Abstract
Bakgrunn
xenotropisk murine leukemi-relaterte retrovirus (XMRV) er en nylig oppdaget retrovirus som har vært knyttet til menneskelig prostata kreft og kronisk utmattelsessyndrom (CFS). Begge sykdommene påvirker en stor del av verdens befolkning, med prostatakreft påvirke en av seks menn, og CFS påvirker anslagsvis 0,4 til 1% av befolkningen.
hovedfunnene
Førtifem forbindelser, inkludert tjueåtte legemidler godkjent for bruk i mennesker, ble evaluert mot XMRV replikasjon
in vitro
. Vi fant at den retrovirale integrase inhibitor, raltegravir, var potent og selektiv mot XMRV ved submicromolar konsentrasjoner, i MCF-7 og LNCaP-celler, en brystcancer og prostatacancer cellelinje, henholdsvis. En annen integrase inhibitor, L-000870812, og to nukleosid reverstranskriptasehemmere, zidovudin (ZDV), og tenofovirdisoproksilfumarat (TDF) også hemmet XMRV replikering. Når kombinert, disse stoffene vises stort sett synergieffekter mot dette viruset, noe som tyder på at kombinasjonsbehandling kan forsinke eller hindre valg av resistente virus.
Konklusjoner
Hvis XMRV viser seg å være en årsaksfaktor i prostata kreft eller CFS, kan disse funnene gi rom for rasjonell utforming av kliniske studier
Citation. Singh IR, Gorzynski JE, Drobysheva D, Bassit L, Schinazi RF (2010) Raltegravir er en potent hemmer av XMRV, et virus innblandet i prostatakreft og kronisk utmattelsessyndrom. PLoS ONE 5 (4): e9948. doi: 10,1371 /journal.pone.0009948
Redaktør: Peter Sommer, Institut Pasteur Korea, Republikken Korea
mottatt: 18 februar 2010; Godkjent: 11 mars 2010; Publisert: 01.04.2010
Copyright: © 2010 Singh et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet støttes delvis av NIH stipend 2P30-AI-50409 (CFAR til RFS), og ved Department of Veterans Affairs (RFS). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. RFS er grunnlegger og hovedaksjonær i RFS Pharma, LLC som utvikler Amdoxovir klinisk og han får royalties fra salget av 3TC. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
xenotropisk murine leukemi-relaterte retrovirus (XMRV) er en nylig oppdaget smittestoff [1 ] som har vært knyttet til human prostatakreft [2] og kronisk tretthetssyndrom (CFS) [3]. Begge sykdommene påvirker en stor del av verdens befolkning, med prostatakreft som påvirker en i seks menn, og CFS påvirker anslagsvis 0,4 til 1% av befolkningen [4], [5]. XMRV nukleinsyre eller proteiner blir funnet i 27% av prostatacancer og i 68% av pasientene med kronisk tretthetssyndrom, og i løpet av mindre enn 4-6% av de normale kontroller, noe som tyder på en sammenheng mellom virus og human sykdom [2], [3- ].
CFS, en sykdom karakterisert ved alvorlig svekkende utmattelse, har hatt en usikker etiologi siden sin anerkjennelse. Mens en rekke virale midler og miljøgifter er foreslått å være assosiert med CFS, har ingen klare bevis for disse noen gang blitt presentert (anmeldt i [6]). Den nylige sammenslutning av XMRV med CFS fra Whittemore Peterson Institute i Reno, Nevada, mens langt fra å være bevist årsakssammenheng, er den sterkeste viral foreningen skal gjøres ennå. Tre nye rapporter, ved hjelp av plasmid DNA som positive kontroller, fant ikke XMRV hos CFS-pasienter i Europa [7] [8] [9]. Forekomsten av XMRV i prostatakreft i Europa er usikre, med en tysk gruppe rapporterer tilstedeværelsen av XMRV i menneskelige prostata [10], og den andre ikke påvise noen [11]. Men forestillingen om at et retrovirus kan være involvert i både kreft og en neuroimmune sykdom hos mennesker er ikke uten presedens. Human T-celle lymphotrophic virus, type 1 (HTLV-1), et retrovirus, forårsaker både T-celle lymfom /leukemi, så vel som tropisk spastisk paraparese, en myelopati på grunn av immundefekter som følge av virusinfeksjon.
