Abstract
isothiocyanate (ITC) Sulforafane (SFN) ble vist på lave nivåer (1-5 mm) for å fremme celleproliferasjon til 120-143% av kontrollene i en rekke humane cellelinjer, mens ved høye nivåer (10-40 um) inhiberes det slik celleproliferasjon. Lignende dose respons ble observert for cellemigrasjon, dvs. SFN på 2,5 mikrometer økt celle migrasjon i blærekreft T24 celler til 128%, mens høye nivåer hemmet celle migrasjon. Denne hormetic handlingen ble også funnet i et assay hvor angiogenese SFN ved 2,5 uM fremmes endotelial rør dannelse (118% av kontroll), mens ved 10-20 pM forårsaket den signifikant inhibering. Den nøyaktige mekanismen ved hvilken SFN påvirker fremming av cellevekst og migrasjon er ikke kjent, men sannsynligvis innebærer aktivering av autophagy siden en autophagy inhibitor, 3-metyladenin, opphevet virkningen av SFN på cellemigrering. Videre lave doser av SFN tilbudt en beskyttende effekt mot fri-radikal-mediert celledød, en effekt som ble forsterket ved samtidig behandling med selen. Disse resultatene antyder at SFN kan enten hindre eller fremme tumorcellevekst, avhengig av dosen og arten av målcellene. I normale celler, kan fremme cellevekst være til nytte, men i transformerte eller kreftceller, kan det være en uønsket risikofaktor. Oppsummert ITCS har en bifasisk effekt på cellevekst og migrasjon. De fordeler og risiko ved ITCS er ikke bare bestemmes av dosene, men påvirkes av interaksjoner med Se og målte endepunkt
Citation. Bao Y, Wang W, Zhou Z, Sun C (2014) Fordeler og risiko for de Hormetic Effekter av Dietary Isothiocyanates på Cancer Prevention. PLoS ONE 9 (12): e114764. doi: 10,1371 /journal.pone.0114764
Redaktør: Daotai Nie, Southern Illinois University School of Medicine, USA
mottatt: 1 april 2014; Godkjent: 13 november 2014; Publisert: 22.12.2014
Copyright: © 2014 Bao et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er innenfor papir
Finansiering:. Denne studien ble støttet delvis av en bevilgning fra Natural Science Foundation National of China (NSFC nr 81128011) og en pris fra Cancer Prevention Research Trust, United Kongedømme. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
begrepet «hormesis» blir ofte brukt av toksikologer for å referere til en bifasisk dose respons på en miljømessig middel kjennetegnet ved en lav dose stimulering og ved høye doser hemmende eller toksisk virkning «[1], [2]. Den hormesis konseptet er den mest grunnleggende dose-responsforhold i biomedisinsk, ernæring og toksikologiske fag [1]. I en omfattende gjennomgang, Calabrese gitt bevis for at mer enn hundre antitumormidler forbedret spredning av humane tumorceller ved lave doser på en måte helt i tråd med den hormetic dose-respons-forhold [2]. En av de interessante egenskaper ved slike dose responser var at de forekom i de fleste typer kreftceller og var uavhengig av organ. Nyere funn tyder på at noen plantekjemikalier oppviser dose-reaksjoner bifasiske i celler med lave doser aktiverende signalveier som fører til øket ekspresjon av gener som koder for proteiner og cellebeskyttende antioksidant enzymer [3]. Kostholds hormetic forbindelser identifisert så langt inkluderer resveratrol, epigallocatechin gallate (EGCG), curcumin, quercetin, allicin, capsaicin, karnosinsyre og sulforaphane (SFN) [4] – [8]. Fra et evolusjonært perspektiv, skadelige egenskapene til fytokjemikalier har en viktig beskyttende rolle i å fraråde insekter og sopp fra skadelige planter. Men de relativt små doser av fytokjemikalier inntas av mennesker som bruker disse plantene er ikke giftige, og i stedet indusere milde cellulære stressresponser. Dette fenomenet har vært mye beskrevet som «hormesis» eller adaptiv dose respons innen biologi og medisin [4], [9], [10].
