Abstract
MDM2
proto-onkogen spiller en nøkkelrolle i sentrale cellulære prosesser som vekstkontroll og apoptose, og genet locus blir ofte forsterket i sarkomer. To polymorfismer som ligger i MDM2 promoteren P2 har vist seg å påvirke kreftrisiko. En av disse polymorfismer (SNP309T G; rs2279744) letter Sp1 transkripsjonsfaktor binding til promoteren, og er assosiert med økt kreftrisiko. I kontrast SNP285G C (rs117039649), som ligger 24 bp oppstrøms rs2279744, og i fullstendig koblingsulikevekt med SNP309G allelet, reduserer Sp1 rekruttering og senker kreftrisiko. Dermed har finjustering av MDM2 uttrykk vist seg å være av stor betydning med hensyn til tumorigenesis. Vi har vurdert mulige funksjonelle effekter av en tredje
MDM2
promoter P2 polymorfisme (SNP344T A; rs1196333) ligger på SNP309T allelet. Mens
i silico
analyser indikerte SNP344A å modulere TFAP2A, SPIB og AP1 transkripsjonsfaktor bindende, fant vi ingen effekt av SNP344 status på MDM2 uttrykk nivåer. Vurdere frekvensen av SNP344A hos friske kaukasiere (n = 2954) og pasienter som lider av eggstokkene (n = 1927), bryst (n = 1271), endometrial (n = 895) eller prostatakreft (n = 641), vi har oppdaget ingen signifikant forskjell i fordelingen av denne polymorfisme mellom noen av disse kreftformene og friske kontroller (6,1% hos friske kontroller, og 4,9%, 5,0%, 5,4% og 7,2% i kreftgruppene, henholdsvis). I konklusjonen, våre funn gir ingen bevis som indikerer at SNP344A kan påvirke MDM2 transkripsjon eller kreftrisiko
Citation. Knappskog S, Gansmo LB, Romundstad P, Bjørnslett M, Trovik J, Sommerfelt-Pettersen J, et al. (2012)
MDM2
Arrangøren SNP344T A (rs1196333) Status påvirker ikke kreftrisiko. PLoS ONE 7 (4): e36263. doi: 10,1371 /journal.pone.0036263
Redaktør: Klaus Roemer, Universitetet i Saarland, Tyskland
mottatt: 20 februar 2012; Godkjent: 04.04.2012; Publisert: 30 april 2012
Copyright: © 2012 Knappskog et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Studien ble støttet med tilskudd fra den norske Kreftforening og norsk Helse Vest. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
The Mouse Double Minute to homolog (MDM2) er en viktig regulator av p53 samt retinoblastom protein funksjon [1], [2], [3]. Dermed forhøyede MDM2 protein nivåer på grunn av
MDM2
genamplifisering eller andre mekanismer har vært ansett som et alternativ til
TP53
mutasjoner avtagende p53 funksjon i mange menneske kreft [2], [4], . [5], [6], [7]
i 2004 ble gruppen av A. Levine oppdaget en polymorfisme SNP309T G (rs2279744) i
MDM2
intronic P2 promoter [8] . SNP309G forbedrer
MDM2
uttrykk nivåer ved å øke SP1 transkripsjon faktor bindende og ble senere vist seg å være assosiert med økt risiko og en tidlig alder ved diagnose av flere kreftformer [8], [9], [10].
mens senere studier har bekreftet en sammenheng mellom SNP309G og risikoen for flere kreftformer, er effekten av denne SNP ser ut til å variere mellom etniske grupper: Så, mens de fleste studier utført i asiatiske eller askenasiske jøder bestander rapporterer SNP309G variant til . øker kreftrisiko mange studier utført i kaukasiske populasjoner har ikke klart å reprodusere en lignende effekt [11], [12]
Nylig rapporterte vi en annen polymorfisme, SNP285G C (rs117039649), som ligger 24 basepar fra SNP309 i
MDM2
P2 promoter. Den SNP285C variant allelet er observert blant kaukasiere bare, i hvem det danner en distinkt SNP285C /309G haplotype står for ca 12% av SNP309G lene [13]. SNP285C motvirker effekten av SNP309G ved å redusere SP1 transkripsjonsfaktor bindende styrke til
MDM2
promoter og er assosiert med en redusert risiko for brystkreft, eggstokkreft og livmorkreft [13], [14].
til sammen data fra studier på SNP309 og SNP285 indikerer sterkt finjustering av
MDM2
P2 promoter aktivitet for å være av betydning for kreftrisiko. Det er derfor av interesse å søke etter flere varianter i
MDM2
promoter som kan bidra til endret kreftrisiko
SNP344T . A (rs1196333), som ligger 35 basepar nedstrøms SNP309, var først identifisert av Bond et al [8] i 4 av 50 friske individer. Her presenterer vi den første rapporten vurdere virkningen av SNP344 status på MDM2 uttrykk samt kreftrisiko i store populasjoner. Derfor har vi undersøkt dens innvirkning på risikoen for eggstokkreft, brystkreft, livmor og prostatakreft, og studerte de samme pasient kohorter for hvilke risikoprofil knyttet til SNP309T G og SNP285G C har tidligere blitt analysert i detalj [13], [14].