Infeksiøs XMRV har blitt isolert fra sera av CFS-pasienter [3]. Tilstedeværelsen av sirkulerende infeksiøse retroviruspartikler i blod påkaller en scenario ikke ulikt infeksjon med en annen retrovirus, humant immunsviktvirus type 1 (HIV-1). Siden det er ingen effektiv behandling for denne dypt svekkende sykdom, til bruk av antiretrovirale midler som har vist seg å være rimelig sikker for menneskelig bruk, kan være til nytte. Oppdagelsen av effektive antiretrovirale midler mot XMRV ville tillate for rasjonell utforming av kliniske studier for å hindre utviklingen av prostatakreft eller å behandle CFS.
I denne studien rapporterer vi effekten av 45 forbindelser på XMRV replikasjon i MCF- 7 og LNCaP-celler, cellelinjer generert fra humane bryst og prostata cancer, respektivt. Vi studerte legemidler som brukes ved behandling av HIV-1-infeksjoner, så vel som forbindelser som anvendes for å behandle andre virusinfeksjoner hos mennesker. XMRV er en gammaretrovirus, nært knyttet til murine leukemi virus (MLV) [1]. På aminosyrenivået, deler den betydelig identitet med sekvensene av Moloney murin leukemivirus (MoMLV), en prototype MLV. Den maksimale likheten mellom XMRV og MoMLV proteiner som finnes i de sekvenser for viral protease (96% identitet), og den minst likheten er mellom de to kappeproteiner (66% identitet) [1]. Dessverre er ikke mange aktivt brukte antiretrovirale midler er blitt testet for aktivitet mot MLV, med unntak av ZDV, som effektivt undertrykker MLV [12], og er nylig påvist å være effektiv mot XMRV så vel [13]. I motsetning til dette, mens det er en mye informasjon på antiviral aktivitet mot viktige HIV-1-proteiner, er det svært liten likhet mellom HIV-1 og XMRV proteiner, med proteasene (PR) for de to virusene som deler 28% identitet på amino- syrenivå, reverstranskriptasehemmere proteiner (RT) som deler 17% og integrase (IN) proteiner som deler bare 14% identitet. Denne lave sekvenslikhet gjør det vanskelig å forutsi hvilken, om noen, av de antiretrovirale midler som er effektive mot HIV-1 vil være effektiv mot XMRV. Vi valgte flere legemidler fra hver hovedklasse antiretrovirale midler: nukleosid og ikke-nukleosid RT (NRTI og NNRTI), IN-hemmere, og PR-hemmere (PI). Konvolutt proteiner av XMRV og HIV-1 er allment divergerende i størrelse (70 kD og 160 kD henholdsvis), benytter forskjellige reseptorer for viral oppføring og ikke dele noen betydelig likhet. Derfor peptidomimetika som virker på HIV-1 konvolutt protein for å forhindre viral oppføring ble ikke inkludert i vår studie. Noen inhibitorer som er kjent for å hemme replikasjonen av retrovirus andre enn virus ble også undersøkt. Et betydelig antall forbindelser testet i vår studie, nemlig. 28 ut fra en total på 45, allerede er FDA-godkjent for behandling av infeksjon med HIV-1 eller andre virus. Vi rapporterer her for første gang at integrase inhibitor, raltegravir (RAL), er ekstremt potent og selektiv mot XMRV, når det brukes ved lave submicromolar konsentrasjoner i begge cellekultursystemer. En annen i inhibitor, L-000870812, og to NRTI, ZDV og tenofovirdisoproksilfumarat (TDF), også hemme XMRV replikasjon, men ved høyere konsentrasjoner. Når kombinert, disse forbindelsene vise synergieffekter, noe som tyder på kombinerte modaliteter til å behandle XMRV-infeksjon, og dermed forsinke eller hindre valg av resistente virus.
