Abstract
Formål
Vi har undersøkt effekten av pegylert interferon-α2a (PEG-IFN α2a) på veksten av humane lever kreftceller.
Metoder
effekten av PEG-IFN-α2a på spredning av 13 leverkreft cellelinjer ble undersøkt
i
vitro
. Celler ble dyrket med medium inneholdende 0-4,194 ng /ml av PEG-IFN-α2a, og etter 1, 2, 3, eller 4 dagers dyrking, ble morfologiske observasjoner og vekstanalyse utført. Etter hepatocellulær karsinom (HCC) celler (HAK-1B og KIM-1) ble transplantert inn i nakne mus, ble forskjellige doser av PEG-IFN-α2a subkutant administrert til musene en gang i uken i 2 uker, og tumorvolum, vekt, og histologisk ble undersøkt.
Resultatene
PEG-IFN-α2a hemmet veksten av 8 og 11 cellelinjer på en tids- og doseavhengig måte, henholdsvis, selv om 50% vekstinhiberende konsentrasjoner av 7 målbare cellelinjer på dag 4 var forholdsvis høy, og varierte fra 253 ng /ml til 4431 ng /ml. Forskjellige nivåer av apoptose-induksjon ble bekreftet i 8 cellelinjer. PEG-IFN-α2a induserte en nedgang doseavhengig i tumorvolum og vekt, og en betydelig økning av apoptotiske celler i tumoren. Subkutan administrering av klinisk dose for kronisk hepatitt C (3 mg /kg, 0,06 ug /mus) var effektiv og indusert omtrent 30-50% reduksjon i tumorvolum og vekt sammenlignet med kontrollen.
Konklusjoner
Selv om
i
vitro
anti-proliferative effekter av PEG-IFN-α2a var relativt svak, PEG-IFN-α2a indusert sterke anti-tumor effekt på HCC celler
i
vivo
. Dataene antyder potensiell klinisk anvendelse av PEG-IFN-α2a for forebygging og behandling av HCC
relasjon:. Kusano H, J Akiba, Ogasawara S, Sanada S, Yasumoto M, Nakayama M, et al. (2013) pegylert interferon-α2a Hemmer spredning av humane lever kreftceller
In Vitro Hotell og
In Vivo
. PLoS ONE 8 (12): e83195. doi: 10,1371 /journal.pone.0083195
Redaktør: Diego Calvisi, Institut für Pathologie, Greifswald, Tyskland, Tyskland
mottatt: 19 august 2013; Godkjent: 10 november 2013; Publisert: 12.12.2013
Copyright: © 2013 Kusano et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet delvis av Sarah Cousins minnefond, Boston, Massachusetts, og ved en Grant-in-Aid fra Helsedepartementet, Arbeids- og velferds av Japan. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Interferoner (IFNs) er typer av cytokin som er produsert av vertsceller, slik som leukocytter, som reaksjon på betennelse. Siden IFN ha antiviral aktivitet, antiproliferativ aktivitet og ulike immun aktiviteter, er IFN terapi brukes til å behandle pasienter med kronisk viral hepatitt eller visse typer kreft, inkludert føflekkreft, ervervet immunsviktsyndrom-relatert Kaposis sarkom og noen blodkreft maligniteter [1,2]. Lai et al viste at rekombinant IFNα er nyttig i å forlenge overlevelsen hos pasienter med inoperabel hepatocellulært karsinom (HCC) [3]. I tillegg er noen studier viste IFN terapi kan forhindre enten inntreffer eller tilbakefall etter første kurativ behandling av HCC, som leverreseksjon og radiofrekvens ablasjon, hos pasienter med kronisk og virus hepatitt [4-7]. Dette kreft forebyggende effekt av IFN anses i hovedsak som resultat av deres antivirale virkning og den derav følgende undertrykkelse av inflammasjon, og kan være på grunn av deres direkte antitumoreffekt mot klinisk ikke målbart HCC også. Den detaljerte mekanisme av antitumoreffekten av IFN forblir imidlertid uklar.
