Abstract
Kreft er fortsatt en av de viktigste årsakene til dødsfall på verdensbasis, og finne nye behandlinger er fortsatt en stor utfordring. Tidligere studier viste at modifiserte former av pektin, et komplekst polysakkarid er tilstede i den primære plantecelleveggen, har anticancer-egenskaper. Ikke desto mindre virkningsmekanismen av modifisert pektin og trasé som er involvert er uklare. Her viser vi at sitruspektin modifisert ved varmebehandling indusert celledød i HepG2 og A549-celler. Den induserte celledød adskiller seg fra klassiske apoptose fordi ingen DNA-spaltning ble observert. I tillegg Z-VAD-FMK, et pan-kaspaseinhibitor, påvirket ikke den observerte celledød i HepG2 celler, men syntes å være delvis beskyttende i A549-celler, noe som indikerer at varme-modifisert sitruspektin kan indusere caspase-uavhengig celledød. En økning i mengden av fosfatidyletanolamin-konjugert lett kjede 3 (LC3) protein og en reduksjon i p62-protein overflod ble observert i begge celletyper når inkubert i nærvær av varme-modifisert citrus pektin. Disse resultatene indikerer aktivering av autophagy. Så vidt vi vet er dette første gang at autofagi har blitt avslørt i celler inkubert i nærvær av en modifisert form av pektin. Dette autofagi aktiveringen synes å være beskyttende, i det minste for A549-celler, fordi dens inhibering med 3-metyladenin økte den observerte modifiserte pektin-indusert cytotoksisitet. Denne studien bekrefter potensialet i modifisert pektin å forbedre kjemoterapeutiske kreftbehandling
Citation. LECLERE L, Fransolet M, Cote F, Cambier P, Arnould T, Van Cutsem P, et al. (2015) Heat-Modified Citrus Pektin induserer apoptose-lignende celledød og Autophagy i HepG2 og A549 kreftceller. PLoS ONE 10 (3): e0115831. doi: 10,1371 /journal.pone.0115831
Academic Redaktør: Daolin Tang, University of Pittsburgh, USA
mottatt: 11 august 2014; Godkjent: 02.12.2014; Publisert: 20 mars 2015
Copyright: © 2015 LECLERE et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. L. LECLERE var mottakeren av en FRIA fellesskap (Fonds pour la dannelse à la Recherche dans l’Industrie et dans l’Agriculture, Brussel, Belgia) . Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kreft er fortsatt en av de viktigste årsakene til dødsfall på verdensbasis. Til tross for en lang rekke terapeutiske tilnærminger, kreft kan ikke lett bli kurert, og mange krefttyper fortsatt ha en lav herdehastighet. Selv avgjørende for behandling, kjemoterapi og strålebehandling er også kilder til mange bivirkninger, og kirurgi kan noen ganger gå glipp av metastaser. Dette er årsakene til at utvikling av nye behandlinger for å forbedre eksisterende behandlinger er en stor utfordring. Naturlige forbindelser og fytokjemikalier har nylig oppnådd stor interesse for deres evne til å modulere signalveier involvert i kreft spredning og metastaser eller for deres beskyttende potensiale i strålebehandling, som vurderes av Hazra [1].
pektiner er mange og komplekse komponenter av det primære plantecelleveggen og er velkjent som kostfiber. Pektin polysakkarider inkluderer homogalacturonan (HG), substituerte galacturonans, rhamnogalakturonan-I (RG-I) og rhamnogalakturonan-II (RG-II). HG er en polymer av α-1,4-bundet-D-galakturonsyre, og HG rester kan være metyl-forestret ved C-6-karboksyl eller acetylert ved O-2-O-eller 3, avhengig av pektin kilden. Ryggraden i HG er kovalent kryssbundet til RG-I og RG-II. RG-I er en forgrenet polymer med en hovedkjede av disakkarid (α-1,4-D-GalA- α-1,2-LRha) gjentas hvori Rha rester kan være substituert med β-1,4-galaktan, forgrenet arabinan og /eller arabinogalaktan sidekjeder. Strukturen av RG-II er meget kompleks: sidekjedene er bundet til en ryggrad av HG, og disse komplekse sidekjeder som er sammensatt av 12 typer av glykosylrester knyttet sammen ved hjelp av minst 22 forskjellige glykosidbindinger [2,3]
Flere in vitro-studier har vist at ulike former for endret pektin har antitumor egenskaper (for en oversikt, se [4]). RG-I området av okra pektin reduserer proliferasjonen og induserer apoptose i melanomceller [5], og pektin oligosakkarider også indusere apoptose i myelomaceller [6]. Jackson
et al
viste at ulike fragmentering protokoller av pektin kan føre til forskjeller i pektin apoptose-induserende aktivitet, og at fragmentert pektin har en cytotoksisk effekt i androgen-avhengige og-Uavhengig prostata kreft celler. Videre disse forfatterne viste at pH-modifisert citrus pektin hadde liten eller ingen apoptotisk aktivitet [7].