Resultater
Vi testet totalt 45 forbindelser som tilhører forskjellige klasser av HIV-1-inhibitorer, og et par hemmere av andre enn retrovirus, for deres evne til å inhibere replikasjon XMRV i dyrkede celler virus. LNCaP og MCF-7 celler ble valgt for sin evne til å støtte robust
in vitro
replikering av XMRV. MCF-7-celler, på grunn av sine bedre egenskaper i vekstkultur ble først anvendt for å teste alle 45 forbindelser (figur 1). Forbindelser med anti-XMRV aktivitet, ble deretter testet i både LNCaP og MCF-7-celler (tabell S1). For å bestemme om en reduksjon av virus frigivelse kan være på grunn av giftigheten av forbindelsen, og ikke på grunn av spesifikk antiretroviral aktivitet, ble cellulær morfologi overvåket hver 24 timer ved mikroskopisk undersøkelse, og en MTT [3- (4,5-dimetyltiazol-2- yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid] kolorimetrisk analyse ble anvendt for å måle potensialet cytotoksisitet produsert av forbindelsene. Supernatanter ble samlet opp hver 24 timer og analysert for virus frigivelse ved å måle RT-aktivitet. Inhibering av RT-aktivitet (se figur 2) ble fordelt på 3-6 eksperimenter som hver ble utført i duplikat, og brukes til å beregne median (EC
50) og 90% effektive konsentrasjon (EC
90) for hver forbindelse (Figur 1). For sammenligningsformål ble alle forbindelser evaluert i disse studiene også testet mot HIV-1
LAI i primære, humane lymfocytter.
Alle forbindelser ble undersøkt i duplikat minst tre ganger. Verdier som vises er gjennomsnittet av replikere analyser. * (4
S
) -8-klor-4-metyl-5- (3-metylbut-2-enyl) -3,4,5,6-tetrahydro-1H [1], [3- ] -diazepino [4,5,6-cd] indol-2 (2 Ah) -tion.
hemmere av HIV-1 revers transkriptase
følgende NRTI hemmere av HIV-1 RT ble testet i våre XMRV replikasjonsanalyser: ZDV, 3′-azido-3′-deoksyadenosin (AZA), 3′-azido-3′-deoksyguanosin (AZG), 3′-azido-3′-deoksy-5-methyl -cytidine (CS-92), lamivudine (3TC), emtricitabin [(-) – FTC], tenofovir (TNV) og dens prodrugform TDF, 9- (β-D-1,3-dioksolan-4-yl) guanin (dxg) og dets prodrug form, amdoxovir (DAPD, AMDX), (-) – karbovir (CBV), stavudin (D4T) og dens tilsvarende cytosin analog (D4C), Videx (ddl), zalcitabin (ddC), og 3 « -fluor-3»-deoksythymidin (FLT). Vi testet også NNRTI efavirenz, og en TIBO-derivatet som ble vist å være effektiv i et murint system [14]. Blant disse er de mest potente inhibitorer XMRV var ZDV og TDF (figur 2, A, B). EF
50 og EC
90 i MCF-7-celler ble 0,11 uM og 7,3 uM for ZDV, og 0,24 pM og 15,3 pM for hhv TDF (se figur 1). EF
50 og EC
90-verdier ble også bestemt i LNCaP-celler, en prostatakreft-cellelinje, og det var et konsistent forskjell på opp til fem ganger mellom de to cellelinjene, som kan være relatert til deres forskjellige forekomst av nukleosid opptak og bioomdanning til den aktive nukleosid trifosfat analog. EF
50 og EF
90 i LNCaP celler var 0,14 mikrometer og 1,1 mikrometer for ZDV, og 0,9 mikrometer og 4,2 mikrometer for TDF, henholdsvis. CBV, AZA, FLT og D4T alle viste mer enn 70% inhibering av XMRV replikasjon (se tabell S1), men ved mye høyere konsentrasjon på 100 uM. AZG, CS-92, (-) – FTC, 3TC, ddI, DAPD og DXG var stort sett inaktive på 100 mikrometer (figur 1). TFV var også ineffektive mot XMRV, sannsynligvis på grunn av sin polare natur, som ikke tillater tilstrekkelig medikament til å trenge inn i cellene. Den NNRTI efavirenz (EFV) og TIBO derivat, ikke påvise noen stor aktivitet mot XMRV.
