Abstract
I løpet av det siste tiåret, har flere studier omfattende rapportert at aktivert natural killer (NK) celler kan drepe autologe umodne dendrittiske celler (DCS) in vitro, mens de spare fullt aktivert DC. Dette førte til forslaget som aktiverte NK-celler kan velge en mer immunogen undergruppe av DC under en beskyttende immunrespons. Men det er ingen demonstrasjon at autologe DC dreping av NK-celler er en hendelse som skjer
in vivo Hotell og dermed forblir den funksjonelle relevansen av dette drapet unnvikende. Her kan vi rapportere at en betydelig reduksjon av CD11c
+ DC ble observert i drenering lymfeknuter fra mus inokulert med MHC-blottet celler som NK-celle mål i stand til å indusere NK-celleaktivering. Dette
in vivo
DC redigering av NK-celler var perforin avhengig, og det var funksjonelt relevant, siden restlymfeknute DCs vises en forbedret evne til å indusere T-celledeling. I tillegg, i en modell for anti-kreft-vaksine, administrering av MHC-blottet cellene sammen med tumorceller økte antall tumor-spesifikke CTL og resulterte i en signifikant økning i overlevelse hos mus etter utfordring med en dødelig dose av tumorceller . Uttømming av NK-celler, eller bruken av perforin knockout-mus sterkt redusert tumor-spesifikke CTL utvidelse og dens beskyttende rolle mot tumorcelle utfordring. Som helhet, våre data støtter hypotesen om at NK-celle-mediert DC drap finner sted
in vivo Hotell og er i stand til å fremme utbygging av kreft CTL. Våre resultater viser også at kreftvaksiner kan forbedres ved strategier som tar sikte på å aktivere NK-celler
Citation. Morandi B, Mortara L, Chiossone L, Accolla RS, Mingari MC, Moretta L, et al. (2012) Dendritic Cell Redigering av Aktivert naturlige drepeceller resulterer i en mer beskyttende Cancer-spesifikk immunrespons. PLoS ONE 7 (6): e39170. doi: 10,1371 /journal.pone.0039170
Redaktør: Francesco Dieli, Universitetet i Palermo, Italia
mottatt: 19 mars 2012; Godkjent: 16 mai 2012; Publisert: 19 juni 2012
Copyright: © 2012 Morandi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet har vært støttet av Associazione Italiana Ricerca sul Cancro https://www.airc.it) IG5624 og IG11650 til GF og IG 8862 til RSA; av Minis Italiano della Salute – Programma Strategico Ricerca Oncologica (https://www.ministerosalute.it/) til GF; av Fondazione Cariplo 2008-2230 (www.fondazionecariplo.it) og ved Minis Italiano dell «Istruzione, Universita», Ricerca, – Progetto Rilevanza Nazionale (https://prin.miur.it/) 2008-WXF7KK til RSA. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
naturlige dreperceller (NK-celler), som opprinnelig ble identifisert som lymfoide celler som er i stand til å lysere en rekke tumorcellelinjer i fravær av foregående stimulering
in vivo
eller
in vitro
[1] – [3], er nå verdsatt som multifunksjonelle medfødte immunceller [4] – [6]. Deres aktivering styres av en balanse mellom signaler fra forskjellige grupper av aktiverende [7] og inhibitoriske reseptorer [8] -. [11], idet sistnevnte gjenkjenne MHC klasse I molekyler på målceller
Nylig har nøkkelen rolle for et samarbeids dialog mellom DC og natural killer (NK) celler i utløser immunresponsen har dukket opp [12] – [17]. Det har vist seg at deres interaksjon resulterer i en toveis aktivering og i utviklingen av en Th1 og CTL-mediert reaksjon [18] – [21]. Hos mennesker, i det minste
in vitro
, denne krysstale også resulterer i lyse av umodne DC, mens modne DC er beskyttet [13], [15]. Den aktiverende reseptor NKp30 og DNAM-1 er kritiske reseptorer for DC lysering, mens motstand mot lysering medieres av oppregulering av MHC klasse I-molekyler under DC modning [15], [22] – [24].