In vivo
, har det vist seg at angelan, et pektin avledet polysakkarid, kan forhindre melanomcellevekst og metastase, og angelan ble også rapportert å være en immunomodulator som forbedrer immunfunksjon av B-celler, makrofager og naturlige dreperceller [8]. Oralt inntak av oppløselige pektin fragmenter hemmer veksten og metastasering av transplanterte tumorer i mus [9,10], og det har vist seg at modifisert sitruspektin hemmer veksten av tykktarmskreft og levermetastaser [11]. Men de mekanismer som endret pektin utøver disse effektene er ikke kjent
Formålet med denne studien er å karakterisere den cytotoksiske effekten av varme fragmentert sitrus pektin (HFCP) på to tumorcellelinjer:. HepG2 celler fra menneskelige hepatokarsinom og A549 celler fra menneskelige lungekreft. Vi rapporterer at varme fragmentert sitrus pektin induserer en apoptotisk lignende celledød som er delvis caspase-uavhengig og aktiverer autofagi i disse to cellelinjer.
Materialer og metoder
Fraksjonering av sitrus pektin etter varmebehandling
varme~~POS=TRUNC fragmentert sitruspektin (HFCP) ble oppnådd i henhold til fremgangsmåten beskrevet av Jackson
et al product: [7]. En oppløsning av 0,1% av sitruspektin (Sigma P9135, som hovedsakelig er sammensatt av homopolygalacturonic syre) i dobbelt destillert vann ble oppvarmet i 60 minutter ved 123 ° C og under et trykk på 17,2 til 21,7 kPa. Oppløsningen ble deretter frosset ved -80 ° C og frysetørket. Det tørre materialet ble lagret ved 4 ° C. Ferske løsninger i kulturmediet ble utarbeidet like før de blir lagt til cellene for inkubasjoner.
Cell kultur og pektin inkubasjon
HepG2, A549, MCF-7 og MCF10A celler ble hentet fra den amerikanske Type Culture Collection HepG2-celler og MCF-7 celler ble dyrket i DMEM-medium (Gibco 31825-023) og A549-celler i MEM-medium (Gibco 41090-028). For rutine kultur ble media supplert med 10% føtalt bovint serum (Gibco 10270), og cellene ble holdt ved 37 ° C i en atmosfære av 95% luft og 5% CO
2. MCF10A-celler ble dyrket i DMEM /F12-medium (Gibco 11320-074) inneholdende 5% hesteserum (Gibco 16050-122), 20 pg /ml EGF, 0,5 ug /ml hydrokortison, 10 ug /ml insulin og 100 ng /ml kolera toksin. For behandling ble cellene tillatt å følge i 24 timer etter utsåing. Mediet ble fjernet, og cellene ble vasket to ganger med PBS (Lonza BE17-516F) og plassert i et medium uten serum inneholdende det følgende: 3 mg /ml filtersterilisert HFCP, 3 mg /ml filtersterilisert sitruspektin 3 mg /ml eller 50 uM etoposid, anvendt som en positiv kontroll. Negative kontroller ble celler inkubert i medium alene. I noen eksperimenter, når indisert, staurosporin (Sigma S4400), pan-caspase inhibitor Z-VAD-FMK (BD Pharmingen 550 377), 3-metyladenin (Sigma M9281) eller bafilomycin (Sigma B1793) ble tilsatt samtidig som etoposid, HFCP eller pektin.
Celleviabilitet assay
HepG2-celler ble sådd på 50 000 celler /brønn og A549-celler ved 30 000 celler /brønn i 24-brønners plater før behandling for 6, 24 eller 48 timer. MTT (3- [4,5-dimetyltiazol-2-yl] -2,5- difenyltetrazoliumbromid, Sigma M2128) ble oppløsningen fremstilt ved en konsentrasjon på 2,5 mg /ml i fosfatbufret saltoppløsning, og 500 pl ble tilsatt per brønn . Etter 2 timer ved 37 ° C og 5% CO
2 atmosfære, medium og MTT-løsning ble fjernet før tilsetning av lyseringsbuffer. Den optiske tetthet ble målt 1 time senere ved 570 nm ved hjelp av en mikro spektrofotometer (Bio-Rad x Mark Micro spektrofotometer) og
Micro leder 6
programvare.