pegylert interferon-α2a (PEG-IFN-α2a) og pegylert interferon-α2b (PEG-IFN-α2b), som brukes til å behandle pasienter med kronisk hepatitt C virus (HCV) eller B-virus (HBV) infeksjon, er modifiserte IFN som har lengre serum halveringstid i kroppen enn ikke-pegylerte former av IFN, derfor kan de gis til pasienter kun en gang i uken, mens en standard IFN uten pegylering brukes til å bli injisert opp til tre til fem ganger en uke. Denne gang i uken injeksjon av pegylerte IFN i kombinasjon med daglig oral dosering av Nukleosidanalog ribavirin har vesentlig forbedret frekvensen av vedvarende virologisk respons hos pasienter med kronisk HCV-infeksjon og fikk en posisjon som førstelinjebehandling [8,9] . Vi har tidligere rapportert at PEG-IFN-α2b som inneholder 12 kDa polyetylenglykol (PEG) har sterkere antitumoreffekter
in vivo
enn ikke-pegylerte IFN og dette resultatet kan være indikerer at IFN kontinuerlig eksponering til kreftcellene i kroppen er mer effektiv enn kontinuerlig injeksjon [10]. På bakgrunn av ovennevnte bakgrunn, undersøkte vi den veksthemmende virkninger av PEG-IFN-α2a som inneholder to kjeder på 20 kDa PEG og har den lengste halveringstiden i serum hos klinisk tilgjengelige IFN på leverkreft cellelinjer
i vitro Hotell og
in vivo
.
Metoder
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP og cellekultur
Denne studien brukte 11 HCC cellelinjer (KIM-en, KYN-en, KYN-2, KYN-3, HAK-1A, HAK-1B, HAK-2, HAK-3, HAK-4, HAK-5, og HAK-6) og to menneskelige kombinert hepatocellulær og kolangiokarsinom (CHC ) cellelinjer (KMCH-1 og KMCH-2). Disse HCC og CHC cellelinjer ble opprinnelig etablert i vårt laboratorium, og hver cellelinje beholder de morfologiske og funksjonelle egenskaper av den opprinnelige svulsten som beskrevet andre steder [11-20]. Siden tumorigenicity er høyere i HAK-1B og KIM-1 celler enn i de andre 11 cellelinjer som vi har, vi brukte disse to cellelinjer for
in vivo
studien.
Cellene ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (Nissui Seiyaku, Co., Japan) supplert med 2,5% varme-inaktivert (56 ° C, 30 min) føtalt bovint serum (FBS, Bioserum, Victoria, Australia ), 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin (GIBCO-BRL /Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) og 12 mmol /l natriumbikarbonat, i en fuktig atmosfære med 5% CO
2 i luft ved 37 ° C.
IFN og reagenser
PEG-IFN-α2a (PEGASYS
®, Chugai Pharmaceutical Co., Ltd., Tokyo, Japan) med den spesifikke aktiviteten på 1,4 X 10
7 IU /mg protein og ikke-pegylert IFN-α2a (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Tyskland) med den for 2,0 x 10
8 IU /mg protein ble anvendt i studien.
Anti-bromdeoksyuridin (BrdU) antistoff og fluorescein isotiocyanat-konjugert geit-anti-mus-immunoglobulin (FITC-GAM) ble kjøpt fra Becton Dickinson Immunocytometry Systems USA (San Jose, CA); kontrollere normal mus IgG
1, fra DAKO (Glostrup, Danmark); rotte-antistoff mot mus endotelceller (anti-CD34, klon MEC14.7), fra Serotec Co, UK; og mus monoklonalt antistoff mot humant α-glatt muskel aktin (SMA) som kryssreagerer med mus α-SMA (klone 1A4).
Effekter av PEG-IFN-α2a på spredning av HCC og CHC cellelinjer
in vitro
virkningene av PEG-IFN-α2a på veksten av de dyrkede celler ble undersøkt med kolorimetri hjelp 3- (4,5-2-yl) -2,5- difenyletere tetrazoliumbromid (MTT) analysesett (Chemicon, Temecula, CA) som beskrevet andre steder [18,21]. I korthet ble cellene (1,5 ~ 8 X 10
3-celler per brønn) ble sådd ut på 96-brønners plater (Nunc, Inc, Roskilde, Danmark), dyrket i 24 timer, og kulturmediet ble endret til en ny medium med eller uten PEG-IFN-α2a (0,016, 0,064, 0,256, 1,024, 4,096, 16,4, 65,5, 262, 1048, eller 4194 ng /ml). Etter dyrking i 24, 48, 72 eller 96 timer, ble antallet levedyktige celler målt med ImmunoMini NJ-2300 (Nalge Nunc International, Tokyo, Japan) ved å sette testbølgelengde på 570 nm og referansebølgelengde på 630 nm. For å holde den optiske densitet innenfor lineære området, ble alle forsøk utført mens cellene var i logaritmisk vekstfase.