Materialer og metoder
MDM2
arrangøren SNP344 status screening
Et område av
MDM2
promoter P2 inneholder SNP344 (samt SNP285 og SNP309) ble tidligere amplifisert ved PCR, sekvensert og analysert for SNP285 og SNP309 status [13], [14]. Her ble disse sekvens spor analysert for SNP344 status.
I silikoaluminofosfater
spådommer
Spådommer av potensielle transkripsjonsbindingssteder i
MDM2
promoter påvirket av SNP344 status ble utført ved hjelp av Jaspar databasen ved https://jaspar.genereg.net [15]. Input sekvenser for spådommer var
tgcctgtcgggtca
for SNP344T-allel og
tgcctgacgggtca
for SNP344A-allelet. Profil poengsum terskelen ble satt til 80% (standardinnstillinger).
MDM2 uttrykk analyse
Total RNA ble ekstrahert fra hvite blodceller hentet fra 215 unge menn som en del av en rutinemessig test i løpet av verneplikt i marinen [13] med Trizol reagens (Life Technologies) i henhold til fremstilling protokoll, og oppløst i DEPC behandlet DDH
2O.
Enkeltkjede-cDNA-syntese ble utført ved anvendelse av 500 ng total-RNA, oligo-dT – og tilfeldige heksamerprimere (Sigma) med Transcriptor revers transkriptase (Roche) i henhold til produsentens instruksjoner. Etter RT-PCR cDNA ble fortynnet 1:10 i DDH
2o.
Kvantitative PCRs for total MDM2 uttrykk nivåer, MDM2 promoter to spesifikke uttrykk og RPLP2 (intern referanse) ble utført ved hjelp av Hydrolyse prober ( TIB MOLBIOL) på en Ligthcycler 480 instrument (Roche). De følgende primere ble anvendt: MDM2_F; aacatgtacctactgatggtgc, MDM2_R; cagggtctcttgttccgaagc, MDM2_TM; 6FAM-aaccacctcacagattcc-BBQ, MDM2P2_S; gcgattggagggtagacctgt, MDM2P2_R: ggtattgcacatttgcctggat, MDM2P2_TM; 6FAM-agtggcgtgcgtccgtgcc-BBQ, RPLP2_F; gaccggctcaacaaggttat, RPLP2_A; ccccaccagcaggtacac og RPLP2_TM; 6FAM-agctgaatggaaaaaacattgaagacgtc-BBQ. Amplifikasjoner ble utført i et reaksjonsvolum på 10 pl ved bruk av LigthCycler® 480 Probes Master-sett (Roche) med 0,5 uM av forover og revers primer, 0125 pM av hver hydrolyse sonde og 3 pl cDNA. De termocykling Betingelsene var: 5 min innledende denaturering ved 95 ° C, før 45 sykluser ved 95 ° C i 10 s og ved 55 ° C i 20 s, og et avsluttende kjøletrinn ved 40 ° C i 10 sek. Relative MDM2 mRNA konsentrasjoner ble beregnet basert på i drevne standardkurver og normalisering til RPLP2 mRNA nivåer i de samme prøvene. Vann ble inkludert i hver kjøres som negativ kontroll og alle analyser ble utført i tre eksemplarer går.
Sunn kaukasiske kontroller
Fordelingen av
MDM2
SNP344 blant kreftpasienter ble sammenlignet med 2,954 norske friske kontroller. Kontrollene har blitt beskrevet i detalj tidligere [13], [14].
African American personer
DNA fra afroamerikanske individer (n = 50) ble kjøpt fra Coriell Institute for Medical Research ( Cat # HD50AA).
kreft~~POS=TRUNC pasienter~~POS=HEADCOMP
ovariesyndrom (n = 1927), bryst (n = 1271), endometrial (n = 895) og prostatakreftpasienter (n = 641) var fra pasient årskull som tidligere ble analysert for
MDM2
SNP285 og SNP309 [13], [14].
