Abstract
Tidligere fikk vi bekreftet at CC kjemokinreseptor 7 (CCR7) fremmer celle spredning via ekstracellulære signal -regulated kinase (ERK) vei, men dens rolle i apoptose av ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) cellelinjer er ukjent. A549 og H460-celler av NSCLC ble anvendt for å undersøke effekten av CCL21 /CCR7 på apoptose ved hjelp av flow cytometri. Resultatene viste at aktivering av CCR7 av dens spesifikke ligand, eksogene chemokine ligand 21 (CCL21), ble forbundet med en signifikant nedgang i prosent av apoptose. Western blot og sanntids-PCR-analyser indikerte at aktivering av CCR7 vesentlig forårsaket oppregulering av anti-apoptotiske bcl-2 og nedregulering av pro-apoptotiske bax og caspase-3, men ikke p53, ved både protein og mRNA-nivåer. CCR7 liten interfering RNA dempes betydelig disse effektene av eksogene CCL21. Dessuten, PD98059, en selektiv hemmer av MEK som forstyrrer aktiveringen av nedstrøms ERK, avskaffet betydelig disse virkningene av CCL21 /CCR7. Coimmunoprecipitation ytterligere bekreftet at det var en interaksjon mellom p-ERK og bcl-2, Bax, eller caspase-3, særlig i nærvær av CCL21. Disse resultatene antyder sterkt at CCL21 /CCR7 hindrer apoptose ved oppregulering uttrykket av BCL-2 og ved downregulating uttrykk for Bax og caspase-3 potensielt via ERK sti i A549 og H460 celler av NSCLC
Citation.: Xu Y, Liu L, Qiu X, Liu Z, Li H, Li Z, et al. (2012) CCL21 /CCR7 Hindrer apoptose via ERK Pathway i Human ikke-småcellet lungekreft celler. PLoS ONE 7 (3): e33262. doi: 10,1371 /journal.pone.0033262
Redaktør: Dimitri Vavvas, Massachusetts Eye Ear Infirmary, Harvard Medical School, USA
mottatt: 03.11.2011; Godkjent: 06.02.2012; Publisert: 16 mars 2012
Copyright: © 2012 Xu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Disse forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kjemokiner, en familie med lav molekylvekt pro inflammatorisk cytokiner, har blitt beskrevet som viktige formidlere ikke bare i mobilhandel, organutvikling, vev remodeling, og tumor metastase [1] – [3], men i andre biologiske hendelser, slik som angiogenese, lymphopoiesis, proliferations, og apoptose [ ,,,0],4], [5]. Deres biologiske aktiviteter medieres ved interaksjon med kjemokinreseptoren familien av G-protein-koblede reseptorer (GPCR) (det vil si C, CC, CXC, og CX3C reseptorer) [6]. C-C kjemokin reseptor 7 (CCR7), en av CC kjemokinreseptorer, er uttrykt på alle naive T-celler, noen minne T-celler, B-celler og modne dendrittiske celler [7]. CCR7 interaksjon med sine ligander, chemokine ligand 19 (CCL19) og chemokin ligand 21 (CCL21) [8], spiller viktige roller i lymfocytt menneskehandel og målsøkende til lymfeknuter under immun- og betennelsesreaksjoner [9] -. [11]
Vår tidligere studie viser at CCR7 er sterkt uttrykt i menneske ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) celler, og at CCL21 /CCR7 fremmer spredning av A549 og H460 celler av NSCLC via ekstracellulære signalregulerte kinase (ERK) pathway [ ,,,0],12], [13]. ERK, en mitogenaktiverte proteinkinaser (MAPK) familiemedlem, er relatert til cellevekst, differensiering, cellesyklusregulering, celleoverlevelse, apoptose og [14] – [17]. Imidlertid har rollen som CCR7 i apoptose av menneskelige NSCLC cellene ikke er klarlagt.
Hensikten med denne studien var å undersøke effekten og reguleringsmekanisme av CCL21 /CCR7 interaksjon på apoptose av A549 og H460 human NSCLC celler. Vi demonstrert her at CCL21 /CCR7 forhindrer celle apoptose ved oppregulering av ekspresjon av anti-apoptotiske bcl-2, og ved downregulating ekspresjon av pro-apoptotiske bax og caspase-3, men ikke p53, som potensielt kan medieres via ERK-reaksjonsveien i NSCLC celler. Denne studien gitt romanen bevis for mekanismene for overlevelse av CCR7-mediert kreftceller, og det kan være nyttig for å utforske behandling målet for NSCLC.