isothiocyanate (ITC), SFN (4-methylsulfinylbutylisothiocyanate ), ble først isolert fra vanlig-konsumert cruciferous vegetabilske, brokkoli og er en av de mest potente naturlig forekommende indusere av den Kelch lignende ECH-assosiert protein 1 (Keap1) kjernefysiske perler faktor erytroid 2 relatert faktor to (Nrf2) -antioxidant responselementer (ER) pathway [11]. Induksjonen av Nrf2 beskytter normale celler fra fri-radikal-formidlet oksidativt stress via oppregulering av chemoprotective gener, og virkningen av SFN er basert på dens evne til å indusere en Nrf2 drevet enzym quinon reduktase (NQO1) [12]. I de 20 årene etter oppdagelsen, har den beskyttende effekten av SFN er vist i forskjellige cellekultursystemer og dyremodeller, med det resultat at SFN er langt den mest omfattende studert ITC fra cruciferous grønnsaker. Den anti-kreftfremkallende mekanismer for ITCS har også blitt godt dokumentert, blant annet oppregulering av fase II avgiftning enzymer, anti-betennelse, fremming av cellesyklus og apoptose [13] – [17]. I løpet av det siste tiåret har Keap1-Nrf2-ARE vært ansett som en kritisk anti-kreft veien i chemoprevention [18] – [20]. Imidlertid, mer nylig, det har vært noen rapporter om skadelige Nrf2, herunder fremming av tumorcellevekst og chemoresistance [21] – [25]. For å overleve, kan kreftceller kapre Nrf2 sti som oppregulerer et batteri av antioksidant enzymer, og dermed opprettholde en gunstig redoks balanse for å skaffe maligne egenskaper [26]. Overekspresjon av Nrf2 kunne forbedre celleproliferasjon og føre til motstand mot kjemoterapeutiske intervensjoner i enkelte typer kreft, inkludert human lunge og bukspyttkjertel kreft [27], [28]. Noen få tidligere undersøkelser har vist at SFN utviser en doseavhengig virkning på celleformering i dyrkede tumorcellelinjer og normale celler, inkludert humane stamceller [29] – [31]. I denne studien, viste vi at SFN viste en hormetic respons dose på cellevekst, migrasjon og angiogenese. Hvorvidt hormetic effekten er fordelaktig eller skadelig avhenger av det valgte endepunkt og /eller arten av cellene (normal eller tumor). Selv om begrepet hormesis anvendes ved toksikologer for å beskrive en klokkeformet doserespons, karakterisert ved en fordelaktig effekt ved lave doser og en toksisk (eller inhibitorisk) aktivitet ved høye doser, kan dette uttrykket for lav dose fordel ikke være sant for effekten av ITCS i kreft chemoprevention. Siden hormesis viser liten selektivitet, vil de biologiske effektene av ITCS på normale celler og kreftceller forskjellig. Fra dette perspektivet må en lav dose effekt av ITCS fremme tumor celleproliferasjon og migrasjon i dyremodeller vurderes forsvarlig. Derfor bør en presis strategi som tar sikte på å optimalisere de gunstige effektene og minimere risikoen for ITCS utvikles med forsiktighet i forhold til kreft forebygging og behandling.
Resultater
Effekter av ITCS på cellevekst
på grunn av beskaffenheten av den hormetic doserespons, er det ingen selektivitet ITCS på cellevekst, slik at det er sannsynlig at ITCS kan fremme tumorcellevekst ved lave doser. I flere
in vitro
cellekulturstudier, lave konsentrasjoner av SFN har vist seg å fremme tumorcellevekst, men ingen detaljert diskusjon eller forslag til oppfølgingsstudier for å undersøke mekanismene ble gitt [32] – [34 ]. Ved lave konsentrasjoner, har ITCS blitt vist å indusere proliferasjon og /eller beskytte cellene mot et toksisk middel, H
2o
2, i Caco-2-celler [30] og i hepatocytter [29]. Fig. 1A viser virkningene av SFN på cellevekst, med lavere doser (1-5 um) som fremmer cellevekst (20-43% større enn kontroll) og høye doser (10-40 um) som hemmer celleveksten i en rekke tumorcelle linjer, nemlig blærekreft T24, hepatom HepG2, og tykktarmskreft Caco-2. Lignende dose respons effekter ble funnet i normale cellelinjer inkludert udødelig hepatocytter HHL-5, tykktarm epitel CCD841 og hud fibroblast CCD-1092SK cellelinjer (Fig. 1B).