Etikk Hensyn
Innsamling og bruk av prøver fra kreftpasienter og friske kontroller , samt kontroller for uttrykk analyser, ble godkjent av Regional etiske komiteer i Vest Norge (Haukeland universitetssykehus), Midt-Norge (norsk teknisk-naturvitenskapelige universitet og teknologi), og Sør-Øst Norge (Oslo universitetssykehus Radiumhospitalet, norske eksempler) og det medisinske etiske komiteer Leiden University Medical Center, Leiden, Nederland, og Erasmus MC-Daniel den Hoed Cancer Center i Rotterdam, Nederland (nederlandsk prøver). Alle deltakerne ga skriftlig informert samtykke.
Statistisk analyse
Expression nivåer av MDM2 mellom personer med ulike genotyper av SNP344 ble sammenlignet med Mann-Whitney rank test. Blant personer for hvem MDM2 uttrykk ble analysert (n = 215), en næret den SNP344AA genotype. For statistiske beregninger, ble denne personen inkludert i SNP344TA gruppe og sammenlignet med SNP344TT gruppen.
Potensielle forskjeller i fordelingen av SNP344 mellom kreftpasienter og friske kontroller, samt mellom undergrupper av hver kreftformen ble vurdert av odds ratio (OR) og ved Fischer eksakte test. ORS er gitt med 95% konfidensintervall (KI).
Potensielle forskjeller i alder ved utbruddet av sykdom mellom ble vurdert av Kruskal-Wallis rang tester pasienter.
Overlevelse ble vurdert av Kaplan- Meier analyser hvor de ulike pasientgruppene ble sammenliknet med log rank test; dødsfall for andre enn brystkreft ble sensurert grunner.
Alle p-verdier er tosidig, og p-verdier er estimert av Fischer nøyaktige tester er kumulative. Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av SPSS /PASW (versjon 15.0.1 og 17) programvarepakken
Resultater
SNP344. Haplotype status og etnisk fordeling
SNP344 (rs1196333 ) ligger innenfor
MDM2
promoter P2, 344 bps nedstrøms av exon 1 (figur 1). Blant 2,954 sunne norske kontroller, observerte vi SNP344A-varianten i 181 individer (6,1%). En individuell næret homozygot SNP344AA genotype, mens 180 var heterozygote (SNP344TA, tabell 1). Dermed blir mindre allelfrekvens var 3,1%, og fordelingen av genotyper var i samsvar med Hardy-Weinberg likevekt.
(A) Arrangøren ligger mellom ekson 1 og 2 av
MDM2
genet og havner SNP285 (rs117039649), SNP309 (rs2279744) og SNP344 (1.196.333). (B) Representant sekvense kromatogram fra en person heterozygot for SNP344 (sekvens viste som omvendt komplementær til den forstand tråden).
Spesielt, observerte vi SNP344A-varianten bare blant personer skjuler den SNP309TT eller TG genotype, sterkt indikerer SNP344A å bli plassert på SNP309T-allelet, noe som gjør en tydelig SNP309T /344A haplotype (p 1 x 10
-10). Videre, siden SNP285C ligger på SNP309G-allelet, kan man utlede at SNP344A bare eksisterer i SNP285G /309T /344A haplotype.
I en kohort av afro-amerikanere (n = 50) fant vi 17 (34 %) personer til båtplass SNP344A (en homozygot og 16 heterozygot). Denne frekvensen var signifikant høyere i forhold til frekvensen observert blant hvite (p 0,001). Spesielt, fordelingen av SNP344 blant afro-amerikanere var i tråd med de begrensede data på denne SNP presentert i Ensembl database. Som for kaukasiere, fant vi SNP344A-allelet bare blant afro-amerikanere som bærer den SNP309T-allelet.
Effekt av SNP344 status på transkripsjonsfaktor bindende
For å vurdere den potensielle effekten av SNP344 status på transkripsjonsfaktor bindende, vi utførte
i silico
analyser med Jaspar databasen [15], spår transkripsjonsfaktor binding til SNP344T og A-alleler. Bruke «villtype» SNP344T-allelet sekvens og en profil poengsum terskel på 80% (standardinnstillinger) i databasen søket, ble to transkripsjonsfaktor bindingsseter identifisert inkludert stillingen som SNP344: ett bindingssete for TFAP2A og en for SPIB (Tabell 2). Ved utskifting av den SNP344T med A-varianten, ble det forutsagte bindingsstyrken av TFAP2A noe økt mens området for SPIB ble avbrutt. I tillegg innføring av A som genereres en ny bindingssete for AP1. Dermed transkripsjon effekt fra A-allelet, sammenlignet med T-allelet, kan enten bli redusert på grunn av en forstyrret SPIB nettsted eller økt som følge av økt binding av TFAP2A og en roman AP1 nettsted.