Viral utgivelse fra XMRV-infiserte LNCaP celler i nærvær av økende konsentrasjoner av (A) ZDV (B) TDF ( C) RAL og (D) L-000 870 812, ble bestemt ved å måle RT-aktivitet i supernatantene. Prosent inhibering ble beregnet på grunnlag av infiserte celler eksponert for DMSO alene ble satt til 0% inhibering og naive celler i fravær av eventuelle forbindelser som er angitt ved 100% inhibering. Cellelevedyktigheten ble undersøkt ved mikroskopi, kvantifisert ved MTT-analysen, og er representert ved skyggelagte søylene. Data for hver forbindelse ble avledet fra et gjennomsnitt på minst tre uavhengige eksperimenter, hver utført i duplikat.
hemmere av HIV-1 integrase
I hemmere raltegravir (RAL eller MK- 0518) og L-000 870 812 [15] ble også evaluert for deres evne til å hemme XMRV i de to cellesystemer (Figur 1, Figur 2 C og D). Av alle de testede forbindelser, RAL var de mest potente, med en EC
50 til 0,005 uM og en EF
90 på 3,5 pM i MCF-7-celler, og en EC
50 til 0,03 uM og en EF
90 på 0,46 mikrometer i LNCaP celler (tabell S1). L-000870812, viste aktivitet mot XMRV replikasjon ved vesentlig høyere konsentrasjoner, med en EC
50 og EC 90 på 0,16 pM og 26,9 pM i MCF-7-celler, og 0,7 uM og 4,5 uM i LNCaP-celler, henholdsvis
.
hemmere av HIV-1 protease
Ni kjente HIV-1 PI ble evaluert for aktivitet mot XMRV (figur 1). Den mest effektive var nelfinavir, om enn med en EC
50 på 34,3 mikrometer. Følgende PI hadde svært beskjedne anti-XMRV aktiviteter: atazanavir (EF
50 av 64,8 mm), amprenavir (EF
50 av 68,0 mm), lopinavir (EF
50 av 72,2 mm), og ritonavir ( EF
50 av 76,4 mm). Darunavir, indinavir, sakinavir og tipranavir var egentlig ineffektive mot XMRV
in vitro
, når testet opp til 100 mikrometer.
hemmere av andre virus enn HIV-1
En velger antall av antivirale midler som er kjent for å inhibere andre retroviruser enn virus ble også undersøkt. Disse inkluderte anti-herpes medikamenter acyclovir (ACV), ganciclovir (GCV), vidarabin (ara-A), 5-jod-2′-deoksyuridin (IdUrd), penciklovir (PCV), foscarnet (PFA), Vistide (HPMPC) ; anti-hepatitt narkotika entekavir (ETV), telbivudin (LDT), og ribavirin (RBV). ETV ble også valgt fordi det ble nylig rapportert å hemme HIV-1-replikasjon, både
in vitro Hotell og hos mennesker [16]. Andre forbindelser som hevdes å være effektivt mot XMRV, MLV, HIV-1 og andre virus, slik som klorokin [17], dehydroepiandrosteron (DHEA) [18], metylenblått og aspirin ble også evaluert med hensyn til anti-XMRV aktivitet
in vitro
. Metylenblått er kjent for å ha antiherpetic aktivitet og også kan inaktivere HIV-1 [19]. Dessverre har de fleste av forbindelsene som er oppført ovenfor, bortsett fra IdUrd var ineffektive mot XMRV, eller var effektive ved toksiske konsentrasjoner (figur 1). IdUrd viste en lav terapeutisk indeks (TI, forholdet mellom CC
50 /EF
50), og kan ikke anses som en spesifikk antiviralt middel mot XMRV.
Kombinasjon effekter av aktive forbindelser på XMRV replikering
binære kombinasjoner av de mest potente stoffer, nemlig. RAL, L-000870812, TDF og ZDV ble testet for aktivitet mot XMRV i LNCaP celler. Forbindelser ble testet ved økende konsentrasjoner, i tre forskjellige sett, idet forholdet mellom de to forbindelsene holdes konstant. Dataene ble analysert ved anvendelse av CalcuSyn metoden opprinnelig beskrevet av Chou og Talalay [20]. En oversikt over resultatene for alle kombinasjoner evaluert i LNCaP celler er presentert i Figur 3.