Når cellene vokste til 70-80% samløpet, et utvalg av doser av SFN (0-160 uM) ble tilsatt til cellekulturmediet for 24-48 timer. Kontrollcellene ble behandlet med DMSO (0,1%), og cellelevedyktigheten ble bestemt ved MTT-celleproliferasjonsanalyse (CCD-1092SK cellelevedyktigheten ble bestemt ved WST-1-analysen i henhold til produsentens instruksjoner [88]). Hvert datapunkt representerer gjennomsnitt ± SD av minst 5 replikater. Statistisk signifikans fra kontrollen, * p 0,05, eller ** p 0,01. A: resultater fra blærekreft T24, hepatom HepG2, og tykktarmskreft Caco-2 celler. B:. Resultater fra udødelig hepatocytter HHL-5, tykktarm epitel CCD841, og huden fibroblast CCD-1092SK cellelinjer
Effekter av SFN på cellemigrasjon
Fig. 2A viser en klokkeformet doseresponsen SFN på blærekreft T24 cellemigrering. SFN ved 2,5 og 3,75 uM øket tumorcellemigrering til 128 og 133% i forhold til tilsvarende kontroller. Slik SFN-indusert cellemigrering er forbundet med evnen til å aktivere SFN autophagy. Når en autophagy inhibitor, 3-metyladenin (3-MA), ble anvendt for det lindres SFN (2,5 uM) -indusert cellevandring 128-26%, selv om den har mindre hemmende effekt på SFN behandlinger ved 5 eller 10 mM (Fig. 2B ). Dessuten, 3-MA også redusert migrering av ikke-SFN behandlede celler til 12% av kontrollen
A.: Etter over natten sult, blærekreft T24-celler ble behandlet med SFN ved konsentrasjonene som er angitt i 24 timer, cellemigrering ble målt ved hjelp av en cellemigrering analyse ved bruk av de ThinCert celledyrkningsinnsatser (Greiner Bio-One Ltd.). Hver søyle representerer gjennomsnitt ± SD av 3 gjentak. B: Effekt av forbehandling av 3-MA på cellemigrering. DMSO (0,1% ble anvendt som en kontroll). Statistisk signifikans fra kontrollen, * p 0,05, eller ** p 0,01
ITCS og aktivering av Nrf2
SFN er en aktivator av Nrf2 via hvor det kan opp-. regulere mer enn hundre beskyttende gener, inkludert de fleste antioksidant og chemopreventive enzymer [11], [35]. Det er ingen tvil om at oppregulering av Nrf2-ARE veien er fordelaktig i normale celler, dvs. aktivering av Nrf2 og dens drevne cytoprotektive enzymer kan være beskyttende mot oksidativ skade, og det har blitt foreslått at aktiveringen av Nrf2 signalveien kan således være en lovende strategi i kreftforebygging [36]. Men, ITCS ikke har noen selektivitet mot enten normale eller tumorceller med hensyn til Nrf2 aktivering. Nrf2 kan kapret av kreftceller [26], og en fersk rapport antyder at Nrf2 er en protoonkogenet som modulerer tumor cellevekst [37]. I transformerte celler, kan Nrf2 fremme cellevekst eller forårsake chemoresistance [38]. I denne studien, SFN (2,5-10 pM) indusert tilsvarende nivåer av translokasjon av Nrf2 inn i kjernen av de normale humane hepatocytter HHL-5 (4.1 til 7.1 ganger), og hepatoma HepG2 (4.1 til 5.9 ganger) celler (Fig. 3) .