Cell Cvtotoksisitetsmålinq
HepG2-celler ble sådd på 50 000 celler /brønn og A549-celler ved 30 000 celler /brønn i 24-brønners plater før inkubering i 24 eller 48 timer. For hver brønn ble laktat dehydrogenase-aktivitet målt i supernatanten, i frittliggende celler og i adherente celler etter lysis i PBS inneholdende 10% Triton X-100 (Merck 9036-19-5). Den laktat dehydrogenase-aktivitet ble påvist ved en kolorimetrisk bestemmelse under anvendelse av et cytotoksisk sett (Roche 11644 793 001) og en mikroplate-spektrofotometer. Cytotoksiske prosenter ble beregnet ved hjelp av forholdet mellom mengden av LDH til stede i supernatanten og i de frittliggende celler av den totale mengde av LDH, som i den følgende formel: 100 * (a + b) /(a + b + c), hvor a = supernatant LDH; b = frittliggende celler LDH; c = adherente celler LDH.
DNA fragmenteringsanalyse
HepG2-celler ble sådd på 50 000 celler /brønn og A549-celler ved 30 000 celler /brønn i 24-brønners plater før inkubering i 6, 24 eller 48 timer. En celledød deteksjon ELISA (Roche 11 544 675 001) ble utført i henhold til produsentens anvisninger. Absorbansen ble målt ved anvendelse av et spektrofotometer ved 405 nm. Normalisering for proteininnholdet fra søsken plater bestemt ved anvendelse av Pierce-reagens ble utført.
Caspase-3 aktivitet
HepG2 og A549-celler ble sådd ut på 600 000 celler /brønn på 6-brønners plater før behandlinger for 24 eller 48 timer. Cellene ble høstet på is i PBS og sentrifugert ved 4 ° C ved 1000 x g i 5 min. Cellepelletene ble homogenisert i lyseringsbuffer i 15 minutter ved 4 ° C, og de oppløselige proteiner ble oppsamlet ved sentrifugering ved 4 ° C. Prøver ble fremstilt for å oppnå 20 mg av proteiner pr 100 ul destillert vann, til hvilken 50 ul reaksjonsbuffer og 1 ul av Ac-DEVD-AFC-substrat ble tilsatt. Prøvene ble inkubert ved 37 ° C i 60 minutter, og fluorescens ble påvist ved 505 nm etter eksitasjon ved 400 nm ved anvendelse av en Fluoroscan. Analysen for caspase-3 aktivitet ble utført i henhold til Cosse
et al product: [12].
Western blot-analyse
Cellelysater ble fremstilt i lyseringsbuffer (40 mM Tris , pH 7,5, 150 mM KCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100) inneholdende en protease inhibitor cocktail (Complete fra Roche Molecular Biochemicals, en tablett i 2 ml H
2o, tilsatt ved et 1: 25-fortynning ) og fosfatase-inhibitor-buffer (25 mM NAVO
3, 250 mM PNPP, 250 mM α-glycerofosfat og 125 mM NaF, ved en 1: 25-fortynning) i henhold til Cosse
et al product: [12]. Mediet ble sentrifugert, og pelleterte celler ble tilsatt til cellelysatene. Lysatene ble deretter sentrifugert ved 12 000 x g i 5 minutter, og supernatantene ble samlet. Proteiner (15 ug) ble denaturert ved tilsetning av LDS-prøvebuffer (Invitrogen NP0007) og oppvarmet til 70 ° C i 10 min. Proteinene ble gjenoppløst på en 4-12% NuPAGE (Invitrogen) gel og overført til en lav-fluorescens-membran (Millipore IPFL00010). Membranene ble holdt i 1 time i licor blokkeringsløsning og probet over natten med enten et anti-kaspase-3-kanin-antistoff (Cell Signaling # 9662S) som gjenkjenner den full-lengde og spaltede former av caspase-3 ved en fortynning på 1/500 , et anti-PARP-mus-antistoff (BD Biosciences # 551024) ved en fortynning på 1/1000, et anti-kaspase-8 mus-antistoff (Cell Signaling # 97465) ved en fortynning på 1/1000, et mus anti-ubiquitin-antistoff ( LifeSensor VU101) ved en fortynning på 1/1000, et anti-mus-antistoff LC3 (nanoverktøy 0260-100 /LC3-2G6) ved en fortynning på 1/600 eller et anti-p62 mus antistoff (AB Nova # H00008878-M03) ved en fortynning på 1/500. Et anti-ß-aktin mus-antistoff (Sigma T5168) ble anvendt ved en fortynning på 1/30 000 for ß-actin immundeteksjon som en lasting kontroll. Alle antistoffer ble fortynnet i licor oppløsning inneholdende 0,1% Tween 20 (Sigma P1379). Membranene ble renset med PBS + 0,1% Tween 20, og inkuberes med fluorokromkonjugerte-konjugert anti-mus eller anti-kanin-antistoffer (BD Bioscience # 926-32221) ved en fortynning på 1/10 000 i 1 time i mørke ved romtemperatur . For anti-ubiquitin merking, ble membranene vasket i PBS etter overføring, fiksert i PBS inneholdende 0,5% glutaraldehyd (pH 7) og skylt tre ganger i PBS før blokkering. Membranene ble skylt en gang til med PBS + 0,1% Tween 20, og tørket før den ble skannet og analysert ved hjelp av Odyssey programvare.