Kvantitativ analyse av apoptotiske celler indusert av PEG-IFN-α2a
HAK-1B eller KIM-1-celler dyrket med medium alene (kontroll), ikke-pegylert IFN-α2a (10 ng /ml = 2000 IU /ml) eller PEG-IFN-α2a (144 ng /ml = 2000 IE /ml) i 72 timer ble farget med Annexin V-EGFP (forbedret grønn fl uorescent protein) apoptose Detection Kit (Medical Biologiske Laboratories Co., Ltd.) i henhold til produsentens instruksjoner. Etter farging ble cellene analysert ved hjelp av en FACScan (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA), og Annexin V-EGFP-positive apoptotisk celle hastigheten ble bestemt.
Morfologisk Observation
For morfologisk observasjon under et lysmikroskop, dyrkede celler ble sådd på Lab-Tek vevskultur kammer lysbilder (Nunc, Inc.), dyrket med eller uten PEG-IFN-α2a (262, 1048 eller 4194 ng /ml) i 72 timer, faste i 10 min i Carnoy løsning, og farget med hematoksylin-eosin (HE).
Effekter av PEG-IFN-α2a på HCC Cell Proliferation i hårløse mus
Alle dyreforsøk ble godkjent av den institusjonelle komité for dyreforsøk i Kurume University School of Medicine (Permit Number: 1334) og gjennomført i henhold til guide for omsorg og bruk av forsøksdyr i National Institute of Health og forskrift for forsøk med dyr av Kurume University School of Medicine. Mus ble avlivet ved cervikal dislokasjon under dietyleter anestesi, og alle forsøk ble gjennomført for å redusere lidelse. Cultured HAK-1B eller KIM-1 (10
7 celler /mus) var subkutant (sc) injisert i ryggen av fem uker gamle BALB /c atymiske nakne mus (Clea Japan, Inc., Osaka, Japan ). Fem til syv dager senere, når den største diameter av tumoren, noe som ble målt ved hjelp av målepunktet, nådde ca. 5 ~ 10 mm (dag 0), tumorvolum (mm
3) ble beregnet i ligningen «den største diameter X (minste diameter)
2 X 0,5 «, og deretter ble musene inndelt i 5 grupper (n = 8 hver). Tumorvolumet ble målt på dag 0, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, og 14. Mus kroppsvekt ble målt på dag 0, 8 og 14. Etter to ukers behandling ble musene drept på dag 15 og selve tumorvekten ble også målt. I forsøk 1, de 5 grupper på 8 mus fikk enten fosfat-bufret saltvann (PBS) (kontroll) eller PBS med de forskjellige doser av PEG-IFN-α2a (0,06 til 60 pg) en gang i uken i 2 etterfølgende uker (dag 1 og dag 8). Den kliniske dose av PEG-IFN-α2a i kronisk hepatitt C behandling er ca 3 mg /kg og tilsvarer den laveste dosen (0,06 ug /mus = 840 IE /mus) i dette eksperimentet. Etter å ha drept, ble resekterte tumorer anvendt for morfologiske studier (f.eks HE farging og immunhistokjemi) og enzym-bundet immunosorbent assay (ELISA) analyse. Hver mus mottok en intraperitoneal injeksjon av 1 mg av BrdU 30 min før fellingen. I eksperiment 2, for å undersøke forskjellen mellom ikke-pegylerte, og pegylerte IFN, 5 grupper på 8 mus mottok enten PBS (kontroll), PBS med 0,0042 eller 0,042 pg av IFN-α2a (840 eller 8400 IU, henholdsvis), eller PBS med (henholdsvis 840 eller 8400 IU,) 0,06 eller 0,6 mikrogram av PEG-IFN-α2a. I dette eksperimentet, ble tumorvekt på dag 15 og antall av apoptotiske celler sammenliknet mellom gruppene.
morfologisk undersøkelse av Subkutan Svulster av hårløse mus
Antall celler som viser egenskapene til apoptose (f.eks cytoplasma svinn, kromatin kondens, og kjernefysisk fragmentering) ble regnet i minst tre 0,25 mm
2-områder innenfor en HE-farget prøven, og gjennomsnittlig antall per område ble oppnådd. Tunel teknikk (ApopTag
® Peroxidase
In Situ
apoptose Detection Kit, Chemicon International, Inc, CA) ble brukt til å påvise apoptotiske celler, og gjennomsnittlig antall TUNEL-positive celler per område ble innhentet, som beskrevet ovenfor. Prøvene ble også immunfarget for BrdU innlemmet ved hjelp av BrdU Farging Kits (Oncogene Forsknings Products, Boston, MA), og det gjennomsnittlige antall positive celler pr området ble oppnådd som beskrevet ovenfor. I tillegg ble dobbelt-immunofarging utført med anti-muse-endotelcelle-antistoff, anti-human α-SMA-antistoff, Histofine enkel flekk mus MAX-PO (Rotte) kits (Nichirei, Tokyo, Japan), og HistoMouse ™-pluss-kits for å oppdage arterie-lignende blodkar som er beskrevet i vår forrige rapport [21,22]. Antallet av dobbelt-immunofarging-positive blodkar i tumoren ble tellet på hver prøve. Granulasjonsvev innen tumoren ble ekskludert fra telling av blodårer. Størrelsen på telte området ble målt ved å spore omrisset som vises på en dataskjerm ved hjelp av Mac OMFANG (Mitani Corp., Chiba, Japan). Fra den oppnådde antall fartøy per arealenhet (mm
2) ble gruppen middelverdien erholdt for gruppen sammenligning.