Nrf2 ble påvist i nukleære ekstrakter fra celler eksponert for SFN (0, 2,5, 5 og 10 uM) i 24 timer, ved anvendelse av en Western blot-analyse. Kontrollceller ble behandlet med DMSO (0,1%). A: udødeliggjort human hepatocytter HHL-5; B:. Menneskelige heptoma HepG2 celler
Verne rollen lav dose ITC behandling mot oksidativ skade
I innen biologi og medisin, hormesis er definert som en adaptiv respons av celler og organismer til en moderat spenning. En mild belastning induserer aktivering av signalveier som Nrf2, NF-kB, Sirtuin, FOXO, hypoksi-induserbar faktor (HIF) og dermed fører til indre endringer (f.eks induksjon av antioksidant enzymer) som kan gi resistens mot mer alvorlig stress [4 ], [6]. Fig. 4A og 4B viser at forbehandling av HHL-5 og MCF-7-celler med 5 uM SFN ga beskyttelse mot H
2o
2-indusert celledød, dvs. øket celle-levedyktighet 36,6 til 63,9%; og 50,3 til 83,7% med 400 mikrometer H
2o
2 behandlinger, henholdsvis. Videre er den beskyttende effekten av forbehandling med SFN (2 uM) i H
2o
2-indusert celledød kan bli styrket ved cotreatment med selen (Se) i HHL-5-celler (fig. 4C), det vil si H
2o
2 redusert cellelevedyktighet til 34,8% i HHL-5-celler, men når cellene ble forbehandlet med SFN (2 uM), eller Se (0,1 pM) i 24 timer, økte cellelevedyktigheten til 41,7 og 51%, henholdsvis og co-behandling SFN og Se økt celleviabilitet til 65,5%. Denne beskyttende effekt kan være involvert i enten chemoprotection eller chemoresistance, avhengig av naturen av cellene.
Cellene ble dyrket i 96-brønners plater. Da de nådde 70-80% konfluens ble cellene forbehandlet med SFN (5 uM) i 24 timer (HHL-5, A) eller 48 h (MCF-7, B). Cellekulturmediet ble erstattet med H
2o
2 ved de konsentrasjoner som er angitt i ytterligere 24 timer. C: HHL-5 celle ble forbehandlet med SFN (2 uM) og Se (0,1 pM) i 24 timer før eksponering til H
2o
2 (400 uM) i ytterligere 24 timer. Cellelevedyktigheten ble målt ved anvendelse av MTT-analysen. Statistisk signifikans fra tilsvarende kontroller: * p 0,05; ** P. 0,01
Bifasisk effekter av SFN på angiogenese
Angiogenese (ny vekst av blodkar) er sentral i utvikling og spredning av en rekke humane kreftformer. Det er derfor viktig å undersøke de anti-angiogene effekter av potensielle anti-kreft midler. I motsetning til dette, utilstrekkelig blodtilførsel til hjertet og andre vev, som følge av utilstrekkelig ny vekst av blodkar, er et trekk ved mange kardiovaskulære sykdommer. SFN har vist seg å hemme angiogenese ved høye konsentrasjoner [39]. I denne studien, SFN ved 2,5 uM fremmes rør formasjon til 118% av kontrollen, dvs. total slangelengden var 4,78 mm /mm
2 i kontroll og 5,65 mm /mm
2 i SFN (2,5 uM) behandlede celler (fig. 5). SFN ved 5 uM viste en mindre signifikant kampanje (111% i forhold til kontrollgruppen), mens 10 og 20 uM inhiberte SFN rør formasjon signifikant (redusert til 61 og 20% av kontrollen, henholdsvis). SFN ved lav dose fremmet dannelsen av en sammenhengende basalmembran rundt endotel-rør; mens ved høye doser av SFN, ble fragmentert basalmembranene funnet (Fig. 5A). Disse data tyder på at for anti-angiogenese skal brukes en relativt høy dose av SFN siden en lavere dose kan fremme angiogenese. Imidlertid kan den stimulerende virkningen av lave doser for dannelse av nye blodkar være fordelaktig for pasienter med kardiovaskulære sykdommer.