Immunofluorescence merking
HepG2-celler ble sådd på 50 000 celler /brønn og A549 cellene ved 30 000 celler /brønn i 24-brønners plater i 24 timer før inkubering med HFCP, pektin eller etoposid i 24 timer. Etter inkubering ble cellene fiksert og permeabilisert i 10 minutter med en kald oppløsning av 80% metanol og 20% aceton, skylles tre ganger med PBS-2% BSA og inkubert i 2 timer med primære antistoffer. Det primære antistoff for LC3 farging var kanin anti-LC3 (L7543 Sigma) (1/250 fortynning), og det primære antistoff for LAMP1 farging ble mus anti-LAMP1 (H4A3 mottas fra august Hildreth, Baltimore [13]). Cellene ble vasket tre ganger med PBS-2% BSA og deretter inkubert i 1 time med sekundære antistoffer. Alexa Fluor-488-konjugert anti-kanin-IgG-antistoff og Alexa Fluor-568-konjugert anti-muse-IgG-antistoff (Molecular Probes) ble anvendt ved 1/1000 fortynning. Etter 1 time inkubering ble cellene vasket tre ganger med PBS. For atom merking ble cellene inkubert i 30 minutter med TOPRO-3 (Molecular Probes, dil. 1/80) i nærvær av 2 mg /ml RNase og deretter skylt tre ganger med PBS. Til slutt, Dekk ble montert ved hjelp Mowiol (Sigma, St. Louis, USA), og cellene ble observert med et fluorescerende konfokal mikroskop (Leica SP5).
Resultater
Varme fragmentert sitrus pektin induserer HepG2 og A549 celledød
for å studere celledød-induserende effekter av HFCP, to kreftcellelinjer, HepG2 og A549 celler, ble utsatt for ulike tidsperioder til HFCP. Konsentrasjonen av 3 mg /ml ble valgt etter å ha testet flere konsentrasjoner av HFCP på begge celletyper i 24 timer (S1 fig.). Etoposid i en konsentrasjon på 50 uM ble anvendt som en positiv kontroll. Cellemorfologi analysert ved hjelp av fasekontrastmikroskopi viste at etoposid induserer en svak dødelighet i A549-celler, mens de HepG2 celler så ut til å være mer følsomme for dette stoffet. Videre økte celledød med inkubasjonstiden. HFCP ved en konsentrasjon på 3 mg /ml også indusert celledød i begge celletyper, men til en mye høyere grad enn etoposid i en konsentrasjon på 50 uM; dets virkning var også tidsavhengig. Omvendt, umodifisert pektin i en konsentrasjon på 3 mg /ml hadde ingen innvirkning på cellemorfologi (S2 fig.).
MTT-analyser ble utført etter 24 og 48 timer (1A Fig. 1B og). Resultatene viste at HFCP redusert levedyktighet av HepG2 og A549-celler på begge inkubasjonstider, mens ikke-modifisert sitruspektin ikke. HFCP toksisitet økte med inkubasjonstid og var mer alvorlig enn det indusert av etoposid, spesielt for HepG2 celler. For å bekrefte disse data ble LDH utgivelsen analysert etter 24 og 48 timer (Fig. 1C og 1D), og resultatene bekreftet den cytotoksiske effekten av HFCP på HepG2 og A549 celler, med en sterkere effekt på den tidligere.