SNP344 status og MDM2 uttrykk nivåer
for å vurdere den potensielle effekten av SNP344 genotype på MDM2 uttrykk, analyserte vi MDM2 mRNA nivåer i leukocytter fra en undergruppe av 215 friske unge menn av qPCR. Ingen forskjell i MDM2 uttrykk nivået mellom individer som bærer den SNP344AA (n = 1), 344TA (n = 10) eller 344TT (n = 204) genotyper ble registrert (p 0,5 Figur 2A)
Box-plott. representerer log transformert relative nivåer av total MDM2 mRNA (A) og promoter P2 spesifikk mRNA (B) hos personer som bærer den SNP344TT genotype versus TA og AA genotyper.
Siden SNP344A-varianten befinner seg på SNP309T allel, vi utførte eget underkonsern analyser begrenset til enkeltpersoner som bærer den SNP309TG (n = 101) eller 309TT (n = 75) genotype. Ingen forskjell i MDM2 uttrykk nivå relatert til SNP344 status ble spilt inn i noen av disse undergruppene (p 0,4)
Siden en kan anta at SNP344 status bare påvirker MDM2 uttrykk fra promoter P2, der SNP er lokalisert, og at effekten av denne SNP kan maskeres i analyser analysere de totale MDM2 ekspresjonsnivåene, utførte vi lignende qPCR eksperimenter som beskrevet ovenfor, men spesifikk for mRNA som stammer fra promotoren P2. Ingen sammenheng mellom SNP344 status og promoter P2 spesifikke uttrykk ble observert (p 0,5).
SNP344 status og kreftrisiko
For å vurdere den potensielle effekten av SNP344 status på kreftrisiko, vi sammenlignet hyppigheten av SNP344 varianter blant eggstokkene (n = 1927), bryst (n = 1271), endometrial (n = 895) og prostatakreftpasienter (n = 641) med friske kontroller (n = 2,954). Resultatene er oppsummert i tabell 1. Vi fant ingen signifikante forskjeller mellom frekvensen av SNP344A i en hvilken som helst av de analyserte kreftgrupper og friske kontroller.
Gitt at SNP344A var knyttet til SNP309T-allel, som beskrevet i det foregå individer skjuler den SNP309GG genotype kan bli sensurert som ikke-informativ med hensyn til effekten av SNP344. Vi har derfor vurdert konsekvensene av SNP344 på kreftrisiko blant personer som bærer SNP309T-allelet bare (SNP309TG eller TT genotype, Tabell 3). Vi fant ingen sammenheng mellom SNP344 status og noen av de kreftformene analysere SNP309TG og 309TT bærere separat eller kombinert (figur 3).
Forrest plott som viser effekten av SNP344A på risiko for eggstokkreft, brystkreft, livmor og prostatakreft, sammenlignet med friske kontroller, blant individer som bærer den SNP309TG genotype (A), SNP309TT genotype (B) og TG og TT-genotyper kombinert (C).
SNP344 status og kliniske parametre
Vi videre vurdert den potensielle effekten av SNP344 status på flere kliniske parametre blant pasientene inkludert i kasus-kontroll sammenligninger er beskrevet ovenfor.
data for debutalder av sykdom var tilgjengelig for alle livmor (n = 895) og prostatakreftpasienter (n = 641), så vel som store under årskull av bryst (n = 1173) og eggstokkreft pasienter (n = 761). Vi fant ingen effekt av SNP344-status på debutalder i en av de fire kreftformene når en sammenligner totale pasientgrupper for hver kreftformen eller undergrupper stratifisert etter SNP309-status (alle p-verdier 0,15).
Blant de brystkreft pasienter analysert, mange ble innrullert i prospektive studier med sikte på å identifisere genetiske mekanismene for resistens mot kjemoterapi; n = 106 fra to undersøkelser som evaluerte enten doksorubicin monoterapi eller som en kombinert 5-fluorouracil /mitomycin regimer [16], [17], mens n = 201 ble oppnådd fra en studie randomisering mellom epirubicin og paclitaxel monoterapi [18], [19]. Derfor, for disse pasientene hadde detaljerte registreringer for objektiv respons på behandlingen i neoadjuvant situasjon. SNP344 status påvirket ikke svar på enten DNA skade legemidler (doxorubicin, mitomycin) eller spindel giften (paclitaxel; p 0,1 for alle sammenligninger) i disse studiene, selv om konklusjonen her kan være usikre på grunn av begrenset antall SNP344A-alleler observert. Den potensielle effekten av SNP344 status på tilbakefall-fri eller total overlevelse kan bli vurdert i disse studiene på grunn av begrenset antall individer som bærer den 344A-allelet.