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
Deler av den resekterte xenografttumorer ble homogenisert i 500 mL av iskald Ca
2+ og mg
2 + -fri PBS som inneholder 100 mg /ml phenymethylsulfonyl fl uoride bruker en pellet stampe. Blandingen ble sentrifugert i 10 minutter (12.000 g, 4 ° C), og supernatanten ble lagret ved -20 ° C inntil bruk. Etter bestemmelse av mengden av det vev-protein i supernatanten ved bruk av en BCA proteinanalyse-reagens (Pierce, Rockford, IL), er mengden av basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF) og IL-8 ble målt ved anvendelse av kommersielt tilgjengelige ELISA-sett ( R D Systems, Minneapolis, MN)
statistikker
Sammenligning av beregnet tumorvolumet og kolocellevekst ble utført ved hjelp av to-faktor faktoriell ANOVA og Student
t Anmeldelser -. test, respektivt. De andre data sammenligninger ble utført med Mann-Whitney U-test.
Resultater
Effekter av PEG-IFN-α2a på leverkreft Cell Proliferation
in vitro
Tjuefire timer etter tilsetning av 4194 ng /ml av PEG-IFN-α2a, mild økning av den relative levedyktige celletall forekom i 9 cellelinjer (alle cellelinjer med unntak av KYN-2, HAK-1A, HAK- 6, og KMCH-1). Men etter 72 timer eller senere, en reduksjon i celletallet 10% eller mer forekom i alle cellelinjer (figur 1A). I HAK-2, HAK-3, og HAK-4, HAK-6, og KMCH-2, ble proliferasjon undertrykket opp til 72 timer og celletallet nådde et platå eller økte deretter. I de andre åtte cellelinjer, ble proliferasjon undertrykket i varierende grad opp til 96 timer.
(A) Kronologisk endringer i den relative levedyktig celletall (% av kontroll) etter tilsetning av 4194 ng /ml av PEG-IFN-α2a. Vekst ble undertrykket med tiden i 8 cellelinjer. (B) 96 timer etter tilsetning av 10 forskjellige konsentrasjoner av PEG-IFN-α2a. Celleproliferasjon ble undertrykt på en doseavhengig måte i 11 cellelinjer. Undertrykkelsen var signifikant (
P
0,0001 ~ 0,05) i de områder av 0,016 ~ 4194 ng /ml av PEG-IFN-α2a i HAK-6, 0,256 ~ 4194 ng /ml i KYN-3 og HAK-1A, 4,096 ~ 4194 ng /ml i KIM-en, KYN-en, HAK-1B, HAK-2 og KMCH-2, 16,4 ~ 4194 ng /ml hos KYN-2, HAK-5 og KMCH-en, 262 ~ 4194 ng /ml i HAK-4, og på 4194 ng /ml i HAK-3 (Student
t
-test). Åtte prøver ble anvendt i hvert eksperiment (n = 8). Forsøket ble gjentatt minst 3 ganger for hver cellelinje. Tallene representerer gjennomsnitt ± SE av forsøkene.
Den relative levedyktig celle nummer ble undertrykt i 11 cellelinjer (alle cellelinjer unntatt HAK-1A og KMCH-2) i en doseavhengig måte etter 96 timer-inkubasjon med PEG-IFN α2a (figur 1B). I 7 cellelinjer (HAK-1B, KMCH-1, KIM-1, Kyn-1, HAK-6, Kyn-3, og Kyn-2), ble antallet undertrykket til 50% eller mindre sammen med 4194 ng /ml PEG-IFN-α2a, og den 50% inhiberende konsentrasjon (IC50) var 253 ng /ml for HAK-1B, 670 ng /mL for KMCH-1, 1105 ng /ml for KIM-1, 1128 ng /ml for KYN- 1, 1302 ng /ml for HAK-6, 1524 ng /ml for KYN-3, og 4431 ng /ml for KYN-2. Ingen sammenheng ble påvist mellom det histologiske nivå differensiering av den opprinnelige tumor og følsomhet for den anti-proliferative effekt av PEG-IFN-α2a.