Resultater
CCL21 /CCR7 hindrer apoptose av A549 og H460 celler. I vår tidligere studie har vi identifisert en høyere CCR7 ekspresjonsnivå i A549 humane NSCLC og H460-cellelinjer, og dens aktivering fremmer celle proliferasjon [12], [13]. For å avgjøre om aktivering av CCR7 påvirker også apoptose av A549 og H460 celler, ble CCR7 aktivering og hemming indusert med eksogene CCL21 og med CCR7 små interfererende RNA (siRNA), henholdsvis [13]. Annexin V-farging Analysen ble utført ved hjelp av flow cytometri for å bestemme effekten av CCL21 /CCR7 på apoptose av A549 og H460-celler. Som vist i figur 1, andelen av pre-apoptotiske celler i CCL21 gruppe betydelig redusert, sammenliknet med de andre (alle
P
0,01), mens det var ingen signifikante forskjeller mellom de andre (alle
P
. 0,05), som impliserer at aktiveringen av CCR7 kan hemme apoptose av A549 og H460-celler mens effekten av CCL21 kan oppheves ved hemming av CCR7
A549 (A) og H460 (B) celler ble behandlet med CCL21 (100 ng /ml) i 24 timer etter transfeksjon med CCR7 siRNA (siCCR7). Etter behandling ble beregnet ved hjelp av apoptose Annexin V-farging, som beskrevet i Metoder. Hver søyle representerer middelverdi ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. ** P 0,01, sammenlignet med kontrollceller
A549 (A) og H460 (B) celler ble behandlet med CCL21 (100 ng /ml) i 24 timer etter transfeksjon med CCR7 siRNA (siCCR7. ). Etter behandling, ekspresjon av bcl-2, Bax, caspase-3 og p53-protein i både (a) og mRNA (b) ble beregnet ved hjelp av western blot (a) og real-time PCR (b), som beskrevet i Metoder. Hver søyle representerer middelverdi ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. * P 0,05 og ** p. 0,01, sammenlignet med kontrollceller
A549 (A) og H460 (B) celler ble behandlet med CCL21 (100 ng /ml) i 24 timer etter eksponering til PD98059, en selektiv inhibitor av MEK som forstyrrer aktivering av ERK nedstrøms, i 1 time. Etter behandlingen ble apoptose estimert ved hjelp av Annexin V farging. Hver søyle representerer middelverdi ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. * P 0,05, sammenlignet med kontrollceller
A549 (A) og H460 (B) celler ble behandlet med CCL21 (100 ng /ml) i 24 timer etter eksponering for PD98059, en selektiv inhibitor. av MEK som forstyrrer aktivering av ERK nedstrøms, i 1 time. Etter behandling ble uttrykket nivåer av disse komponentene beregnes ved hjelp av western blot. Hver søyle representerer middelverdi ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. * P 0,05 eller ** p. 0,01, sammenlignet med kontrollceller
A549 (A) og H460 (B) celler i fravær eller nærvær av CCL21 (100 ng /ml) for 24 h ble underkastet immunoutfelling med antistoffer mot bcl-2 eller IgG, etterfulgt av western-blotting for bax og caspase-3 (a). Gjensidig immunoutfelling med antistoffer mot bax eller IgG ble analysert ved western blotting for bcl-2 og caspase-3 (b). Gjensidig immunoutfelling med antistoffer mot caspase-3 eller IgG ble analysert ved western blotting for bcl-2 og bax (c).
Inhibering av apoptose er involvert i reguleringen av anti-apoptotiske bcl-2 og av pro-apoptotiske Bax og caspase-3, men ikke p53 i A549 og H460 celler. Det har blitt fastslått at apoptose i celler er hovedsakelig involvert i ekspresjon av bcl-2, Bax, caspase-3, eller p53 [4], [18] – [20]. For å bestemme mulig mekanisme som aktivering av CCR7 hemmet apoptose av A549 og H460 celler, ble western blot og real-time PCR-analyser utført. Som vist i figur 2, ble uttrykket på begge protein- og mRNA-nivåer av anti-apoptotiske bcl-2 og pro-apoptotiske bax og caspase-3 henholdsvis oppregulert og nedregulert i CCL21 gruppe, sammenlignet med de andre (alle
P
0,01), mens det var ingen signifikante forskjeller mellom de andre (alle
P
0,05). Interessant, har uttrykket av pro-apoptotisk p53 ikke er endret (
P
0,05). Disse resultatene indikerer at funksjonen av CCR7 som en inhibitor på apoptose av NSCLC-celler som hovedsakelig er implementert muligens av banene til bcl-2, Bax, og caspase-3, men ikke p53.