på grunnlag av disse in vitro-funnene, er det blitt foreslått at dreping av umodne DC ved hjelp av NK-celler bør fremme overlevelsen av de mest immunogene DC (dvs. modne DC), favoriserer initiering av en effektiv og beskyttende immunrespons [25] -. [27]
in vivo
, DC /NK-celle-interaksjoner kan forekomme i lymfoide organer, så vel som i ikke-lymfoide vev [28]. Adoptivt overført,
ex vivo
generert, er umodne DC blitt rapportert å bli hurtig fjernet ved hjelp av NK-celler via TNF-relatert apoptose-induserende ligand (TRAIL) [29], [30]. Tilsvarende har det vist seg at transplantasjon av alloreaktive NK-celler kan undertrykke T-celle-mediert graft-versus-host-sykdom ved å eliminere verts DC [31], [32]. I løpet av kroniske virusinfeksjoner, en avvikende DC mottakelighet for NK-celle-formidlet lysering resulterte i en opphopning av dårlig immunogene DC i lymfeknuter, forårsaker progressiv immun dysfunksjon [33]. På den annen side kan likelysering av NK-celler også negativt regulerer varigheten av virus-spesifikke T-celle responser
in vivo
ved å begrense eksponeringen av T-celler til infiserte antigen-presenterende celler [34].
Men DC drap av autologe NK-celler
in vivo
har ikke vært direkte demonstrert oppdatert og potensialet relevansen av denne lyse under en fysiologisk immunrespons gjenstår å bli vurdert.
en antall
in vivo
modeller har gitt bevis for at NK-celle anerkjennelse av MHC klasse i-mangel målceller resulterer i en forbedret generasjon av CTL mot svulster [21], [35]. I disse eksperimentelle modeller, aktiverte NK-celler produserer cytokiner som, i sin tur, ser ut til å fremme første DC-aktivering og deretter et beskyttende CTL-respons mot sperre tumorer. Dette fikk oss til å undersøke hvorvidt, under en beskyttende immunrespons mot tumorer, kan aktiverte NK-celler også velge en mer immunogen undergruppe av DC. Vi viser her at DC redigering skjer
in vivo Hotell og at dette fenomenet spiller en nøkkelrolle for tumor-spesifikke CTL utvikling og mus overlevelse i en murine modell av svulsten vaksinasjon.
Diskusjon
Resultater og
Aktivering av NK-celler i perifert vev resulterer i en perforin avhengig reduksjon av DC innhold i Tømming lymfeknuter
Mus ble inokulert sc med YAC-1, en MHC-blottet cellelinje, som et NK-celle mål i stand til å indusere NK-celleaktivering. Etter 36 timer, DC avledet fra både drenering og controlateral LN ble analysert. Som vist i figur 1, både den prosentvise og det absolutte antall CD11c
+ DC ble dramatisk redusert i drenering LNS sammenlignet med controlateral LNS (p = 0,0029 for den prosentvise og p = 0,007 for absolutte tall).
In vivo
uttømming av NK-celler ved å injisere anti-asialo-GM1 monoklonale antistoffer (mAbs) falt dette fenomenet, som bekrefter den store rollen NK-celler. I drenering LNS fra NK-celle-fratatte mus, både prosentvis og absolutt antall CD11c
+ DC var sammenlignbare med controlateral LNS, noe som indikerer at NK-celler skal være involvert i reduksjon av DC. Anti-asialo GM1-mAb-behandling førte til en reduksjon på minst 80% av NK-celler (figur 1 B). Disse resultatene antydet at nedgangen i antall DC observert i drenering LN ble NK-celleavhengig og tilsynelatende påfølgende til NK-celleaktivering ved gjenkjenning av MHC-blottet celler
A:. Representative analyser av mononukleære celler isolert fra enten drenering eller controlateral (Kontroll LN) lymfeknuter av mus brukt opp eller ikke av NK-celler (Tømming LN + anti-asialo GM1). B: NK-celler er effektivt utarmet på mus ved administrering av anti-asialo GM1 mAbs. C: prosent (til venstre) og det absolutte antall (til høyre) fra DC blant mononukleære celler isolert fra lymfeknuter. Barer representerer gjennomsnittsverdier og SD av fem uavhengige eksperimenter (tre mus per gruppe). ** = P 0001; * = P 0005.