syttito timer etter tilsetning av 4194 ng /ml av PEG-IFN-α2a , 8 cellelinjer (alle cellelinjer med unntak KYN-3, HAK-1A, HAK-2, HAK-3, og KMCH-2) viste kjennetegn ved apoptose, f.eks, cytoplasmatisk krymping, kromatin kondensasjon, og atom fragmentering, i varierende grad og i en doseavhengig måte (figur 2). Utseendet av apoptose ble ytterligere bekreftet i HAK-1B og KIM-1 celler dyrket med 10 ng /ml (= 2,000 IU /ml) av IFN-α2a eller 144 ng /ml (= 2,000 IU /ml) av PEG-IFN-y α2a ved apoptose påvisningsmetoden (tabell 1). Ikke-pegylert IFN-α2a indusert mye mer apoptose enn PEG-IFN-α2a.
(A) Uten PEG-IFN-α2a i kulturmedium. (B) med 4194 ng /ml av PEG-IFN-α2a i kulturmedium. Apoptotiske celler (korte piler) preget av cytoplasma svinn, kromatisk kondens og kjernekraft fragmentering ble notert (HE flekker, X 200).
Annexin V-EGFP apoptotiske celler (%)
Cell linje
en
Kontroll
IFN-α2a
PEG-IFN-α2a
HAK- 1B4.1 ± 0,5
b18.5 ± 0.310.9 ± 0.5KIM-19,4 ± 0.447.0 ± 0.229.8 ± 2.1Table 1. Kvantitativ analyse av apoptose i HAK-1B eller KIM-en.
a Celler ble dyrket med medium alene (kontroll), IFN-α2a (10 ng /ml = 2000 IE /ml) eller PEG-IFN-α2a (144 ng /ml = 2000 IE /ml).
b Mean ± SE. CSV Last ned CSV
Effekter av PEG-IFN-α2a på HCC Cell Proliferation i hårløse mus
Kronologisk endringer i estimert tumorvolumet etter subkutan injeksjon av kultivert HAK-1B eller Kim-1cells til hårløse mus er oppsummert i Figur 3. Doseavhengig avhengig~~POS=HEADCOMP undertrykkelse av tumorvolum ble observert hos mus som fikk PEG-IFN-α2a. I forsøket på HAK-1B tumorer, ble det observert en signifikant forskjell i endringer i tumorvolum, og tumorvekten mellom styre mus og mus som mottok 0,06, 0,6, 6 eller 60 ug av PEG-IFN-α2a (
P
0,0001 ved to-faktor faktoriell ANOVA, og
P
0,001 ~ 0,02 ved Mann-Whitney U test, figur 3A og tabell 2). I forsøket av KIM-1-tumorer, ble en signifikant reduksjon av tumorvolumet også observert ved anvendelse av PEG-IFN-α2a (
P
0,001 ved to-faktor faktoriell ANOVA, figur 3B). Det var signifikante forskjeller i selve tumorvekten mellom kontrollgruppen og PEG-IFN-α2a grupper, med unntak av PEG-IFN-α2a (0,06 ug) gruppe (tabell 2). Selve tumorvekt ved slutten av eksperimentet 2 ble sammenfattet i tabell 3. Subkutan injeksjon av 0,6 ug av PEG-IFN-α2a induserte signifikant reduksjon av tumorvekt, sammenlignet med kontrollgruppen og gruppen som mottok den samme internasjonal enhet av ikke-pegylert IFN-α2a (
P
0,005 og
P
0,03, henholdsvis). I dette forsøket var det ingen signifikant forskjell mellom kontrollgruppen og den PEG-IFN-α2a (0,06 ug) gruppe (
P
= 0,078).
Musene mottok en subkutan injeksjon av 0,06 (▲), 0,6 (○), 6 (●), eller 60 (Δ) ug av PEG-IFN-α2a, eller medium alene (kontroll) (□) , en gang i uken for 2 påfølgende uker. Pilene viser dagene etter injeksjon. Tallene representerer gjennomsnitt ± SE. *
P
0,0001, sammenlignet med de andre gruppene. †
P
0,01, sammenlignet med de andre gruppene.