Kombinasjons Index (KI) verdier ble bestemt for en gjensidig utelukkende samhandling ved hjelp CalcuSyn program, hvor CI 1 indikerer synergisme, CI = 1 indikerer additiv effekt, og CI 1 indikerer antagonisme. Vektet gjennomsnittlig CI verdi (CI
wt) ble tildelt som [CI
50 + 2CI
75 + 3CI
90 + 4CI
95] /10. RAL, raltegravir; TDF, tenofovirdisoproksilfumarat; . ZDV, zidovudin
For kombinasjonene som ble testet (RAL med TDF eller ZDV eller L-000870812, TDF med ZDV eller L-000870812, L-000870812 med ZDV), en additiv eller mest synergistisk interaksjon var bemerket på alle effektnivåer uten åpenbar cytotoksisitet ved de høyeste konsentrasjonene som brukes. I matematisk analyse av det ene av de fire stoffene (RAL, TDF, L-000 870 812, eller ZDV), den lineære korrelasjonskoeffisienten (
r
-verdier) av median-effekt plottet eller til deres konstante ratio kombinasjoner varierte 0,92 til 0,99 (data ikke vist), matchende loven om masse handling.
in vitro
effekten av kombinasjonen av RAL med enten TDF eller ZDV, viste en gunstig reduksjon dose ved alle forhold. I tillegg har alle Kombinasjon Index (CI) verdier (se Materialer og Metoder) var mindre enn 1, noe som tyder synergi når kombinasjonen prosenter av enten TDF eller ZDV og RAL ble analysert (figur 3). I tillegg ble to kombinasjoner av enten ZDV og L-000870812 eller TDF også testet. De veide CI (CI
wt) verdier på 0,1 til 0,5 for TDF + ZDV, indikerte synergieffekter på alle forhold som ble testet (figur 3). Videre er den doble kombinasjonen av L-000870812 og ZDV ved forholdet 01:02 indikerte en nesten additiv effekt (CI
vekt på 1,0); men på forholdet mellom 1:0.4, CI-verdien var 0,3, noe som indikerer synergisme (figur 3). Av betydning var at alle to kombinasjoner som inneholder RAL, den mest potente antiviralt middel mot XMRV, demonstrerte markert synergi ved alle effektnivåer uten noen åpenbar cytotoksisitet. Interessant, kombinasjonen av de to i-inhibitorer ikke antagonistisk eller additiv, men ble funnet å være synergistisk, noe som tyder på at disse to forbindelser kan ha forskjellige antivirale mekanismer (se diskusjon).
diskusjon
i fravær av en klar etiologi, har behandlingen av CFS vært både empirisk og ukonvensjonelle. Terapi har tatt med immunstimulerende behandling gjennom injeksjoner av staphylococcus toxoid [21], intravenøs immunglobulin terapi [22] [23], [24], og hydrokortison [25] hver med ujevne resultater. Interferon-β og TNF-α-inhibitorer er blitt forsøkt i meget små antall pasienter. Anti-depressiva, NSAIDs, angstdempende medikamenter, sentralstimulerende midler, anti-allergi narkotika og anti-hypotensive legemidler har alle blitt brukt, men er ikke universelt gunstig [26]. Mangelen på effektiv behandling har ført til bruk av planteekstrakter [27], homeopati [28], [29], hypnose [30], akupunktur [31], og hele kroppen periodisk akselerasjon spenning [32], ingen med vedvarende fordeler. De eneste regler for behandling som har noen påvist fordelene er kognitiv atferdsterapi og gradert treningsprogrammer, som begge ser ut til å hjelpe ved å forbedre mestring i stedet for å redusere symptomer [33]. Hvis, beviser XMRV å ha en årsakssammenheng med sykdom hos mennesker, da kunnskapen om at visse antiretrovirale midler hemme XMRV hos submicromolar konsentrasjoner
in vitro
, og har synergieffekter når kombinert, som vist i denne studien, kan føre til kliniske studier. Vi fant at RAL, L-000 870 812, ZDV, og TDF sterkt hemme XMRV i cellekultur, med RAL å være den mest potente, ved en EC
50 0,005 uM, og andre, slik som L-000 870 812 (EC
50 = 0,16 mm), ZDV (EF
50 = 0,11 mm) og TDF (EF
50 = 0,24 mm) være ganske effektiv også. I tillegg er disse forbindelsene hadde høye terapeutiske indekser, med verdier for ZDV = 591; TDF = 218; RAL = 18460 og L-000870812 = 378, noe som indikerer at det bør være mulig å oppnå terapeutiske antivirale nivåer med minimal toksisitet.