HepG2-celler og A549 celler ble inkubert med medium alene (CtL-), 50 uM etoposid (Etop), 3 mg /ml varme-fragmentert sitruspektin (HFCP) eller 3 mg /ml sitruspektin (pectin). (A) og (B) Cellenes levedyktighet ble analysert ved MTT-analysen i HepG2-celler (A) og A549-celler (B) etter 24 og 48 timer. (C) og (D) Cytotoksisitet ble analysert i HepG2-celler (C) og A549-celler (D) ved hjelp av en LDH cytotoksisitet deteksjonssett etter 24 og 48 timers inkubering. Data er middel for minst 3 replikater fra uavhengige eksperimenter som hver ble utført i triplikat +/- SD (n = 3-8). De statistiske analyser utført var Hartley test og ANOVAII test. P-verdier i forhold til tilsvarende kontroll er *: P ≤ 0,05; **: P ≤ 0,01; ***: P ≤ 0.001
For å undersøke om serum kan være beskyttende mot denne HFCP-indusert cytotoksisitet, som observert for noen andre apoptose-indusere som etoposid, ble HepG2 cellene inkubert 24 timer i. tilstedeværelsen av HFCP i et medium supplert med 10% føtalt kalveserum Staurosporin ble anvendt som positiv kontroll, siden dens apoptotisk virkning ikke blir inhibert av serum. Men den cytotoksiske effekten av HFCP ble ikke inhibert i det hele tatt av serum under disse betingelser (S3 fig.). Forsøk har også blitt utført med lavere konsentrasjoner for en lengre inkubasjonstid (72 h) ved anvendelse av HepG2-celler. Dette ble utført med og uten serum. I forhold til 24 timers inkubering, 1 mg /ml HFCP induserte en viktig reduksjon i antall levedyktige celler etter 72 timers inkubering. Serum syntes å være noe beskyttende etter 72 timers inkubering, noe som ikke var tilfelle etter 24 timers inkubering (S4 fig.).
Effekten av HFCP er også blitt testet på normale celler. Dette ble utført ved høye konsentrasjoner av en kort inkubasjonstid (24 timer), så vel som med lave konsentrasjoner av en lang inkubasjonstid (72 timer), med og uten serum. MCF-10A-celler er blitt anvendt for disse forsøk. MCF10A celler er en immortalisert, ikke-transformerte epitel cellelinje avledet fra human fibrocystisk brystvev. De blir ofte betraktet som en normal kontroll for kreftceller. Resultatene viste at HFCP induserte også en sterk cytotoksisk effekt i disse cellene. Disse resultatene indikerer at HFCP er sannsynligvis ikke spesifikk for kreftceller (S5 fig.). Det må bemerkes at etoposid og staurosporin var også som giftig for MCF10A celler som for HepG2 celler mens etoposid er i dag brukt i klinikker for å behandle flere typer kreft.
Fragmentert sitrus pektin induserer ikke-kanoniske apoptose i HepG2 og A549
for å undersøke om pektin fragmenter indusere apoptose, analyserte vi aktivering av caspase-3 ved en western blot analyse. Aktiveringen av caspase-3 skjedd gjennom spalting, noe som resulterer i fragmenter av 14 kDa og 17 kDa, som observert når cellene ble inkubert med etoposid for (2A Fig.) 24 eller 48 timer. HepG2-celler inkubert i 24 eller 48 timer med HFCP vises forskjellige former for spaltet caspase-3 enn cellene inkubert med etoposid. Ved 24 timer, ytterligere bånd med høyere tilsynelatende molekylvekter på ca. 20 og 60 kDa, først; etter 48 timer, de spaltede fragmenter av caspase-3 var mindre rikelig i celler inkubert med HFCP, men det 60-kDa formen av caspase-3 var fortsatt til stede (fig. 2A). Etter 48 timers inkubasjon, et fragment på 20 kDa dukket opp i celler eksponert for medium alene, etoposid og ufragmentert pektin, mest sannsynlig fordi disse cellene ble inkubert uten serum. Uansett, den 60 kDa-båndet var spesifikke for HFCP-inkuberes cellene.