Tumor vekt (g)
Behandling gruppe
en
HAK-1B
KIM-en
Control0.303 ± 0,05
b
c1.050 ± 0,24
Epeg-IFN-α2a (0,06 mikrogram) 0,141 ± 0,03
d0.725 ± 0,17
fPEG-IFN-α2a (0,6 mikrogram) 0,033 ± 0.010.439 ± 0.04PEG- IFN-α2a (6 mikrogram) 0,015 ± 0.010.434 ± 0.04PEG-IFN-α2a (60 mikrogram) 0,0 0,076 ± 0.05Table 2. vekten av subkutane svulster i HAK-1B eller KIM-1 celler i hårløse mus til å drepe ( Forsøk 1).
en kultivert HAK-1B eller KIM-1 celler (1,0 x 10
7) ble subkutant transplantert inn nakne mus. Fem grupper på 8 mus fikk enten fosfat-bufret saltvann (PBS) (kontroll) eller PBS med de forskjellige doser av PEG-IFN-α2a (0,06 til 60 pg) en gang i uken. Alle mus ble avlivet, og tumorvekten ble målt på den 15. dagen.
b Mean ± SE.
c
P
0,02, sammenlignet med PEG-IFN-α2a (0,06 ug) gruppe;
P
0,001, versus den PEG-IFN-α2a (0,6 ug) gruppe;
P
0,001, versus den PEG-IFN-α2a (6 ug) gruppe.
d.
P
0,02, mot PEG-IFN-α2a (60 mikrogram).
e Ikke signifikant, sammenlignet med PEG-IFN-α2a (0,06 ug) gruppe;
P
0,03, sammenlignet med PEG-IFN-α2a (0,6 ug) gruppe;
P
0,05, sammenlignet med PEG-IFN-α2a (6 ug) gruppe;
P
0,01, sammenlignet med PEG-IFN-α2a (60 ug) gruppe.
f.
P
0,05, sammenlignet med PEG-IFN-α2a (60 ug) gruppe. CSV Last ned CSV Behandling gruppe
en
aktiviteten av interferon (IU)
Tumorvekt (g)
apoptose (Antall celler /0.25mm
2)
Control0 IU0.726 ±
b, c7.6 ± 0,9
dIFN-α2a (0,0042 ug) 840 IU0.588 ± 0,07
d7.9 ± 0,9
gIFN-α2a (0,042 mikrogram) 8,400 IU0.531 ± 0,09 0,04
e7.6 ± 0,7
hPEG-IFN-α2a (0,06 mikrogram) 840 IU0.493 ± 0,04
f8.9 ± 0.9PEG-IFN-α2a (0,6 mikrogram) 8400 IU0.355 ± 0,03 9,7 ± 1,0 * Tabell 3. Den faktiske vekt og antall apoptotiske celler av subkutane svulster til å drepe (eksperiment 2).
en kultivert HAK-1B-celler (1,0 x 10
7) ble subkutant transplantert inn nakne mus. Fem grupper på 8 mus mottok enten PBS (kontroll), PBS med 0,0042 eller 0,042 pg av IFN-α2a (840 eller 8400 IU, henholdsvis), eller PBS med 0,06 eller 0,6 ug av PEG-IFN-α2a (840 eller 8400 IU, henholdsvis). Alle mus ble avlivet, og tumorvekten ble målt på den 15. dagen. Antallet av apoptotiske celler ble tellet i minst tre 0,25 mm
2-områdene i hver seksjon farget med hematoksylin og eosin, og det midlere antall pr område i hver gruppe ble erholdt.
b Mean ± SE.
c
P
0,005, versus den PEG-IFN-α2a (0,6 ug) gruppe.
d
P
0,02, sammenlignet med PEG-IFN-α2a (0,6 ug) gruppe.
e
P
0,03, sammenlignet med PEG-IFN-α2a (0,6 ug) gruppe.
f
P
0,02, sammenlignet med PEG-IFN-α2a (0,6 ug) gruppe.
g
P
0,05, sammenlignet med PEG-IFN-α2a (0,6 ug) gruppe.
h
P
0,001, versus den PEG-IFN-α2a (0,6 ug) gruppe. CSV ned CSV
Histologisk undersøkelse av de HAK-1B tumorprøver farget med HE viste at antallet av apoptotiske celler i mus behandlet med PEG-IFN-α2a (0,06 eller 0,6 ug) var betydelig høyere enn det for kontrollprøven, og antallet økte doseavhengig måte (figur 4, A og B, tabell 4). Forekomsten av apoptose i TUNEL-fargede seksjoner viste de samme tendensene som de som ble oppnådd i HE-fargede seksjoner (figur 4C og tabell 4). Immunhistokjemisk undersøkelse av BrdU opptak i HAK-1B svulster viste at det var ingen signifikant forskjell i BrdU merking indeksen mellom kontroll og PEG-IFN-α2a (0,06 eller 0,6 mikrogram) grupper (tabell 4). Som for apoptose, ble tilsvarende resultater ble observert i forsøk 2, hvor KIM-1 ble anvendt. Gruppen behandlet med 0,6 ug av PEG-IFN-α2a viste økt antall av apoptotiske celler enn kontrollgruppen. Det var ingen signifikant forskjell mellom kontroll og IFN-α2a gruppe. I tillegg gruppen behandlet med 0,6 ug av PEG-IFN-α2a (8400 IU) viste høyere antall av apoptotiske celler enn de med 0,042 pg av IFN-α2a (8400 IU).