Flere stoffer som vi evaluert hatt en begrenset effekt på XMRV replikering
in vitro
. Noen av disse virkningene kan forklares med for tiden forståtte mekanismer. For eksempel, både 3TC og (-) – FTC trenger en funksjonell YMDD motiv i RT for å være aktiv. M184V mutasjon i HIV-1 RT gjør viruset resistent mot 3TC og (-) – FTC [34]. Disse stoffene er ineffektive mot MoMLV, fordi i MoMLV RT, V er den naturlige residuet i dette motiv i stedet for M. På tilsvarende måte er også den V naturlig rest på dette stedet i XMRV RT, noe som gjør 3TC og (-) – FTC ineffektiv. Hvorfor ingen av de HIV-1 PI var effektiv mot XMRV (et funn som er rapportert for den valgte PI før [13]) er fortsatt uklart på dette tidspunktet, men kan være relatert til størrelsen på PI lomme samt andre biokjemiske og strukturelle faktorer.
Det var en forskjell i aktivitet av forbindelser ved testing i forskjellige celletyper, noe som kan være relatert til medikamentopptak av celler, de ulike nivåene av naturlig dNTP i cellene, samt forskjellig intracellulær fosforylering kapasitet [35]. Generelt, EC
50 for de aktive forbindelser nevnt ovenfor var lavere i MCF-7 enn LNCaP-celler tyder på høyere potens. I forhold til HIV-1, er forbindelsene generelt var mindre potent mot XMRV enn HIV-1, spesielt i EC
90 nivå.
Bruken av monoterapi for behandling av HIV-infeksjoner har ført til utseendet av medikament resistent virus [36], [37]. Oppdagelsen av at RAL, L-000870812, TDF og ZDV har sterke synergieffekter når kombinert i kombinasjons lover godt for kombinasjonsbehandling ved XMRV infeksjon. Hvis XMRV infeksjon paralleller andre retrovirale infeksjoner, da bruk av antiretroviral kombinasjonsbehandling kan opprettholde XMRV undertrykkelse, hindre fremveksten av resistens mot antiretrovirale midler og muligens også føre til forbedring av sykdom. For HIV-1, virker kombinasjonsterapi spesielt godt når de kombinerte stoffene har forskjellige virale protein mål, eller i tilfelle av nukleosider, utnytte forskjellige kinaser for sin aktivering å NTP analoger [31]. Vi har derfor judiciously valgte legemiddelkombinasjoner som hemmer XMRV, som RAL med ZDV eller TDF eller L-000870812. Når dataene ble analysert ved bruk av robust metode for Chou og Talalay, ble additiv eller synergis interaksjoner finnes på alle effektnivåer når disse agentene ble testet i LNCaP celler. Av betydning var at ingen antagonisme ble notert for noen av kombinasjonene vurdert i disse cellene. Til vår overraskelse, selv de to i hemmere vises en synergistisk effekt. Både I-inhibitorer virker ved å inhibere strengen overføringsreaksjonen, men hvis deres virkningsmekanisme skulle være identiske, vil de viser en additiv effekt i kombinasjon. En synergistisk effekt tyder på at det kan være subtile mekanistiske forskjeller i handlingene til disse to i hemmere, et funn som bekreftes av upubliserte biokjemiske eksperimenter (personlig kommunikasjon, Dr. Daria Hazuda, Merck Research Laboratories, West Point, PA). Det er viktig å merke her, at XMRV skiller seg fra HIV-1 i en del som er av betydning for disse studiene: XMRV isolater viser svært begrenset sekvens diversitet i forhold til HIV-1 eller MLV. Av alle sekvensert XMRV isolater som i dag finnes, både fra tilfeller med prostatakreft samt CFS, hentet fra geografisk fjerne deler av USA, de to minste relaterte genomer skiller seg fra hverandre i bare 27 av totalt over 8100 nukleotider. En tilsvarende grad av begrenset genetisk mangfold har blitt funnet for HTLV-1 [38], en annen retrovirus innblandet i både kreft og neuroimmune sykdom. Det har blitt antydet at denne mangelen på variasjon i XMRV sekvenser innebærer at antall replikasjonssykluser i en infisert individ er begrenset [39]. Dette vil antyde at XMRV har et vesentlig lavere potensial for å utvikle resistente mutasjoner, sammenlignet med HIV-1. Videre er det sannsynlig at en kombinasjon av bare to medikamenter kan være tilstrekkelig for å hindre fremveksten av medikament-resistent mutant-viruset, selv om dette ville trenge å bli testet før noen terapeutiske anbefalinger kan gjøres. Vi har forsøkt å velge for RAL resistente virus i kulturen i flere måneder nå, og har ennå ikke vært vellykket på å isolere resistente virus.