Kultur-medium supplert med SFN (0-40 uM) ble tilsatt til toppen av 3-D kollagen geler og deretter skiftet hver 24 timer med frisk SFN lagt til. 3-D geler ble fiksert på dag 5, immunfarget med CD31 (rød) og kollagen type IV (grønn), og motfarget med DAPI (blå). (A): lav forstørrelse Bildene ble tatt fra fem tilfeldige felt av hver prøve og beregnet for gjennomsnittlig rørlengde. (B) Representative Bildene vises i trippel farging med høyere forstørrelse. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD (n = 5) (C). * P 0,05; ** P 0,01 sammenlignet med ubehandlet kontroll
Diskusjoner
Hormetic effekten av ITCS på cellevekst, migrasjon og angiogenese
hormetic sone konsentrasjoner (ca. 1. -5 uM) av ITCS som er lagt i cellekultur kan lett oppnås i humant plasma etter inntak av et måltid rikt på cruciferous grønnsaker, eller fra ekstrakter eller kosttilskudd [40] – [44]. Tabell 1 viser plasmanivået av ITCS målt i flere studier på mennesker (se også referanse [45]). SFN er avledet fra handlingen av den endogene enzymet, myrosinase på glucosinolate, glucoraphanin som er funnet i cruciferous grønnsaker. Glucosinolate Innholdet i felles Brassica er tilgjengelige fra en database som er utviklet av McNaughton og Marks [46]. Den høyeste glucosinolate verdien var fra karse (389 mg /100 g fersk vekt), mens den laveste verdien var fra kinesisk kål (20 mg /100 g fersk vekt), selv om sorten type og vekstforhold begge påvirker disse figurer. Brokkoli inneholder 61,7 mg /100 g (19,3 til 127,5 mg glucoraphinin /100 g) [46], som er ekvivalent med 141,3 umol SFN /100 g (44,2 til 292,1 umol /100 g fersk vekt) hvis omdannelsen er 100% effektiv. Matvareindustrien og matlaging forholdene er avgjørende faktorer i å påvirke aktiviteten til myrosinase og påfølgende dannelse av ITCS [47]. Hoved innflytelse på den påfølgende produksjon av ITCS
in vivo
er hvordan Brassica grønnsaker har blitt kokt [48]. Omfattende studier av SFN har gitt overbevisende bevis for at SFN er en chemopreventive middel [49], [50]; og mekanismene for sin handling involverer induksjon av fase II enzymer, cellesyklus og apoptose [16], [51].
Generelt funn fra epidemiologiske studier på sammenhengen mellom grønnsaksinntak og kreftrisiko er inkonsekvent. Et høyt inntak av cruciferous grønnsaker har imidlertid vist seg å redusere risikoen for flere typer kreft, inkludert de fra tykktarm og lunge [52], [53]. Dersom hormetic virkningene av ITCS er involvert i kreftutvikling, blir den samlede biologiske virkningen av korsblomst vegetabilske på kreftrisikoen mye mer komplisert. Men hvis en lav dose av ITCS fremmer kreft celle vekst det kan bidra til å forklare hvorfor epidemiologiske studier ikke viser en konsekvent sammenheng mellom cruciferous grønnsak inntak og risiko for kreft. Derfor er det avgjørende å forstå virkningsmekanismer av hormetic effektene av ITCS. I
in vitro
cellekulturer, kan de mekanismer som lave doser av SFN fremmer cellevekst relateres til effekten SFN har på aktivering av vekstfremmende molekyler (for eksempel HER2, RAS, RAF, MEK, ERK , PI3K, AKT og mTOR), signaltransduksjonsveiene som NF-kB, FOXO, HIF, Nrf2, autofagi og reseptorer [54] -. [56]
autophagy innebærer dannelsen av dobbelt membraned vesikler ( autophagosomes), som innkapsle cytoplasma og organeller og sikring med lysosomer, som fører til nedbrytning av innholdet i vesikkelen [57]. SFN er kjent for å være en induktor av autofagi [58], men det er uklart hvordan induksjon av autofagi er forbundet med undertrykkelse av celle migrasjon. Andre potensielle mål for SFN kan inkludere matriksmetalloproteinaser (MMP), microtubules, kollagen og inte survivin og sink finger E-box binding homeobox 1 (ZEB1) [59]. En veldig fersk studie antyder at aktivering av autofagi er assosiert med chemoresistance, og at histondeacetylase (HDAC) 10 beskytter neuroblastom celler fra cytostatika ved å formidle autofagi [55]. Dette arbeidet viser at samtidig behandling med HDAC10 inhibitor og en kjemoterapeutisk stoff (doxorubicin) er en lovende måte å forbedre behandlingsrespons. En annen studie antyder at Notch aktivering er i stor grad unnværlig for SFN-mediert hemming av cellemigrasjon i menneskelige prostata kreft [60], og dette kan være et terapeutisk fordel som Notch aktivering er vanlig i menneske prostatakreft. Høye konstitutive nivåer av Nrf2 forekommer i mange svulster, mens overekspresjon av Nrf2 i kreftceller beskytter dem fra de cytotoksiske effektene av kreft behandlinger, noe som resulterer i chemoresistance [22], [61]. Det er samspillet mellom ITCS og Se i oppregulering av tioredoksinreduktase (TR-1) og glutationperoksidase 2 (GPx2) [30], og det er klart at ITCS og Se utstillingen en mengde av multi-målrettet virkninger i kreft chemoprevention. Interessant, Se også fremmer migrasjon og invasjon av prostatakreft PC3 celler [62].