(A) En kontroll mus som mottok kulturmedium alene. Svulsten viser et kompakt arrangement av tumorceller og en sinusoid lignende struktur i stroma. (B) En mus som mottok en s.c. injeksjon av 0,06 mikrogram av PEG-IFN-α2a. Det er noen apoptotiske kreftceller preget av svinn og eosinofil endring i cytoplasma, kromatin kondens og /eller fragmentering av kjerner (piler, HE farging, X200). (C) Den samme tumor som vist i (B). Det er noen TUNEL-positive celler som viser brune kjerner (piler, farget av tunel teknikk, X200).
Apoptose
b (Antall celler /0.25mm
2)
BrdU merking Index
c (Antall positive celler /0.25mm
2)
Behandling gruppe
en
HE beis
TUNEL metode
Styr 8,4 ± 0,8
d, e 9.6 ± 1.1
e32.3 ± 1,6
fPEG-IFN-α2a (0,06 mikrogram) 12,2 ± 1.015.4 ± 1.827.0 ± 2.6PEG-IFN-α2a (0,6 mikrogram) 12.4 ± 0.916.1 ± 1.531.3 ± 6.9Table 4. Mosebok av apoptotiske celler og BrdU-positive celler i menneske HCC svulster subkutant transplantert i nakne mus.
en kultivert HAK-1B-celler (1,0 x 10
7) ble subkutant transplantert inn i nakne mus. Fem grupper på 8 mus fikk enten fosfat-bufret saltvann (PBS) (kontroll) eller PBS med de forskjellige doser av PEG-IFN-α2a (0,06 til 60 pg) en gang i uken. Svulster av mus som fikk 6 eller 60 mikrogram av PEG-IFN-α2a kunne ikke brukes fordi svulstene var for liten til å evaluere. Alle musene ble drept på den 15. dagen.
b Antallet av apoptotiske celler ble tellet i minst tre 0,25 mm
2-områdene i hver seksjon farget med hematoksylin og eosin, og det midlere antall pr område i hver gruppe ble oppnådd. Antallet TUNEL-positive celler ble også tellet på samme måte.
c Antall BrdU-positive celler ble tellet i minst tre 0,25 mm
2-områdene i hver del, og det midlere antall pr område i hver gruppe ble oppnådd som merkingsindeksen.
d Mean ± SE.
e
P
0,02, sammenlignet med de andre gruppene.
f. Ikke signifikant, sammenlignet med de andre gruppene. CSV ned CSV
reseksjon tumor av PEG-IFN-α2a gruppen viste granulasjonsvev på midten av tumoren i varierende grad (figur 5). Arterier som dukket opp i granulasjonsvev ble ekskludert i blodkar teller innen svulst. Det var ingen signifikant forskjell i antall blodkar per arealenhet i den HAK-1B tumor og ekspresjon av bFGF og IL-8 i tumorene mellom PEG-IFN-α2a gruppe og kontrollgruppen (figur 5; Tabell 5 ).
(A) Tumorceller er erstattet med stor granulasjonsvev på midten av reseksjon av tumoren. (Pilspisser, flekker HE, X20). (B) Arterie-lignende blodårer i svulsten (pil, HE farging, X200). (C) Arterie-lignende blodåre i tumor (pil, CD34 /α-SMA dobbeltimmunfarging, X200).
Artery-lignende blodåre
b (antall fartøy /mm2 )
Nivåer i svulsten lysat
c (s /40 mikrogram cellulært protein)
behandlingsgruppen
en
innsiden av svulst
bFGF
IL-8
Control0 0,104 ± 0,02
d, e14.0 ± 1,8
e2.8 ± 1,0
Epeg-IFN-α2a (0,06 mikrogram) 0,194 ± 0.0519.8 ± 2.14.9 ± 1.3Table 5. Mosebok av arterie-lignende blodkar, og enzym-bundet immunosorbent analyse (ELISA) av angiogenese faktorer i humane HCC tumorer subkutant transplantert i nakne mus.
en dyrket HAK-1B-celler (1,0 x 10
7) var subkutant transplantert inn i nakne mus. Fem grupper på 8 mus fikk enten fosfat-bufret saltvann (PBS) (kontroll) eller PBS med de forskjellige doser av PEG-IFN-α2a (0,06 til 60 pg) en gang i uken. Svulster av mus som fikk 0,6, 6 eller 60 mikrogram av PEG-IFN-α2a kunne ikke brukes fordi svulstene var for liten til å evaluere. Alle musene ble drept på den 15. dagen.