Når en analyse for å måle XMRV viral belastning blir tilgjengelige, virusnivåer i blodet kan bli en objektiv surrogatmarkør for en effektiv respons på antivirale medikamenter, i tillegg til kliniske utfall. Mens det er ennå ikke klart om noen sykdommer er direkte forårsaket av XMRV, viser våre data at XMRV-infeksjoner kan forebygges eller behandles med spesifikke antivirale midler. I nærvær av noen bevis for kausalitet av menneskelig sykdom, bør våre funn gir grunnlag for å utforme kliniske studier for å behandle dem.
Materialer og metoder
XMRV, celler og infeksjon med XMRV
293T celler (ATCC, CRL-11268) ble transfektert med pXMRV1, en smittende klone av XMRV [2]. Virus frigjort i supernatanten ble høstet og titrert ved inokulering av MCF-7-celler, en brystkreft-cellelinje (ATCC, HTB-22) ved 70% konfluens, med en serie av ti-gangers fortynninger av XMRV i serumfritt medium, fulgt 36-48 timer senere ved fiksering av cellene i paraformaldehyd og prosessering for immunfluorescens ved å bruke et kanin-antiserum utviklet mot inaktivert XMRV [2]. Typiske viruspreparater ga titre på ca 2-5 × 10
6 smittsomme enheter /ml. Viruset ble fortynnet i serumfritt medium og anvendt for å inokulere cellene ved en multiplisitet av infeksjon (MOI) på omtrent 3, i nærvær av forskjellige antivirale forbindelser som beskrevet nedenfor. LNCaP, en prostatakreft-cellelinje (ATCC, CRL-1740) og MCF-7 celler ble dyrket til 50% konfluens i DMEM inneholdende 10% varmeinaktivert føtalt bovint serum, 100 ig /ml penicillin, og 100 IE /ml streptomycin. Cellene ble vasket to ganger med Dulbeccos fosfatbufret saltløsning (DPBS, Gibco), og inkuberes med det virale inokulum i 90 min ved 37 ° C i nærvær av 95% luft og 5% CO
2, ble cellene vasket to ganger med DPBS , frittliggende med Trypsin-EDTA (0,25% trypsin, Cellgro), og talt. Ett tusen celler ble tilsatt til hver brønn i en 96-brønns plate, sammen med et like stort volum av medium inneholdende retrovirale inhibitor ved to ganger den ønskede konsentrasjon. Inhibitorer ble oppløst i DMSO eller vann, avhengig av deres løselighet, og ble alle testet ved 0,01 til 100 uM i trinn 10-fold. Hvor stoffet ble funnet å være aktiv ved 0,01 uM, ble ytterligere fortynninger fra 1 nM til 0,01 nM testet. Hver inhibitor ble testet i duplikat i minst tre separate ganger i MCF-7-celler i en fullstendig blind måte ved hjelp av kodede forbindelser, og resultatene ble beregnet. Aktive forbindelser ble også evaluert med hensyn på antiviral aktivitet i LNCaP-celler for å bekrefte aktiviteten i en sekundær cellelinje kjent for å støtte XMRV replikasjon. For kontroller, ble brukt brønner som inneholder vann eller DMSO ved passende konsentrasjoner.
