinne, var assosiert med endret risiko for å dø av enten CRC eller endetarmskreft, eller var assosiert med differensial colonic mRNA uttrykk. Fire av disse miRNAs ble funnet å ha signifikante assosiasjoner i alle tre testene. Vi antok det, fordi lengre frø regioner har en større effekt av mRNA undertrykkelse og mer presise bindende resulterer i mRNA degradering, at jo lenger frø regionene ville bli assosiert mer med mRNA differensial uttrykk samt CRC risiko. Generelt frøet gruppe 7α-mer, som består av miRNAs med frø bestående nukleotider 1-7, hadde flere betydelige funn i forhold til hvor mange mirnas tilhører hver kategori ble assosiert med enten miRNA differensial uttrykk, mRNA differensial uttrykk eller overlevelse. Men som prosenter er ganske nær for alle gruppene, er det sannsynlig at dette funnet er ikke signifikant forskjellig. I tillegg var det ingen lineær trend, dvs. tall fra 6-frø tall fra 7a /β-frø nummer fra 8-frø eller vice versa, til andelen av miRNAs fra hvert frø gruppe som var betydelig med mRNA differensial uttrykk eller med overlevelse. Dette tyder på at frø lengden alene, i hvert fall slik det er definert i denne studien ikke er assosiert med enten mRNA differensial uttrykk mellom tykktarmskreft vev og normal tarmslimhinnen eller med risiko for å dø av CRC. Det var en liten lineær trend i miRNA differensial uttrykk med fold endringer ≥1.5 eller ≤0.67 som det gjelder å frø region lengde, med suksessivt flere mirnas blir forskjellig uttrykt som sæd region lengde økt. Dette er imidlertid neppe være biologisk relevant.
I motsetning til sine veletablert rolle som repressors, mirnas har nylig blitt vist å aktivere mRNA oversettelse når cellene er i en hviletilstand [25]. Spesielt eksogene HSA-la-7 ble vist å øke
HMGA2
oversettelse da lagt til serum-sultet (hvilende) HeLa-celler. I vår studie observerte vi økt uttrykk av HSA-la-7d-5p kolorektal kreft vev sammenlignet med normal kolorektal slimhinne, og en direkte sammenheng mellom HSA-la-7F-5p og
HGMA2
uttrykket (β = 0,16, P
adj = 0,032), noe som indikerer en påfølgende økning i
HGMA2
uttrykk i carcinoma vev. Hsa-la-7d-5p er kategorisert som en 7β-mer bindende miRNA i vårt datasett. Som denne dynamiske ble tidligere sett i hvilende celler, kan det være at personer som uttrykker høyere nivåer av HSA-la-7d-5p og
HMGA2
ha flere celler som er i en sovende tilstand. Vi så oppregulering av HSA-MIR-196a-5p og HSA-MIR-196b-5p kolorektal kreft vev sammenlignet med normal kolorektal slimhinne; vi senere så en direkte sammenheng med HSA-MIR-196a-5p og
HOXB7 Hotell og HSA-MIR-196b-5p med
HOXA10
i kolon carcinoma vev. Det ble ikke observert De samme relasjoner mellom disse mirnas og mRNA hos pasienter med Huntingtons sykdom sammenlignet med normale hjerner [26]; denne studien tilskrives dette observert dynamisk til avvikende mRNA prosessering. Som denne studien identifiserer en viktig vei beriket av disse genene som «Cell død og Survival», funnet ved hjelp av IPA, kan det være at denne uortodokse forholdet skyldes endringer i denne veien. Fosfatase og tensin homolog, eller
PTEN
, koder for et enzym som finnes i mange av kroppens vev og til å motvirke ukontrollert vekst, og dermed fungerer som en tumor suppressor [27]. Dette genet ble direkte forbundet med HSA-MIR-425-5p, som ble økt i carcinoma vev (endring = 1,79, P-verdi 0,0001). Over uttrykk for HSA-MIR-425-5p i kolorektal kreft var assosiert med redusert risiko for å dø av kreft i endetarmen (IQR Range HR 0,84 95% KI 0,74, 0,95 P
adj = 0,0354). Ettersom dette miRNA var assosiert med økt uttrykk av
PTEN
i tykktarmen vev (β = 0,25, p
adj = 0,024), og differensial uttrykk for dette miRNA var lik for tykktarms- og endetarms vev, er det mulig at en tilsvarende forbindelse med PTEN ville bli sett i rektal vev. Den endrede risikoen for kreft i endetarmen kan derfor bli påvirket av PTEN evne til å undertrykke ukontrollert vekst.
En begrensning er at vi evaluert mRNA data for tykktarms vev bare. Mens vi har vist at feilregulering av miRNA er lik for tykktarms- og endetarmskreft [18], er det ukjent om feilregulering av mRNA er den samme for rektal og tykktarmskreft. Men hvis det er, er det interessant å merke seg at av de mirnas som var knyttet til både endret overlevelse etter diagnose med endetarmskreft og mRNA uttrykk i tykktarmen vev, de som økt overlevelse (HSA-MIR-192-5p, hsa- MIR-30e-5p, HSA-MIR-425-5p, HSA-MIR-142-3p, og HSA-MIR-196b-5p) hadde direkte assosiasjoner med mRNA uttrykket (β 0) og de som økt risiko for å dø av kreft (HSA-MIR-486-5p og HSA-MIR-150-3p) hadde en invers assosiasjon med mRNA uttrykket (β 0). Som et stillestående celle er ikke dele seg ukontrollert, er det mulig at dette forholdet mellom mirnas og mRNA aktivering i hvilende celler som bidrar til den forbedrede overlevelse i disse fagene, men som noen av disse genene har onkogene egenskaper (
MYC
,
MYB
, og
IGF1R
) eller er knyttet til DNA transkripsjon og celledifferensiering (
KAT2B
,
HOXB7
,
HOXB8
HOXA7
,
HOXA9
, og
HOXA10
) det er sannsynlig at mange faktorer påvirker den generelle genuttrykket i cellen, og den påfølgende innvirkning på overlevelse. Også, fordi alle mirnas forbundet med endret risiko og mRNA uttrykk er fra forskjellige frø grupper, er det usannsynlig at frøet binding alene bidrar til denne forekomsten.