En mulig forklaring på den observerte reduksjonen av DC celle tall på NK celle aktivering er utgivelsen av spesifikke cytokiner, av NK-celler, i stand til å påvirke overlevelsen av DC eller deres evne til å migrere fra periferien til LN. Alternativt kan NK-celler påvirke antallet DC i drenering LN ved direkte lyse
For å belyse mekanismen bak nedgangen i DC tall, vi gjentok det samme eksperiment i perforin knockout (pFN
-. /- ) mus, ettersom perforin er et viktig molekyl for NK-celle cytotoksisitet. I PFN
– /- mus, var det ingen forskjeller i antall og andel av CD11c
+ DC funnet i drenering og controlateral LNS (ikke vist). Disse data tyder på at perforin avhengig cytotoksisitet kan representere en sti i NK-cellen avhengig reduksjon av LN DC.
NK celle aktivering Velger Lymph Node DC med Higher T Cell Aktivering Capability
NK-celler har vist seg å drepe umodne DC
in vitro product: [13], [15]. En tolkning for den spesifikke drapet på sunne autologe celler av NK-celler var at NK-celler kan handle for å kontrollere kvaliteten på DC under modning [26]. Denne hypotese innebærer at NK-celler ville hindre overlevelse av mindre immunogene umodne DC, noe som ville indusere upassende, lav affinitet T-celle-priming, til slutt resulterer i en tilstand av tolerisasjon. Det endelige utfallet av denne DC redigeringsprosessen mediert av NK-celler kan derfor være valg av mer immunogene DC, på grunn av fjerning av DC som ville mislykkes i å formidle optimal T-celle grunning.
For å verifisere om dette mekanismen er funksjonelt relevant in vivo, vi testet om DC vedvarende i drenering LN etter NK celle redigering var phenotipically og funksjonelt mer immunogen. Grupper av mus som enten var NK-celle utarmet eller ikke var inokulert s.c. med YAC-1 celler. Etter 36 h DC fra dreneringen, og controlateral lymfeknuter ble analysert for ekspresjon av kostimulerende molekyler og modning markører så som CD40, CD80, CD83, CD86 ved strømningscytometri og for IL12p35, IL-12p40 og IL23p19 mRNA ved hjelp av sanntids-PCR . I tillegg vurderte vi om DC vedvarende i drenering LN på NK celle redigering presenteres høyere T-celle aktivering evne. Splenocytter fra C57BL /6 mus ble stimulert med DC sortert fra lymfeknuter fra BALB /c-mus injisert med YAC-1-celler 24 timer før lymfeknute fjerning. Seks dager senere ble frekvensen av spredning evaluert som tap av CFSE fargestoff. Selv om signifikante forskjeller for de analyserte overflatemolekyler eller cytokiner ikke var merkbar (ikke vist), ble allogeneiske T-celleformering betydelig redusert når DC fra NK-celle-fratatte mus ble anvendt som stimulus (figur 2). Disse resultatene indikerer at NK-celle-formidlet reduksjon av DC-tallet representerer et funksjonelt relevant
in vivo
mekanisme ved hjelp av hvilken flere immunogene DC blir effektivt valgt. Faktisk, etter perifer NK celle aktivering, DC som finnes i drenering LNS ble redusert i antall, men utstyrt med mer potente T-celle aktiverende egenskaper.