HepG2 og A549 celler ble inkubert med medium alene (CtL-), 50 uM etoposid (Etop), 3 mg /ml varme-fragmentert sitruspektin (HFCP) eller 3 mg /ml sitruspektin (pectin) i 24 og 48 timer. (A) og (B) Påvisning av aktivert kaspase-3 og spaltet PARP i HepG2 (A) og A549-celler (B) ved hjelp av Western blot-analyse. Immundeteksjon av α-tubulin ble benyttet som kontroll lasting. Resultatene er representative for tre uavhengige eksperimenter. (C) og (D) Caspase-3-aktivitet ble analysert ved anvendelse av en spesifikk fluorogent substrat etter 6, 24 og 48 timers inkubering i HepG2-celler (C) og A549-celler (D). (E) og (F) DNA-fragmentering ble analysert ved bruk av et ELISA-kit deteksjon etter 6, 24 og 48 timers inkubering i HepG2-celler (E) og i A549-celler (F). Dataene er midlene for triplikater +/- SD (n = 3). Dataene er midlene for triplikater +/- SD (n = 3). De statistiske analyser utført var Hartley test og ANOVAII test. P-verdier i forhold til tilsvarende kontroll er *: P ≤ 0,05; **: P ≤ 0,01; ***. P ≤ 0.001
Caspase spalting og ytterligere bandene var også merkbar i A549 celler etter 24 eller 48 timer med HFCP behandling (figur 2B.). Dessuten viste det caspase-3 spalting mønster i A549-celler inkubert med HFCP en spennende smøre 30-60 kDa (Fig. 2B). Et Western blot-analyse for PARP-proteinet (fig. 2A og 2B), et substrat av caspase-3, viser spaltingen av dette proteinet i begge celletyper inkubert med HFCP eller etoposid for begge tidsperioder. PARP-spaltning ble også påvist i HepG2-celler inkubert i 48 timer med medium alene eller umodifisert pektin, skjønt spaltet PARP var mindre tallrike i disse celler enn i de HFCP-inkubert celler. A549 celler inkubert i 24 eller 48 timer med umodifiserte pektin viste en knapt synlig mengde spaltet PARP, mest sannsynlig fordi inkubasjonstiden var i serumfritt medium.
For å finne ut om den ikke-konvensjonelle kløyving av caspase-3 førte til enzymaktivering, ble caspase-3 aktivitet analysert i HepG2 og A549 celler ble inkubert med 50 pM etoposid, 3 mg /ml HFCP eller 3 mg /ml pektin til 8, 24 og 48 timer (fig. 2C og 2D). Resultatene viste at etter 24 timer inkubering, etoposid sterk økning av caspase-3 aktivitet i HepG2 celler når sammenlignet med kontrollceller. De HepG2 celler behandlet med HFCP viste også en høyere caspase-3 aktivitet som økte med inkubasjonstid. De A549 celler behandlet med etoposid viste en liten økning av caspase-3 aktivitet i forhold til kontrollcellene, men denne økningen i kaspase-3 aktiviteten var mindre viktig enn den som ble observert i HepG2-celler, men var likevel statistisk signifikant. HFCP utsatte A549 celler vises også caspase-3-aktivering som økte over tid.
For å bekrefte at HFCP induserer apoptose, DNA fragmentering, en sen karakteristisk for apoptose, ble vurdert. En fri nucleosome ELISA-kit ble anvendt for å måle frigjøringen av frie nukleosomer fra DNA (fig. 2E og F), og resultatene viste at HepG2 og A549-celler behandlet med etoposid viste DNA-fragmentering som fører til nucleosome frigivelse. I motsetning til hva som ble observert for etoposid, ble DNA-fragmentering ikke observert i celler inkubert med HFCP, noe som indikerer at HepG2 og A549-celler behandlet med fragmentert pektin ikke viser klassiske apoptotiske egenskaper. Dette er konsistent med det nukleære morfologi observert etter DAPI-farging, som ikke viser typisk apoptotiske fragmenterte funksjoner, men syntes å være krympet.
A levedyktighet analyse ble også utført i kaspase-3-manglende MCF7 celler (S6 fig. ). Resultatene viste en reduksjon i levedyktigheten til disse cellene ved inkubasjon i nærvær av HFCP i 24 eller 48 timer, noe som tyder på at caspase-3 aktivering er ikke nødvendig for å indusere celledød i respons til HFCP eksponering.