Analyser for cytotoksisitet og XMRV replikering
Hver brønn ble nøye overvåket for tegn på cellulær toksisitet på grunn av inhibitorer ved mikroskopisk observasjon hver 24 timer. I tillegg ble cellenes levedyktighet målt ved bruk av CellTiter 96 Aqueous One Solution celleproliferasjonsanalyse i henhold til produsentens (Promega, Madison, Wis). Viral frigjøring fra cellene ble analysert ved måling av RT-aktivitet i supernatanten. For dette ble supernatant fra hver brønn samlet hver 24. time og frosset ved -20 ° C inntil det ble analysert ved RT-analyse for virale frigivelse som tidligere beskrevet [40]. I korte trekk, oligo (dT) · poly (Ra) primer-templat ble utført i nærvær av radioaktivt merkede [α-
32P] dTTP og Mn
2 +. Etter inkubering virussupernatantene med RT-reaksjonsblandingen i 1 time ved 37 ° C, ble prøver prikket inn på DE81 DEAE-cellulosepapir (Whatman) og ikke-inkorporerte etikett vasket bort med 2 x SSC (1 x SSC = 0,15 M NaCl og 0,015 M natrium citrate). Virus-forbundet RT ble analysert ved hjelp av en Typhoon 9410 PhosphorImager (GE Healthcare) og kvantifisert med bilde J-programvaren (https://rsbweb.nih.gov/ij/). Hemming av viral utgivelse målt på dag 6 etter inokulasjon ble fordelt på 3-5 eksperimenter og plottet. Den antivirale EC
50 og cytotoksiske konsentrasjoner (CC
50) ble bestemt fra konsentrasjons-responskurven ved hjelp av median virkning metoden [20]. HIV-1-replikasjon ble utført som beskrevet tidligere bruker perifere mononukleære blodceller (PBMC) hentet fra det amerikanske Røde Kors, Atlanta, GA, som ble stimulert med phytohemagglutinin (PHA) for 72 timer [41].
kombinasjonsstudier
for å vurdere om de antivirale effekten av to legemiddelkombinasjoner: RAL med TDF eller ZDV eller L-000870812, TDF med ZDV eller L-000870812, L-000870812 med ZDV var synergistisk, additiv eller antagonistisk, ble medikamentkombinasjoner på flere faste forholdstall evaluert. RAL, L-000870812, ZDV og TDF ble først testet alene for å bestemme EC
50 og EC
90-verdier, minst tre ganger, hver i duplikat. For median-effekt-analyse, ble forbindelsene kombineres på flere prosenter basert på multipler av deres EC
50 eller EC
90 verdier. For hvert medikament (alene eller i kombinasjon), ble tre til fire uavhengige eksperimenter utført og alle prøver ble behandlet i duplikat. Analysene ble utført ved hjelp av programvaren CalcuSyn (Biosoft, Ferguson, MO, USA) (se figur 3 for CI-verdier), som tillater automatisert simulering av synergisme og antagonisme ved alle dose og effektnivåer og viser metoder for Chou og Talalay [20] , inkludert median effekt tomt og CI-verdier. Fordi de høye grad effektene er mer terapeutisk relevant enn den lave graden av effekter, ble ytterligere vektet gjennomsnitt CI (CI
wt) beregnet, som bruker formelen: CI
wt = [CI
50 + 2CI
75 + 3CI
90 + 4CI
95] /10, der CI
50, CI
75, CI
90, CI
95 er CI-verdier på 50 %, 75%, 90% og 95% inhibering, respektivt. [20], [42].
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1.
EC50, EC90 og CC50-verdier av forbindelser som er aktive mot XMRV i MCF-7-celler, som ble testet i XMRV-infiserte LNCaP-celler. Forbindelser som ble funnet å ha betydelig aktivitet i MCF-7-celler ble testet i LNCaP-celler for aktivitet. Alle forbindelser ble undersøkt i duplikat minst tre ganger. Verdier som vises er gjennomsnittet av replikere analyser. Tilsvarende verdier i MCF-7 celler er vist for sammenligning
doi:. 10,1371 /journal.pone.0009948.s001 plakater (0,11 MB TIF)
Takk
Vi takker Mervi Detorio og Melissa Johns for deres utmerkede teknisk assistanse, og Daniel Choe og Robert Schlaberg for deres hjelp med foreløpige eksperimenter.