avtapping lymfeknute DCs av mus injisert subkutant med MHC
negcells ble sortert og dyrket i nærvær av allogene splenocytter tidligere merket med CFSE. A: Splenocytter ble dyrket alene (ingen stimulus) eller med 10% av høy-rene lymfeknute DC fra mus NK-celle utarmet (10% DC drenering LN + anti-asialo GM1) eller kontroll (10% DC drenering LN) før administrering av MHC -negative målceller. CFSE fortynning av splenocyttene ved 6 dagers dyrking er vist. NK celle uttømming kompromisser induksjon av spredning av LN DC. Dataene er representative for fire uavhengige eksperimenter oppsummert i panel B: ▪ = 10% DC drenering LN; ▴ = 10% DC drenering LN + anti-asialo GM1. * = P. 0,02
Den Redigering av DCs av NK-celler Fremmer antigenspesifikk T Cell Utvidelse og en mer beskyttende immunrespons Under Cancer Cell Vaksinasjon
Våre data viser at
in vivo
aktivering av NK-celler resulterer i en perforin avhengig reduksjon av LN dendrittiske celler, som er forbundet med nærværet av mer immunogene DC i drenering LN. Vi har derfor undersøkt om det resulterer i en mer beskyttende adaptive immunrespons hos en kreftcelle vaksinasjon modell. Grupper av mus, som hadde gjennomgått enten NK-cellemangel eller uekte behandling, ble injisert s.c. med MHC-blottet celler (dvs. YAC-1-celler) og TS /A-celler, en NK-celle-resistente tumor brystadenokarsinom cellelinjen. Som kontroller, ble grupper av mus injisert med enten TS /A eller YAC-1-celler alene. Etter tre uker ble milten samlet og cellene ble restimulert i kultur med TS /A-tumorceller eller AH1 peptid, som er en immunodominant MHC klasse I- begrenset epitop av TS /A gp70env antigen [36], [37]. Splenocytter fra mus som var blitt injisert med TS /A pluss YAC-1-celler viste signifikant høyere antall IFN-γ produserende celler ved stimulering i forhold til NK-celle utarmet mus eller kontrollmus (p 0,05 og mindre enn 0,01) (Figur 3 ,EN). Disse data indikerer at lysis av DC ved hjelp av aktiverte NK-celler understøtter ekspansjon av antigenspesifikke T-lymfocytter
in vivo
. Det ble ikke observert noen økning i IFN-y-produserende celler når kulturer ble restimulert av YAC-1-celler, noe som indikerer at økningen i IFN-y-produserende celler ikke var assosiert med NK-celleaktivering. I tillegg restimuleringen enten TS /A eller deres immunodominant MHC klasse I-begrenset epitop ZH1 induserte en tilsvarende økning av IFN-y-produserende splenocytes, noe som indikerer at de var i hovedsak representert av MHC-klasse I-begrenset cytotoksiske T-lymfocytter (CTL).
A: Mus ble inokulert med immunogene TS /A-celler, TS /A-celler blandet med MHC-blottet celler (YAC-1) eller YAC-1 celler alene. I en gruppe av mus, ble anti-asialo GM1 mAb administrert i.p. 48 timer før administrering av cellevaksiner for å utarme NK-celler. Etter 21 dager ble splenocyttene restimulert med enten TS /A-celler, ble det TS /A MHC klasse I-begrenset immunodominant peptid AH1 eller med YAC-1-celler og frekvensene av IFNy-produserende celler bestemt ved ELISPOT-analyse. En betydelig økning av antigenspesifikke IFNy-produserende celler ble observert hos mus vaksinert med TS /A blandet med YAC-1-celler (TS /A + YAC-1). Økningen i antigen-spesifikke CTL ble opphevet når musene var blitt oppbrukt av NK-celler før vaksinasjon (TS /A + YAC-1 + anti asialo GM1). B: Lignende eksperimenter ble utført i perforin KO mus (pFN
– /-) og parallelt med villtype (WT) mus. Et betydelig lavere antall TS /A tumor-spesifikk CTL ble indusert ved vaksinering i perforin KO-mus sammenlignet med villtype-mus. Barer representerer gjennomsnittsverdier og SEM av resultatene oppnådd i tre uavhengige forsøk (tre mus per gruppe). ** = P 0001; * = P 0005
For å belyse hvorvidt NK celle hjelp for CTL ekspansjon var faktisk knyttet til NK celle-mediert DC lyse, setter vi det samme eksperimentet ved hjelp av grupper av pFN
-. /- Mus, noe som mangel NK celle cytolytisk aktivitet. Miltceller fra pFN
– /- mus injisert med TS /A pluss MHC-negative celler YAC-1 inneholdt et betydelig lavere antall av IFN-y produserende T-celler sammenlignet med villtype-mus som ble også injisert med TS /Et pluss YAC-1 (figur 3, B). Disse resultater antyder at NK-celle-mediert, har perforin avhengig lysis av DC en rolle i den optimale genereringen av antigen-spesifikke T-celler. Men de foreliggende resultatene har også, i det minste delvis, en alternativ tolkning, dvs. at NK-celler kan direkte stimulere DC modning, mest sannsynlig ved å slippe pro-inflammatoriske cytokiner (for eksempel TNF-α), som tidligere demonstrert [21], [ ,,,0],35]. Faktisk, i perforin-manglende mus, aktivering av anti-tumor T-celler var ikke så lav som observert i NK-celle-fratatte mus ved anvendelse av anti-asialo behandling (figur 3 A). Således kunne den forbedrede antigen-spesifikk T-cellerespons, detekterbar ved NK-celle-mediert DC redigering representerer resultatet av både likestrøm dreping og cytokin-mediert DC-aktivering.