Vurdering av hormetic effekten av ITCS
Forbruket av cruciferous grønnsaker vil ikke bare gi ITCS men også bidra annen næringsstoffer og fytokjemikalier, inkludert tokoferoler, flavonoider, askorbat og SE. Disse komponentene kan motvirke /samhandle med pro-oksidant /antioksidant aktiviteter ITCS. Basert på hormetic natur ITCS, forbruk av en mengde cruciferous grønnsaker som gir en hormetic nivå ITCS i plasma kan være en risikofaktor for dem som har forvandlet celler i kroppen. En prinsippskisse for å analysere fordeler og risiko ved diett ITCS er foreslått i fig. 6. For alle kosttilskudd forbindelser og giftige stoffer, «dosen gjør giften» [ordlyden forenklet fra «alt er gift, og ingenting er uten gift; bare dosen tillater noe ikke å være giftig «(Paracelsus, 1493-1541)]. For diett ITCS, bør det være en «ingen effekt-nivå» forut for påvisning av eventuelle biologiske effekter. Faktisk, er nivået av ITCS i plasma hos et flertall av befolkningen sannsynligvis være mye lavere enn sub-mikrometer, og kan ikke utøve noen biologiske virkninger på celler. Men som følge av høyere inntak, slik som i forsøkene er oppført i tabell 1 eller for enkeltpersoner å ta kosttilskudd, plasma ITC nivåene kunne nå hormetic sone konsentrasjoner. Typiske karakteristika for hormetic sone (dose A-C) innbefatter lave konsentrasjoner, stimulerende og høye konsentrasjoner hemmende effekter. For SFN er hormetic sonen funnet å være 1-5 mikrometer i
in vitro
cellekulturforsøk, selv om dose-effekter funnet
in vitro
eksperimenter bør ikke være direkte ekstrapolert til mennesker . Det er mulig at hormetic sone og ingen skadelig effekt observeres nivå (NOAEL, dose C) hos mennesker er vesentlig forskjellig. For å maksimalisere den virkelige effekt og minimere risikoen bør både genetiske faktorer og interaksjoner mellom ernæringskomponenter bli vurdert. For eksempel, genetisk polymorfisme av glutation transferaser (GST) påvirker SFN metabolisme og risikoen for kreft [63]. På den annen side, kosttilskudd med cruciferous grønnsaker økt GSTA1 /2 aktivitet, effekten er mest markert i GSTM1-null /GSTT1-null menn [64]. Selv om det er i dag få epidemiologiske studier som benytter genotyping, vil forskning av denne art øke i fremtiden, og det er sannsynlig at nutrigenetics vil gi grunnlag for personlig medisin og ernæring. Interaksjoner mellom bioaktive fytokjemikalier og næringsstoffer kan bidra til den samlede fordelene og risikoen ved ITCS avhengig av helsetilstanden til enkeltpersoner. De induksjoner av Nrf2 og antioksidant enzymer som TR-1 kan også være av enten fordel eller risiko, avhengig av arten av målcellene (normal
vs
svulst).
For alle celletyper , er doseområde 0-A trygg. I de fleste dietter, de inntak av hormetic fytokjemikalier er sannsynlig å falle innenfor dette trygt område. For normale celler, kan dosen B brukes fremme dannelsen av nye blodkar eller fremme sårheling; doser C er giftige. For tumorceller, bør doser mellom A og C kan unngås; og doser C til D kan brukes til kjemoterapi
Hvor er vi nå.? Hvordan kan vi maksimere fordelene og minimere risikoen?