rolle caspases i HFCP-indusert celledød
for å undersøke om caspases spille en viktig rolle i celledød indusert av HFCP ble cellene inkubert med HFCP i nærvær av en pan-caspase inhibitor (Z-VAD-FMK) , og levedyktigheten til og cytotoksisitet til HepG2 og A549-celler etter 24 timer ble analysert. Den kaspaseinhibitor førte til en liten økning i levedyktighet i begge celletyper inkubert med etoposid (Fig. 3A og 3B), en liten reduksjon i cytotoksisitet i HepG2 celler inkubert med etoposid og en markert reduksjon i cytotoksisitet i A549-celler inkubert med etoposid (Fig . 3C og 3D). Dette sett med data viser at Z-VAD-FMK var i stand til å forebygge, i det minste delvis, det celledød assosiert med kaspase-aktivitet. Imidlertid, HepG2-celler inkubert med HFCP i nærvær av Z-VAD-FMK ikke viser noen økning i levedyktighet når sammenlignet med celler inkubert med HFCP alene. En cytotoksisk analyse bekreftet disse observasjonene (Fig. 3A og 3C), hvilket således indikerer at caspaser ikke bidro til HepG2 celledød indusert av HFCP. Imidlertid A549 celler inkubert med HFCP og kaspaseinhibitor viste en høyere levedyktighet og mye mindre cytotoksisitet enn de A459 celler inkubert med HFCP alene, noe som antyder at caspaser kan være involvert i den død som induseres av HFCP i A549-celler (fig. 3B og 3D).
HepG2 og A549 celler ble inkubert med medium alene (CtL-), 50 uM etoposid (Etop), 3 mg /ml varme-fragmentert sitruspektin (HFCP) eller 3 mg /ml sitruspektin (pectin) i tilstedeværelse eller fravær av Z-VAD-FMK, en kaspaseinhibitor, ved 20 uM. (A) og (B) Cellenes levedyktighet av HepG2-celler (A) og A549-celler (B) ble målt med MTT-analyse etter 24 timers inkubering. (C) og (D) Cytotoksisitet ble analysert i HepG2 (C) og i A549 (D) etter 24 timers inkubering ved hjelp av en LDH cytotoksisitet deteksjon kit. Dataene er midlene for triplikater +/- SD (n = 3). De statistiske analyser utført var Hartley test og ANOVAII test. P-verdier i forhold til tilsvarende kontroll er *: P ≤ 0,05; **: P ≤ 0,01; ***: P ≤ 0.001. (E) og (F) en Western Blot analyse av aktivert kaspase-3 og spaltet PARP ble utført på 15 ug protein fra HepG2-celler (E) og A549-celler (F) etter 24 timers inkubering. Immundeteksjon av ß-aktin ble benyttet som kontroll lasting. Resultatene er representative for to uavhengige eksperimenter.
I et forsøk på å forstå den differensielle effekten av kaspaseinhibitor på disse to celletyper, bekreftet vi at Z-VAD-FMK gjorde inhiberer kaspase-aktivitet i konsentrasjon som brukes i dette arbeidet (S1 tabell). Faktisk viste resultatene at Z-VAD-FMK gjorde helt hemme etoposide- og HFCP-indusert caspaseaktivering. Vi analyserte neste caspase-3-spalting og PARP-spaltning i fravær av eller i nærvær av Z-VAD-FMK ved western blotting (fig. 3E og 3F). ble det ikke lenger observert fragmentering av caspase-3 som ble observert når cellene ble utsatt for etoposid når Z-VAD-FMK ble tilsatt, et resultat som er i overensstemmelse med litteraturen [14]. Den ikke-kanoniske fragmentering av caspase-3 som ble observert når HepG2 og A549-celler ble behandlet med HFCP ble også hemmet, og mønsteret av caspase-3-spalting ble sammenlignbar med det som observeres for celler eksponert for etoposid i nærvær av Z-VAD -fmk, med unntak av 60-kDa båndet som fortsatt ble påvist i begge celletyper inkubert med HFCP og Z-VAD-FMK.
Disse data øke muligheten for at de «ikke-konvensjonelle» caspase-3 cleavage vi har observert kan skyldes andre caspaser eller proteaser, og dermed kanskje ikke være relatert til klassisk apoptose. Faktisk HFCP-indusert PARP-protein spaltning ble bare delvis inhibert av Z-VAD-FMK, noe som indikerer at det kan være mekanisme annen enn kaspase-aktivering som kan være involvert. I tillegg ble den PARP-proteinet spalting indusert av etoposid ikke inhibert av Z-VAD-FMK på A549-celler, mens den PARP-proteinet spalting indusert av HFCP behandling var fullstendig hemmet.