I en tidligere studie fant vi MDM2 SNP285 status å korrelere å iscenesette i endometrial carcinoma [14]. Her ble det ingen sammenheng mellom FIGO stadium og SNP344 status registrert. (Alle p-verdier 0,3).
Diskusjoner
MDM2 er en viktig faktor som regulerer cellulær homeostase gjennom sin nære interaksjoner med proteiner som p53, pRB og E2F1. Dermed styrer MDM2 prosesser som vekst arrest, apoptose og senescence, og MDM2 genamplifisering og forbedret oversettelsen har blitt observert i mange kreftformer [2], [4], [5], [6], [7].
betydningen av MDM2 uttrykk i å forebygge kreftutvikling er ytterligere understreket av funn at
MDM2
promoter P2 SNPs 285 og 309 begge modulere transkripsjon faktor bindende og påvirke risikoen for flere kreftformer [8], [11], [13], [14]. Mens den eksakte mekanismen for transkripsjon innvielse fra
MDM2
promoter P2 er ikke kjent, dette promoter er aktivert i respons på cellulært stress, og i tillegg til SP1, P2 havner bindingssteder for flere transkripsjonsfaktorer, inkludert p53, den østrogen reseptor, AP1 [8], [14], samt flere andre (prediksjon av Jaspar database, data ikke vist).
SNP344T A er den tredje
MDM2
promotor P2 polymorfisme . Kontrast SNP285C, som ligger på SNP309G allelet, ligger SNP344A på SNP309T allelet. Her har vi utført
i silico
prediksjon evaluere transkripsjon faktor bindende kraft og bestemmes effekten av SNP344 status på MDM2 transkripsjonsnivåer i lymfocytter. Mens SNP344 ble funnet å påvirke binding av transkripsjonsfaktorene TFAP2A, SPIB og AP1, ble ingen effekt av SNP344 status på MDM2 transkripsjon registrert. Viktigere, vurdere utdeling av SNP344 i en stor kohort av friske personer og hos pasienter som lider av eggstokkene, brystkreft, livmor og prostatakreft, vi har oppdaget ingen forskjeller med hensyn til SNP344 fordeling mellom friske individer og kreftpasienter. Mens vår studie inkluderte et begrenset antall kreftformer, for tre av disse kreftformene (bryst, eggstokk slutten endometrium) den SNP285C varianten har tidligere vist seg å påvirke individuelle risikoen på samme etniske befolkningen [13], [14]. Dermed disse maligniteter representerer egnede kreftformer for å avdekke eventuelle effekter av SNP344 status på sykdomsrisiko
kontrast den SNP285G . C polymorfisme som er oppdaget blant kaukasiere bare [13], SNP344A, ligner SNP309G, ser ut til å være en gammel polymorfisme som også er til stede blant afrikanere. Interessant, fordelingen av SNP309G variant allelet, men også SNP344A, ser ut til å variere mellom ulike etniske grupper. Selv om frekvensen av det SNP309G allel varierer fra -10% i afrikanske til ~40% hos kaukasiske og -50% i asiater [12], frekvensen av det SNP344A allelet er omtrent 18% i afrikanske men 3% bare i hvite. Denne forskjellen i etnisk fordeling, tatt sammen med den raske spredningen av den unge SNP285C polymorfisme blant kaukasiere [20], viser at alle tre
MDM2
promoter P2 polymorfismer kan være gjenstand for evolusjonær utvalg under ulike levekår. Dermed kan ytterligere undersøkelser belyse eventuelle konsekvenser for SNP344 på biologisk funksjon annet enn de kreftformene som presenteres her, være berettiget.
Takk
Det meste av arbeidet ble utført i den Mohn Cancer Research Laboratory. Vi takker Beryl Leirvaag, Elise de Faveri, Gjertrud T. Iversen, Nhat Kim Duong og Hildegunn Helle for teknisk assistanse. Vi takker også The Medical Service, Kongelige Norske Marine og Det norske Forsvaret Medisinsk service for å tilrettelegge for prøvetaking. De kliniske etterforskere i Norsk Bryst Cancer Gruppe prøve NBCG VI er Gun Anker, Avdeling for kreftbehandling, Haukeland universitetssykehus; Bjørn Østenstad, Avdeling for kreftbehandling, Ullevål universitetssykehus; Steinar Lundgren, St.Olav universitetssykehus; Terje Risberg, Avdeling for kreftbehandling, Universitetssykehuset i Nord-Norge; og Ingvil Mjaaland, Seksjon for Hematologi og onkologi, Stavanger Universitetssjukehus.