For tretti år siden, forskere fokusert på potensielle giftige (goitrogenic) egenskaper glucosinolate nedbrytingsprodukter [65]. I 1992 ble Sulforafane isolert fra brokkoli og anti-kreftfremkallende studier var basert på dens potente aktivitet ved induksjon av fase II-enzymer [12], [66]. I løpet av det siste tiåret, har mange Nrf2 indusere inkludert ITCS, resveratrol, Catechin, cucurmin og quercetin blitt rapportert [67], [68] med både chemopreventive og onkogene aktiviteter [69] – [71]. Nylig har to Nrf2 inhibitorer, brusatol (fra frøene av
Brucea sumatrana
) og trigonellin (fra kaffe) ble rapportert å forbedre effektiviteten av anticancerterapi [72], [73]. Videre har Nrf2 knockdown blitt vist å hemme tumorvekst, øke effektiviteten av kjemoterapi i livmorhalskreft [74], og inhibere angiogenese av rottehjerte mikro-vaskulære endotelceller i henhold hypoksiske betingelser [75]. Derfor er det klart at rollen Nrf2 i kreftutvikling er et tema for uenighet og Nrf2 aktivatorer som SFN og andre ITCS kan bidra både fordeler og risiko i kreftutvikling.
En forståelse av den komplekse mengde og avvikende natur av ITCS og andre kosttilskudd Nrf2 aktivatorer og deres hormetic dose respons, kombinert med en nøyaktig diagnose (stadium av kreft), og genetiske analyser kan, i ikke altfor fjern fremtid, initiere det betydelige potensialet som personlig medisin kan ha. Nye diagnostiske teknikker utnytte gull nanopartikler kan oppdage kreftlignende masser så små som 5 mm i leveren [76]. Gull nanopartikler med en polyelektrolytt belegg kan gjøre enda mindre svulster synlig gjennom røntgen scatter imaging, og dermed muliggjør tidligere diagnose. Når svulster kan diagnostiseres på et så tidlig stadium, kan en potensiell terapeutisk tilnærming være nanoencapsulation av kreftbekjempende fytokjemikalier eller narkotika gjennom overvåkes og målrettet levering [77]. Men, må man huske på at ITCS ved høye konsentrasjoner er også giftig mot normale celler. Bivirkninger er rapportert hos
in vitro
studier med 10-30 mikrometer SFN, inkludert induksjon av DNA, RNA og mitokondriell skade [78] – [80]. Dessuten var det også en kasuistikk av levertoksisitet i en person som forbrukes 800 ml brokkoli suppe en dag i 4 uker [81]. Lave nivåer av ITCS kan generere reaktive oksygenforbindelser (ROS), og aktivere Nrf2-ARE å slå på antioksidant enzymer. Selv om høye nivåer av ROS kan skade proteiner, lipider og DNA i celler, kan lave nivåer av ROS spiller en viktig rolle i immunforsvaret, antibakteriell virkning, vaskulær tone, og signaltransduksjon [82]. Nylig, James Watson hypotese som diabetes, demens, hjerte- og karsykdommer og enkelte kreftformer er alle knyttet til en manglende evne til å generere tilstrekkelig ROS [83]. Utfordringen er å definere balansen mellom generering av ROS og antioksidant kapasitet i hver type celler. For diett ITCS, er det viktig å definere det optimale området av inntakene for å fremme helse. Likevel er videre studier på mennesker som kreves for å etablere personlige optimale doser, sikkerhet og effekt ved bruk av mer sensitive biomarkører.
Materialer og metoder
Material
Sulforaphane ble kjøpt fra Enzo life Sciences (UK). Natriumselenitt, dimetylsulfoksyd (DMSO), hydrogenperoksyd, Bradford-reagens, methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium-bromid (MTT), fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF), og alle andre materialer og reagenser ble anskaffet fra Sigma-Aldrich (UK). Kanin polyklonale primære antistoffer mot Nrf2, Sam68 og pepperrot peroksidase (HRP) -konjugert geite-anti-kanin-IgG som sekundære antistoffer ble alle oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology Inc. (Heidelberg, Tyskland). Anti-kollagen IV og anti-human CD31 /PECAM-en ble kjøpt fra henholdsvis Millipore og BD Biosciences (UK),. Sekundære antistoffer konjugert med Cy2 og Cy3 ble kjøpt fra Jackson Immuno forskning (UK). Mini-komplett proteinase inhibitor og WST-1 reagens ble kjøpt fra Roche Applied Sciences (UK). Elektroforese og Western blotting forsyninger ble levert av Bio-Rad (UK). Den forbedrede chemiluminescence (ECL) kit ble kjøpt fra GE Healthcare (UK).