Til slutt vi også observert at vaksinasjon med bestrålte TS /A-celler plus YAC-1-celler resulterte i en betydelig økning av overlevelse av mus ved utfordring med en dødelig dose av TS /A-celler (figur 4). 60% av mus pre-injisert med bestrålte TS /A plus YAC-1 levde 8 uker etter tumor-utfordringen mens, i det samme tidsintervall, bare 20% av enten NK-celle-fratatte mus eller mus pre-injisert med bestrålte TS /A celler alene levde svulsten utfordring. Til sammen viser disse resultater støtter den teori at aktivering av NK-celler indusert av MHC-negative celler som kan fremme en mer beskyttende immunrespons i løpet av kreftcelle vaksinering.
Mus ble vaksinert med immunogene tumorceller alene (TS /A) , tumorceller blandet med MHC-negative alen (TS /A + YAC-1) eller MHC-negative celler alene (YAC-1) (fem mus pr gruppe). I en gruppe av mus, ble anti-asialo GM1 mAb administrert i.p. 48 timer før administrering av cellevaksiner for å utarme NK-celler. Etter 21 dager ble musene utfordret med en dødelig dose av tumorceller og overvåkes for tumorvekst to ganger i uken i to måneder. Mus vaksinert med tumorceller blandet med MHC-negative celler (TS /A + YAC-1) viste en forsinkelse i tumorvekst og en slående overlevelse til TS /A kreftcelle utfordring. Denne beskyttende effekten ble opphevet når mus ble tømt av NK-celler (TS /A + YAC-1 + anti-asialo GM1).
KOnKlUSJOn
Vi har her vist at NK celler kan lokke fram DC redigering
in vivo
. NK-celler, ved aktivering av MHC klasse I blottet celler, få muligheten til å velge de mest immunogene myeloide DC i drenering LNS via en perforin avhengig mekanisme. Selv om våre nåværende data ikke utgjør en formell bevis på direkte NK celle-mediert cytotoksisitet mot DC, opphevelse av fenomenet i pFN
– /-. Mus kan indikere en direkte likelyse av NK-celler
bemerkelsesverdig, fører dette antatte drapet til valg av mer immunogene DC, preget av en høyere kapasitet til å indusere spredning av allogene T-celler. Derfor, i tillegg til en direkte stimulering av DC mediert av NK-celle-frigis cytokiner, kan NK-celler bidra til T-celleaktivering ved å velge de mest immunogene DC.