CCL21 /CCR7 regulerer ekspresjon av bcl-2, Bax og caspase-3 via ERK-reaksjonsveien. Vår tidligere studie bekreftet at CCL21 /CCR7 interaksjon øker fosforylering av ERK (p-ERK) i A549 og H460 celler [13]. For å bestemme hvorvidt den ERK-reaksjonsveien er også involvert i den anti-apoptotiske virkning av CCL21 /CCR7, ble cellene behandlet med PD98059, en selektiv inhibitor av MEK som forstyrrer aktivering av ERK nedstrøms, i 1 time. Vi fant at PD98059 vesentlig avskaffet CCL21 /CCR7-mediert anti-apoptotiske virkninger (figur 3) og endringer i ekspresjon av bcl-2, Bax og caspase-3 (figur 4). Interessant, PD98059 alene (behandling i 1 time) hadde en betydelig effekt på ekspresjon av bcl-2, men ikke på ekspresjon av Bax og caspase-3 og apoptose. Som bax har vist seg å være en nedstrøms effektor av bcl-2-regulerte pathway av apoptose og aktivering av bcl-2 kan fremme frigivelse av Bax, som fører til aktivering av kaspaser [21], [22], søkte vi å undersøke om det er en interaksjon mellom bCL-2, Bax, og capspase-3. Deres interaksjoner ble bekreftet av coimmunoprecipitation resultater (figur 5).
Fosforylering av ERK, indusert av CCL21 /CCR7, samhandler med BCL-2, Bax, eller caspase-3. For ytterligere å identifisere om det er en interaksjon mellom p-ERK og BCL-2, Bax, eller caspase-3, coimmunoprecipitation ble utført. A549 og H460-celler i fravær eller nærvær av CCL21 i 24 timer ble underkastet immunoutfelling med antistoffer mot p-ERK eller IgG, etterfulgt av western-blotting for bcl-2, Bax og caspase-3. Det ble observert en markert, spesifikk interaksjon mellom p-ERK og bcl-2, Bax, eller caspase-3, særlig når cellene ble behandlet med CCL21 i 24 timer (figur 6A). Gjensidig immunoutfelling med antistoffer mot bcl-2, Bax, caspase-3 eller IgG ble bestemt ved western blotting for p-ERK, og igjen, interaksjonen mellom p-ERK og bcl-2, Bax, eller caspase-3 var fremtredende, spesielt i nærvær av CCL21 (figur 6b).
A549 (A) og H460 (B) celler i fravær eller nærvær av CCL21 (100 ng /ml) i 24 timer ble underkastet immunoutfelling med antistoffer mot p-ERK eller IgG, etterfulgt av western-blotting for bcl-2, Bax og caspase-3 (a). Gjensidig immunoprecipitation med antistoffer mot BCL-2, Bax, caspase-3 eller IgG ble analysert ved western blotting for p-ERK (b).
Diskusjoner
Vår forrige studier har dokumentert at aktivering av CCR7, indusert av sin ligand CCL21, kan fremme celleproliferasjon og formidle sin lymfeknutemetastase i NSCLC celler [12], [13]. Men rollen som CCL21 /CCR7 i apoptose av NSCLC forblir vage. I denne studien, viste vi at CCL21 /CCR7 hindrer apoptose i A549 og H460 celler av NSCLC, som er potensielt formidles via ERK veien.
BCL-2 og Bax er regulatorer av celle iboende apoptose vei, som regulerer integriteten til den ytre mitokondriemembranen [21], [23], [24]. Det har vist seg at enkelte bcl-2 familiemedlemmer ligger på mitokondriemembranen (slik som Bax, bcl-XL, Mcl-1, bcl-2, og By) kan forandre permeabiliteten av mitokondriemembranen og utløse aktivering av kaspasene , som fører til apoptotisk celledød [25] – [27]. I overensstemmelse med resultater fra forskjellige cellemodeller [4], [18], [20], [28] – [30], våre resultater viser at aktivering av CCR7 hindres apoptose, hvilket resulterer i en økning i ekspresjon av anti-apoptotiske bcl -2 og en nedgang i ekspresjon av pro-apoptotiske bax og caspase-3. Interessant, denne inhiberende effekt var ikke åpenbart forbundet med sti av p53. Dessuten har p53 ingen signifikant innvirkning på uttrykk for CCR7 [31].