Cell kultur
udødeliggjort humane hepatocytter (definert som HHL-5) ble vennlig levert av Dr. Arvind Patel, Medical Research Council (MRC) Virology Unit (Glasgow, UK) [84]. Alle andre cellelinjer ble kjøpt fra ATCC. Celler ble rutinemessig dyrket i DMEM supplert med føtalt bovint serum (10%), 2 mM glutamin, penicillin (100 U /ml) og streptomycin (100 ug /ml) under 5% CO
2 i luft ved 37 ° C.
celleproliferering analysen
celleproliferasjon MTT analysen ble ansatt for å oppdage toksisitet av SFN (1-160 mm) på dyrkede celler. Når celler var på omtrent 70-80% konfluens, ble cellene eksponert for forskjellige konsentrasjoner av SFN til forskjellige tider ved bruk av DMSO (0,1%) som kontroll. Etter at alle behandlinger, ble mediet fjernet, 5 mg /ml MTT ble tilsatt, og inkubert ved 37 ° C i 1 time for å tillate at MTT å bli metabolisert. Deretter ble fremstilt formazan ble resuspendert i 100 ul DMSO per brønn. Den endelige absorbans i brønnene ble registrert ved anvendelse av en mikroplateleser (BMG Labtech Ltd, UK) ved en bølgelengde på 550 nm og en referansebølgelengde på 650 nm.
Cellemigrering assay
Cellemigrering ble kvantifisert ved hjelp av en ThinCert cellekultur setter celle migrasjon analysen (Greiner Bio-One Ltd.). Etter over natten sult i serumfritt medium, ble cellene behandlet med forskjellige konsentrasjoner av SFN for 24 timer, ble cellene migrerer gjennom en PET membran merket fluorescensmerket med Calcein-AM og kvantifisert ved mikroplateleser (BMG Labtech Ltd, UK) med en eksitasjonsbølgelengde på 485 nm og emisjonsbølgelengde på 525 nm.
protein ekstraksjon og Western blot-analyse
for total protein, HHL-5-celler ble vasket to ganger med iskald PBS, høstet ved skraping i 20 mM Tris-HCl (pH 8), 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 10% glycerol, 1% Nonidet P40 (NP-40) inneholdende mini fullstendig proteinase-inhibitor. Cellesuspensjonene ble plassert i et isbad i 20 min og deretter sentrifugert ved 12000 g i 15 min ved 4 ° C. Supernatanten ble oppsamlet, og proteinkonsentrasjonen bestemt ved Bradford Brilliant Blue G fargestoff-bindingsanalyse ved bruk av BSA som en standard. For atom protein, ble ekstraksjon utført ved hjelp av en Nuclear Extract Kit (Active Motif, UK), etter produsentens anvisninger.
Protein ekstrakter ble oppvarmet til 95 ° C i 5 min i lasting buffer og lastet inn 10% SDS-polyakrylamidgeler sammen med en molekylvekt markør. Etter rutinemessig elektroforese og overføring, ble polyvinylidendifluorid (PVDF) membran blokkert med 5% fettfri melk i PBST (0,05% Tween 20) i 1 time og inkubert med et spesifikt primært antistoff i 5% melk i PBST i 1 time. Membranen ble vasket tre ganger i 45 minutter med PBST og deretter inkubert med det sekundære antistoffet ble fortynnet med 5% melk i PBST i 1 time. Etter ytterligere tre vasker for 45 min med PBST, antistoff binding ble bestemt ved hjelp av en ECL kit (GE Healthcare, UK) og densitometry ble målt ved Fluor Chem Imager (Alpha Innotech, San Leandro, CA).
Angiogenese analyse – tube formasjon i en 3-D-modell
Menneskelige umbilikalvene endotelceller (HUVEC) og pericytes (PVC) ble ko-dyrket i kollagen type i gel som tidligere beskrevet [85]. SFN (0-40 uM) ble tilsatt til mediet (topp av 3-D-kollagen-gel), og mediet ble skiftet hver 24 timer med frisk SFN tilsatt. På dag 5, ble prøver fast, immunfarget med CD31 og kollagen type IV og motfarget med DAPI.