Identifiseringen av den type NK-celler som er ansvarlig for redigeringsprosessen, samt områder hvor DC drapet angivelig skjer, gjenstår å bli identifisert. I denne sammenheng, er det mulig at dette arrangementet kan finne sted i periferien, hvor NK-celler er utstyrt med et høyere cytolytisk aktivitet sammenlignet med de som påvises i lymfeknuter. På den annen side kan vi ikke utelukke at under spesielle betingelser (for eksempel en cytokin storm) kan lymfeknute NK-celler veksle deres funksjonelle fenotype og får høyere cytolytisk potensial, som tidligere foreslått [38]. En alternativ mulighet er at perifere NK-celler som viser høy cytolytisk aktivitet kan migrere til lymfeknuter etter aktivering og kjøp av egnede kjemokinreseptorer, som foreslått av de siste rapportene [39] – [41]
Samspillet mellom aktiverte NK. celler og DC er også relevant for opprettelse av en beskyttende immunrespons. I en modell av anti-kreft-vaksine, administrering av tumorceller sammen med NK aktivere MHC-blottet-celler, forsterket utvidelsen av tumor-spesifikke CTL som resulterer i forbedret overlevelse hos mus etter utfordring med en dødelig dose av tumorceller. Uttømming av NK-celler svekket denne tumor-spesifikke T-cellerespons, så vel som dens beskyttende rolle mot tumor utfordring. Samlet utgjør disse resultatene indikerer at
in vivo
, kan NK-celler redigere DC for optimal generasjon adaptive immunresponser av et effektivt utvalg av de mer immunogene DC. Endelig våre data tyder også på at kreftcelle vaksiner kan forbedres ved strategier rettet mot NK-celleaktivering, slik som bruk av NK-sensitive kreftceller.
Materialer og metoder
Cell Lines, Animal Model og eksperimentelle forhold
TS /A brystadenokarsinom murine cellelinje [36] (vennlig levert av PL Lollini, Universitetet i Bologna, Bologna, Italia) var dyrket i DMEM /10% FCS (Cambrex, Charles city, IA, USA). Den YAC-1 (ATCC TIB-160) [42] var i stedet dyrket i RPMI 1640/10% FCS (Cambrex, Charles City, IA, USA). 5-8 uker gammelt villtype BALB /c (H-2K
d) mus og villtype C57BL /6 (H-2
b) mus ble kjøpt fra Harlan (Udine, Italia). Perforin
– /-. Mus (CByJ.B6-Prf1
tm1Sdz /J) ble kjøpt fra The Jackson Laboratory (Bar Harbour, ME)
Mus ble subkutant (sc) injisert med 2 x 10
6 bestrålt (20.000 rads) YAC-1 celler eller, der det er angitt, med enten bestrålte TS /A tumorceller alene (5 x 10
5) eller bestrålte TS /A tumorceller (5 x 10
5) blandet med bestrålte YAC-1-celler (2 x 10
6). Dyr under
in vivo
NK celle uttømming mottatt tre intraperitoneal (ip) injeksjoner med anti-asialo-GM1 antistoffer (anti-NK kaninserum, 200 mL /mus 1:10 fortynnet stamløsning, Wako) på dager -2 /0 /+ 1, som tidligere beskrevet [43] (dag 0 ble det dag av cellevaksinasjon. tumor utfordring ble gjort på tre uker etter vaksinasjon med en tumorigen dosen 5 x 10
4 av TS /A-tumorceller. tumorvekst og størrelse ble målt to ganger ukentlig ved hjelp av et skyvelære. Injeksjon av YAC-1 inn i BALB /c representerer en allogen system, men fraværet av både MHC klasse i og klasse II-ekspresjon i YAC-1-celler reduserer faren alloresponse. dyrene ble plassert i patogen-fri koloni og eksperimenter ble utført i henhold til den nasjonale forskriften om Animal Forskningsressurser og godkjent av Review Board av Istituto Nazionale per la Ricerca sul Cancro, Genoa.
Lymfoid Organ Cell Isolation
inguinal lymfeknuter (LNS) ble kirurgisk skåret ut og samles i RPMI 1640/10% FCS. De ble skåret opp i små fragmenter ved bruk av barberblader og spaltet i 2 mg /ml kollagenase D og 30 ug /ml DNase I (Roche, Mannheim, Tyskland) ved 37 ° C i 30 minutter. Enkeltcellesuspensjoner ble fremstilt ved filtrering gjennom et 70 mikrometer celle sil (BD Labware, San Jose, CA, USA). CD11c
+ celler ble isolert ved positiv seleksjon ved anvendelse av anti-CD11c mikroperler og en magnetisk separator (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany). Miltceller ble isolert ved mekanisk dissosiasjon og filtrat gjennom et 70 mikrometer celle sil (BD Labware). Erytrocytter i spleenic forberedelsene ble fjernet av hypoton lysis med NH
4Cl /KHCO
3 /EDTA.