Vår tidligere studie har vist at aktivering av CCR7 kan forbedre fosforylering av ERK i A549 og H460 celler [13], som er konsistent med flere studier med andre celletyper [20], [28], [32] – [43]. I denne studien undersøkte vi rollen til fosforylering av ERK i CCL21 /CCR7-mediert anti-apoptose av A549 og H460-celler. Vi fant ut at CCL21 /CCR7-mediert anti-apoptose handling relatert til uttrykk av BCL-2, Bax og caspase-3 kan bli avskaffet ved behandling med PD98059. PD98059 alene (behandling i 1 time) hadde en betydelig effekt på ekspresjon av bcl-2, men ikke på ekspresjon av Bax og caspase-3 og apoptose. Dessuten coimmunoprecipitation Resultatene bekreftet at det var en interaksjon mellom BCL-2, Bax, og caspase-3. Grunnen for fraværet av forandring i ekspresjon av Bax og caspase-3 er muligens på grunn av den begrensning av observerte tids fordi bax og caspase-3 har blitt vist å være nedstrøms effektorer av bcl-2-regulerte pathway av apoptose [21] [22].
Som CCL21 /CCR7 var i stand til å regulere uttrykket av bCL-2, Bax, og caspase-3, søkte vi å finne ut om det er en interaksjon mellom p-ERK og bCL-2 , Bax, eller caspase-3. Coimmunoprecipitation og gjensidig immunoutfellingsstudier resultater sterkt at det er en interaksjon mellom p-ERK og bcl-2, Bax, eller caspase-3, særlig i nærvær av CCL21. Disse resultater viser at virkningen av CCL21 /CCR7 på celle apoptose involvert i ekspresjon av bcl-2, kan Bax og caspase-3 forekommer via ERK-reaksjonsveien i humane NSCLC-celler.
Denne studien indikerer at aktivering av CCR7, indusert av CCL21, i betydelig grad kan forhindre apoptose av NSCLC-celler, som er potensielt medieres via ERK-reaksjonsveien. Denne informasjonen kan bidra til å avklare hvilke mekanismer for kreft celle overlevelse og identifisere potensielle mål for behandling av NSCLC.
Materialer og metoder
Cell kultur og reagenser
A549 og H460 cellelinjer fra vår tidligere publiserte papir [12], [13] ble dyrket i RPMI-1640 eller DMEM-F12 supplert med 10% HyClone føtalt bovint serum (FBS) (ThermoFisher Scientific, Fremont, CA, USA) i en atmosfære av 5% CO
2 ved 37 ° C. Celler ble dyrket i 75 cm
2 kultur- kolber og høstet i en oppløsning av trypsin-EDTA ved den logaritmiske vekstfase.
Bcl-2, Bax, caspase-3, p-ERK, IgG, og β-aktin mus eller kanin monoklonale antistoffer ble innkjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, CA, USA). Rekombinant humant CCL21 var fra Pepro Tech (Rocky Hill, NJ, USA). Lipofectamine 2000 var fra Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Sekvensene til siCCR7 og kontroll siRNA og fremgangsmåten for transfeksjon er blitt rapportert i en annen papir [13]. PD98059 ble oppnådd fra Sigma (St. Louis, MO, USA) og ble brukt ved 50 uM (sluttkonsentrasjoner) i overensstemmelse med tidligere rapporter [13], [41], [44], [45]. Protein A /G-perler var fra Beyotime (Haimen, Kina).
Annexin V-farging
Etter behandling med CCL21 i 24 timer, ble cellene høstet og vasket to ganger med kald PBS ved forsiktig risting. Resuspender celler ble lagt til bindingsbuffer (1 x) og justert celletettheten til 2-5 × 10
5 /ml. I mørket, 5 ul Annexin V-FITC (50 mM TRIS, 100 mM NaCl, 1% BSA, 0,02% natriumazid, pH 7,4) ble tilsatt til cellesuspensjonen blanding av 195 ul og inkubert i 10 minutter ved romtemperatur før tilsetning 190 mL bindingsbuffer (1 x) og 10 mL PI. Ti tusen hendelser per prøve ble ervervet ved hjelp av en FACS-scan flowcytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) og andelen av celle apoptose ble analysert ved hjelp av Cellquest analyse programvare (Becton Dickinson).