Denne studien evaluerer kun CRC vev. Selv om vi mener at frøet regionene skal oppføre seg på samme måte i andre vev, har miRNA ekspresjon er vist å være spesifikk vev, og dette kan begrense den generalisering av disse funnene i forbindelse med andre typer vev. Det er mange mulige faktorer som også kan påvirke miRNA-mRNA bindende. Som vi var interessert i hvordan frø region lengde påvirket miRNA bindende, mRNA uttrykk, og overlevelse i CRC pasienter, er det noen potensielt relevante elementer som vi ikke vurdere i denne studien. Disse påvirkninger på miRNA-mRNA bindende inkluderer: andre mikroRNA-anerkjennelse elementer (MREs), AU sammensetning og AU-rike elementer (Ares) og andre påvirkninger på stedet tilgjengelighet, 3 «(av miRNA) kompenserende bindende, GC innhold av frø region, uansett om frøet sekvensen er konservert, og avstanden fra stoppkodonet i og plassering nær slutten av den 3 «UTR av mRNA [1, 2, 15, 28]. I tillegg kan det være at enkelte mirnas primært kommuniserer med mRNA-er gjennom sin 3 «ende, eller oppviser ikke-kanonisk bindingsseter (som noen ganger i litteraturen avbildet som frø som er 6 nukleotider i stedet for 7 eller 8), manifestert ved buler eller enkelt-nukleotid looper i frø regioner, eller binde i midtre del av miRNA [16]. Disse variasjonene på miRNA-mRNA binding ikke ble undersøkt i denne studien, og som sådan noen interaksjoner kan være savnet. Til slutt, som tidligere nevnt, den 7α-mer (beskrevet et annet sted som 7-mer-A1) og 8-mer frø er i noen studier avbildet som de som har et adenin i stilling en. Vi gjorde ikke beregne frø regioner på denne måten, i stedet fant vi nøyaktig, Watson-Crick, kamper mellom miRNA frø og mRNA. Fordi dette skillet er vanligvis brukt til mRNA målet prediksjon, og vi bare så for frø kampene i mRNA som ble eksperimentelt verifisert som mål for mirnas som ble forskjellig uttrykt, føler vi ikke at dette er til skade for etterforskningen. Noen av miRNAs, de som begynner med en uracil, har komplementære sekvenser som begynner med en adenin, og som sådan vår datasettet inneholder noen 7a-merer og 8-merer som følger denne standarden, og andre som følger bredere Watson-Crick sammenkobling . Tilnærmingen vi tok i eksamens frø regionens likheter sett på perfekt matchende og vilje polarisert datasettet ved å bare analysere mirnas vises i ett frø kategori. Mens dette ble gjort for å begrense sammenligninger og gjøre tolkningen av resultatene enklere, kan det være at denne tilnærmingen er ikke egnet for den ønskede analyse. Det er mulig at en tilnærming som avgjør en konsensus sekvens eller sekvenser og gjør det mulig for mirnas å være i flere grupper ville bli bedre, og vi oppfordrer andre studier for å undersøke dette.
Konklusjoner
Vi antok at de mirnas som tilhører de lengre frø-grupper, dvs. de i 7 og 8-frø kategorier, vil omfatte de fleste av funnene for mRNA differensial ekspresjon, så vel som for å overleve på grunn av deres foreslåtte kapasitet for mRNA undertrykkelse. Mens mange mirnas ble uttrykt forskjellig mellom carcinoma vev og normal kolorektal slimhinne, var assosiert med risiko for å dø etter en diagnose med endetarmskreft, eller var assosiert med differensial mRNA uttrykk, frø region lengden ikke påvirke disse assosiasjonene. Våre funn kan bli påvirket av den måten vi bestemt frø region som mirnas å inkludere i analysen. Vi fant ut at mirnas som var direkte forbundet med kolon mRNA uttrykk økt overlevelse fra endetarmskreft, og de som ble omvendt assosiert med colonic mRNA uttrykk økt risiko for å dø av CRC. På grunn av det lave antallet mirnas som var knyttet til CRC overlevelse, oppfordrer vi andre studier for å undersøke dette dynamiske.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Table. Oppsummering av miRNA utfall og frø region gruppe
doi:. 10,1371 /journal.pone.0154177.s001 plakater (docx)
Takk
Innholdet i dette manuskriptet er utelukkende ansvar av forfatterne, og ikke nødvendigvis representerer den offisielle syn av National Cancer Institute. Vi ønsker å takke Dr. Bette Caan og Kaiser Permanente Medical Research Program for prøve bidrag, Erika Wolff og Michael Hoffman for miRNA behandling, Brett Milash og Bioinformatikk delt ressurs for Huntsman Cancer Institute og University of Utah for miRNA og mRNA bioinformatikk databehandling, og Sandie Edwards for sin innsats i totale studie overvåking og vev samling svulst.