Fordi effektor caspaser aktiveres av initiator caspaser , caspase-8-spaltningssetet ble analysert i HepG2 celler ved en western blot-analyse (fig. 4A). Resultatet viste at inkubasjon av HepG2-celler i nærvær av etoposid eller HFCP gjorde generere spaltede fragmenter av kaspase-8 med en molekylvekt på 43 og 41 kDa (Fig. 4A). Spalting av kaspase-8 i celler eksponert for etoposid er i overensstemmelse med litteraturen [15], og denne spaltning ble forhindret av nærværet av Z-VAD-FMK på begge etoposide- og HFCP-eksponerte celler (Fig. 4A). Videre er overflod av full-lengde procaspase redusert i HepG2 celler inkubert med HFCP og er ikke forhindres ved tilsetning av Z-VAD-FMK. Derfor er reduksjon i overflod av procaspase-8 var ikke på grunn av spaltingen er forårsaket av andre caspaser fordi Z-VAD-FMK ikke hindre det.
HepG2-celler ble inkubert med medium alene (CtL-), 50 pM etoposid (Etop), 3 mg /ml varme-fragmentert sitruspektin (HFCP) eller 3 mg /ml sitruspektin (pectin) (A) Z-VAD-FMK på 20 uM ble tilsatt eller ikke til cellene under inkubasjonen. Påvisningen av aktivert kaspase-8 i HepG2 celler ved hjelp av western blot-analyse ble utført på 15 ug protein etter 24 timers inkubering. Den immundeteksjon av ß-aktin ble benyttet som kontroll lasting. (B) Teoretisk illustrasjon av α-fodrin spalting som følge av aktiveringen av caspase (Casp), kalpain (calp) eller kombinasjonen av caspase og kalpain (Casp + calp). (C) og (D) HepG2 og A549 celler ble inkubert med medium alene (CtL-), 50 uM etoposid (Etop), 3 mg /ml varme-fragmentert sitruspektin (HFCP) eller 3 mg /ml sitruspektin (Pectin) og 20 pM Z-VAD-FMK ble tilsatt eller ikke til cellene i 6 eller 24 timer inkubering. Påvisningen av α-fodrin i HepG2 (C) og A549 (D) celler ved hjelp av western blot-analyse ble utført på 15 ug protein.
calpainer er proteaser som også aktiveres som reaksjon på stress og kan delta i celledød. Som studiet av den α-fodrin spaltning mønster kunne informere på caspase eller kalpain-aktivering [16,17], ble fragmentering av α-fodrin vurdert av et western blot-analyse i HepG2 og A549-celler etter 6 og 24 timers inkubering med eller med Z-VAD-FMK tillegg til å bestemme hvorvidt calpainer ble aktivert under HFCP-indusert celledød (fig. 4 C, D). Den teoretiske spaltning mønster av α-fodrin er vist i fig. 4B. Full-lengde α-fodrin har en molekylvekt på 280 kDa; a-fodrin spaltes av caspase viser bånd 150 og 120 kDa, og α-fodrin spaltet av kalpain viser bånd 150 og 145 kDa. I begge celletyper som er utsatt for etoposid eller HFCP (fig. 4C og D), full-lengde form av proteinet ble påvist, som var et fragment på 150 kDa. Dette fragmentet kan representere spalting av α-fodrin på en overfølsom nettsted ved lave nivåer av endogent aktive proteaser [18]. Etter 24 timers inkubering, den α-fodrin spalting mønster i HFCP-inkuberes cellene var lik den spalting mønster i etoposid-inkubert celler, og begge presenterte et fragment på 120 kDa. Som det 120-kDa α-fodrin produkt er assosiert med caspase-3-aktivering [19] og dannelsen av dette fragment ble inhibert når Z-VAD-FMK ble tilsatt i begge tilfeller, tyder resultatene på at HFCP induserte aktiveringen av noen kaspasene i begge celletyper.
caspase 8-aktivering er blitt vist å bli indusert i en reseptor-uavhengig måte, på grunn av proteasomhemmingen [20]. Fordi ingen reseptor har ennå ikke blitt rapportert for HFCP og å undersøke om HFCP kan aktivere en slik vei, ble protein ubiquitinering vurdert av en western blot analyse i HepG2 og i A549 celler. Det ble observert en tidlig økning i ubiquitinering når cellene ble inkubert i nærvær av HFCP i 6 timer, men ikke i nærvær av medium alene, etoposid eller umodifisert pektin som fortsatt var påvisbar etter 24 timers inkubasjon (fig. 5A og B).