Western blot-analyse
etter behandling med CCL21 i 24 timer, ble cellene ekstrahert med lyseringsbuffer (150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS, 2 ug /ml aprotinin og 1 mM PMSF) i 30 min ved 4 ° C. Ekstrakter ble sentrifugert ved 12000 x
g
i 15 minutter ved 4 ° C. Supernatanter som inneholder totalt protein deretter ble høstet. Alikvoter, hver inneholdende 50 ug proteiner, ble separert ved 12% SDS-PAGE og overført til PVDF-membraner ved 40 V i 2 timer ved lav temperatur. Membranene ble blokkert i 5% skummet melk i 2 timer, og proteiner ble påvist ved anvendelse av monoklonale antistoffer ved 1:200 fortynning over natten ved 4 ° C. Proteiner ble gjort synlige ved hjelp av anti-mus eller anti-kanin-IgG konjugert med pepperrotperoksidase (HRP) ved 1:6000 (caspase-3, p53, bax) eller 1:8000 (de andre) fortynning i 2 timer ved romtemperatur, henholdsvis . Bånd ble fotografert med en EC3 Imaging System (UVP LLC, Upland, CA, USA), og den optiske densitet (OD) ble målt ved anvendelse ImageJ (NIH, Bethesda, MD, USA). OD forskjellen mellom testet proteiner og β-aktin av den samme prøven ble beregnet som relativ innhold og uttrykk grafisk.
Real-time PCR
Total RNA ble isolert fra celler ved hjelp TRIzol (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. Real-time PCR ble utført på en ABI Prism 7900HT Fast System (Applied Biosystems, Foster, CA, USA) ved hjelp av SYBR Premiks Ex Taq II (Takara, Dalian, Kina). Amplifikasjoner ble utført i et totalvolum på 20 ul og syklet 40 ganger etter initiell denaturering (95 ° C i 30 s) med følgende parametere: 95 ° C i 5 s og 60 ° C i 30 sek. Primere sekvenser var oppført i tabell 1 og β-aktin ble benyttet som en intern kontroll [13], [46]. Påliteligheten av PCR-resultater ble støttet ved å analysere den dissosiasjon kurve. Real-time PCR data ble beregnet ved hjelp av to
-ΔΔCT metoden på SDS 2,4 programvarepakke (Applied Biosystems) [47].
Coimmunoprecipitation
Etter behandling med CCL21 i 24 timer ble cellene ekstrahert med lyseringsbuffer (10 mM KCl, 1,5 mM MgCl
2, 10 mM HEPES [pH 7,9], 1 mM PMSF, 1 mM DTT) og homogenisert i 30 minutter ved 4 ° C. Ekstraktene ble sentrifugert ved 12.000 x
g
i 15 minutter ved 4 ° C, og supernatantene som inneholdt totalt protein ble høstet. Like mengder protein ble utsatt for antistoffer mot p-ERK, bcl-2, Bax og caspase-3, som ble immobilisert på protein A /G-perler. Etter 3-timers inkubasjon ved 4 ° C med forsiktig rotasjon, ble perlene grundig vasket fem ganger med lyseringsbuffer, kokt, og mikrosentrifugert. Proteiner ble påvist med antistoffer mot p-ERK, BCL-2, Bax og caspase-3 av western blot.
Statistisk analyse
Data ble analysert ved hjelp av SPSS 16.0 programvare (SPSS Inc., Chicago , IL, USA). En en-veis analyse av varians (ANOVA) ble anvendt for å evaluere forskjellene mellom grupper med ulike behandlinger, og den minst signifikante forskjell (LSD) test eller Dunnett T3 test ble anvendt for post hoc undergruppeanalyse. Alle data er presentert som gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. Resultatene ble ansett som statistisk signifikant for p 0,05. N-fold verdier for genuttrykk endre opp til 0,5 og under to ble tatt som betydnigsløst i samsvar med verdier hentet fra negative kontrollgener [47], [48].