Antistoffer og flowcytometri
Dyr gjennomgår
in vivo
NK celle uttømming fått to ip injeksjoner med anti-asilao GM1 på dag -2/0 (anti-NK kaninserum, 200 ul /mus av 1:10 fortynnet lagerløsning, Wako Neuss, Tyskland). Etter 36 timer fra injeksjon ble inguinal LNS høstet og cellesuspensjoner ble oppnådd ble merket med anti-CD11c, anti-DX5, anti-CD40, anti-CD80, anti-CD86 og anti-MHC klasse II (alle fra eBioscience, San Diego , CA) og analysert ved flowcytometri (Facs Canto II, BD).
Proliferation assay
For spredning analysen, miltceller fra B6 mus ble merket med 5 mikrometer carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE ) i PBS pluss 0,1% BSA i 10 minutter ved 37 ° C. Etter grundig vasking med PBS pluss 0,1% BSA, ble celler inkubert med allogene CD11c DC sortert fra drenering LN av mus injisert med YAC-1-celler som hadde eller ikke hadde vært utsatt for NK-celle uttømming. DCS ble grundig vasket i PBS før kultur med T-celler. Etter 6 dager ble CFSE fluorescens evaluert på CD3
+ celler ved flow cytometri.
Enzym-bundet immunospot Assays
Hyppigheten av IFN-y-produserende miltceller fra vaksinerte dyrene var bestemt etter tre uker ved en enzymkoblet immunospot (ELISPOT) analyse utført på splenocytter. Multiscreen-IP plater (Millipore, Bedford, MA og BD Pharmingen, San Jose, CA, USA) ble belagt over natten med 10 mikrogram /ml anti-IFN-γ mAb i PBS (Endogen, Woburn, MA og BD Pharmingen, San Jose , CA, USA). Platene ble så vasket med RPMI 1640 og blokkert i 3 timer med PBS-2% bovint serumalbumin. Splenocytter ble talt i fullstendig RPMI 1640 og deretter sådd ut ved en to-gangers seriell fortynning, med start fra 4 x 10
5-celler per brønn, i duplikat, i nærvær eller fravær av: (i) bestrålte (20.000 rad) TS /A tumorceller; (Ii) YAC-1-celler (både på 10:01 effektor /stimulator celle-forhold); (Iii) endogene retrovirale gp70-avledet peptid AH1, 9-amino-syre H-2L
d-begrenset peptid (SPSYVYHQF, syntetisert ved INBIOS S.r.l., Napoli, Italia) ved sluttkonsentrasjon på 10 ug /ml. ZH1 er immunodominant CD8 antigen uttrykt på overflaten av TS /A kreftcellelinjer [37]. Hvor angitt, ble cellestimulering også fremstilt ved PMA og ionomycin ved sluttkonsentrasjon på 50 ng /ml og 500 ng /ml, henholdsvis (SIGMA). Etter 40 timers inkubering ble platene vasket med PBS-0,05% Tween 20 og inkubert med 1 pg /ml biotinylert sekundært mAb til IFN-γ (Endogen og BD Pharmingen, San Jose, CA, USA) i PBS-1% bovint albumin i 3 timer ved romtemperatur. Pepperrot-peroksidase-konjugert streptavidin (1:5,000) ble deretter tilsatt i 2 timer ved romtemperatur. Etter vasking, ble platene farget med AEC flekker kit (Sigma og BD Pharmingen, San Jose, CA, USA) og flekker ble talt opp ved hjelp av en stereomikroskop. A 2-ganger økning i antall plasser enn kontrollen (splenocytter dyrket med ingen stimulus) ble betraktet som en positiv respons. Data ble uttrykt som antall stikkdannende celler per million av miltceller.
Statistical Analysis
statistisk signifikans av forskjeller ble evaluert med Student t test eller Mann Whitney test med Prism Graphpad programvare ( GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Alle feilfelt representerer SEM.