b Antallet arterie-lignende blodkar i tumoren ble tellet på hver del, og det midlere antall pr område i hver gruppe ble oppnådd.
c Uttrykket nivåene av basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF) og IL-8 i det utskårne tumorene ble målt ved hjelp av ELISA.
d Mean ± SE.
e. Ikke signifikant, sammenlignet med PEG-IFN-α2a (0,06 ug) gruppe. CSV Last ned CSV
Diskusjoner
I
in vitro
studien, viste vi at PEG-IFN-α2a hemme vekst på 8 og 11 ut av 13 cellelinjer i et tids- og doseavhengig måte, men PEG-IFN-α2a var tilsynelatende mindre aktiv på en IC50 basis, sammenlignet med enten PEG-IFN-α2b eller IFN-α2b eller konsensus IFN-α eller BALL-1 lymfoblastoid IFN-α som ble testet i samme eksperimentelle tilstanden i våre tidligere rapporter [10,18,21]. For eksempel IC50 for HAK-1B-celler var ca. 253 ng /ml av PEG-IFN-α2a, 13,1 ng /ml av PEG-IFN-α2b, 2,4 ng /ml IFN-α2b, 0,7 ng /ml IFN-konsensus a og 1,1 ng /ml BALL-en lymfoblastoid IFN-α. På den annen side, i
in vivo
studien, subkutan injeksjon av PEG-IFN-α2a en gang i uken viste bedre antitumoreffekt på et tumorvolum eller vektbasis, sammenlignet med den til ikke-pegylert IFN-α2a. Disse resultatene kan støtte vår hypotese om at kontinuerlig kontakt med IFN induserer sterke
in vivo
antitumor effekter, og er ikke overraskende fordi det ble rapportert at PEG-IFN-α2a viste mindre aktive in vitro antiviral aktivitet og men hadde mye mer
in vivo
antitumor aktivitet enn ikke-pegylert IFN-α2a [23]. Vi viste også at PEG-IFN-α2a kan hemme formeringen av CHC-cellelinjer, så vel som HCC. I MTT-analyse, ble veksten av KMCH-1 undertrykkes selv om en annen CHC-cellelinje, KMCH-2 ikke var. En mulig forklaring på den annen følsomhet mellom KMCH-en og KMCH-2 er at opprinnelsen til KMCH-en er CHC, klassisk type og at av KMCH-2 er CHC med stamcelle funksjoner, middels celle subtype henhold til den nyeste WHO klassifisering [24]. Slike et stamcelle-egenskaper av tumoren kan være årsaken til IFN motstand. Et annet interessant funn i
in vitro
studien er avviket mellom resultatene av MTT analyse og apoptose deteksjon analysen. Når HAK-1B eller KIM-1 ble dyrket med PEG-IFN-α2a, IC50 for HAK-1B var mye lavere enn den for KIM-1 selv om HAK-1B viste lavere rate av apoptotiske celler enn KIM-1. Disse funnene tyder på at det kan være noen andre enn apoptose mekanismer som påvirker følsomheten til antitumor effekter av PEG-IFN-α2a. Vi har tidligere rapportert at både pegylert og ikke-pegylert IFN-α inhiberte proliferasjonen av dyrkede HCC celler ved indusering av cellesyklus-stans [10,18]. Ekspresjon av interferon-reseptor på tumorceller kan være en mulig faktor er relatert til antitumor effekt. For eksempel, Nagano et al rapporterte at ekspresjonen av denne type I IFN-reseptor på HCC vev kan være en nyttig indikator for å finne potensielle reagert til INF-α /5-fluorouracil kombinasjonsterapi [25]. Immunmodulering av IFN har også blitt godt undersøkt som en faktor relatert til antitumor effekt. I denne studien brukte vi atymiske mus, som mangler modne T-cellen, og humane IFN. Siden IFN er artsspesifikke [26], vi anta at dette immunmodulerende effekten er begrenset i vår studie, men dette bør bekreftes i fremtiden studie med mus IFN.
Morfologisk observasjon av subkutane svulster i nakne mus viste at s.c. injeksjon av PEG-IFN-α2a indusere den betydelige økningen av apoptotiske celler sammenlignet med kontrollgruppen. Dette resultatet i
in vivo
studien er konsistent med at i
in vitro
studie som viser karakteristiske forandringer av apoptose etter tilsetting PEG-IFN-α2a.
