Abstract
mucin 2 (MUC2) er en mucin molekyl abnormt uttrykt av eggstokkreft celler. Forrige in vitro studier har indikert at MUC2 fremmer kreft vekst og metastasering gjennom en tumor-assosiert makrofag (TAM) -avhengig mekanisme. Imidlertid har denne mekanismen aldri vært knyttet til klinisk onkologi, og dens prognostisk betydning måtte avklares. Her samles vi 102 påfølgende eggstokkkreftprøvene og brukt multiple immuno-histo-kjemisk /-fluorescent teknikk for å bestemme korrelasjoner mellom de MUC2 ekspresjonsstatus, forholdet mellom M1 /M2 TAMs og tettheten av cyklooksygenase-2 (COX-2 )
+ TAM og COX-2
+ kreftceller. Kaplan-Meier overlevelsesanalyse og multivariat Cox regresjonsanalyse ble brukt for å vurdere prognostiske påvirkninger av disse parametrene. Som et resultat, har vi funnet at MUC2 overekspresjon (farging ++ /+++) var signifikant korrelert med en redusert brøk av M1 /M2 TAMs (p 0,001), en økt tetthet av COX-2
+ TAM ( p 0,001) og en øket tetthet av COX-2
+ kreftceller (p = 0,017). Videre har de fleste av M2 TAMs (93% -100%) og COX-2
+ TAMs (63% -89%) overlappes; og COX-2
+ kreftceller ble hyppig observert i nærheten av COX-2
+ TAM. I Cox regresjonsanalyse, ble MUC2 overekspresjon funnet å være en uavhengig prognostisk faktor for eggstokkreft pasienter, hvorav hazard ratio (HR) var 2,354 (95% konfidensintervall (CI): 1,031 til 10,707, p = 0,005). Også den reduserte forholdet mellom M1 /M2 TAMs og den økte tetthet av COX-2
+ TAMs og COX-2
+ kreftceller ble vist å være de prediktorene for dårlig prognose, hvorav de reduserte M1 /M2 forholdet hadde den høyeste HR (1,767, 95% KI: 1,061 til 6,957, p = 0,019). Alle disse funnene viste at MUC2 kan samtidig utøve M2-polariserende og COX-2-induserende effekt på TAM, der det forårsaker en ubalansert TAM M1 /M2-polarisering mønster og induserer lokal PGE
2 syntese (i begge TAM og kreftceller). De positive tilbakemeldingene mellom lokal PGE
2 syntese og TAM M2-polarisering akselererer eggstokkreft progresjon.
Citation: Han Y-f, Zhang M-y, Wu X, Sun X-j, Xu T, Han Q-z, et al. (2013) High MUC2 Expression i Eggstokkreft er omvendt Associated med M1 /M2 Ratio av Tumor-Associated Makrofager og pasient overlevelse. PLoS ONE 8 (12): e79769. doi: 10,1371 /journal.pone.0079769
Redaktør: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, USA
mottatt: 18 juli 2013; Godkjent: 26 september 2013; Publisert: 06.12.2013
Copyright: © 2013 Han et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Key Disciplines og Special Foundation i Shanghai Health Bureau, Stiftelsen den viktige disipliner i Shanghai Education Commission (tilskudd nummer 08YZ43), Science Research Foundation of Shanghai Science and Technology Commission (tilskudd nummer 12411950200), den Key Disiplin prosjekt Renji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University, Kina Post-doktor Science Foundation (tilskudd nummer 2011M500795), og Natural Science Foundation National of China (tilskuddsordninger tall 81272882 og 81072137). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ovarialcancer truer helsen til voksne kvinner, og er en ledende årsak til kreft-relaterte dødelighet hos postmenopausale kvinner [1]. Samspillet mellom eggstokkreft celler og vertens immunceller har blitt nøye studert av kliniske onkologer for å bestemme hvordan disse kreftcellene flykte eller selv gjøre bruk av vertens immunsystem for å overleve, formere og spre [2,3]. I tidligere undersøkelser, ble en serie av mucin molekyler (MUCs) abnormt utskilt av eggstokkreft celler identifisert, inkludert MUC1, MUC2 og MUC16 [4-6]. Disse slimstoffer omfatter et glykoprotein familie med et serin og treonin anriket repeterende polypeptid kjerne og et stort antall O-glykaner koplet til denne kjerne [4]. Under fysiologiske forhold, slimstoffer tjene som en beskyttende barriere og smøremiddelsjikt som opprettholder strukturen og funksjonen av fordøyelseskanalen, luftveier, reproduksjonskanal og urinveier, samt coeloms, så som bukhulen, pleuralt hulrom og leddhulrom [5]. Men når ondartet transformasjon skjer, nivåene av mucin sekresjon er dramatisk forbedret, og strukturene til glykaner i disse molekylene kan endres [7,8]. Når slippes ut i sirkulasjon, kan slimstoffer tjene som kreft biomarkører, som CA125 (kodet av MUC16) og CA153 (kodet av MUC1) [4-8]. Flere prekliniske studier har indikert at malignitet-avledet slimstoffer kan lette utviklingen av kreft gjennom deres interaksjon med immunceller [9-11]. For eksempel kan in vitro eksperimenter utført ved Inaba et al. viste at MUC2 induserte makrofager i kreftvev å uttrykke cyklooksygenase-2 (COX-2) og frigjøre prostaglandin E2 (PGE
2). Disse forfatterne foreslo også at den makrofag-utskilte PGE
2 kan i sin tur fremme tumorvekst og metastase [12]. Deres funn viste at MUC2 kan brukes som en immun Lyddemper av kreftceller.
Typer og antall makrofager som infiltrerer kreft vev (dvs. tumor-assosiert makrofager eller TAM), er nært knyttet til kreftpasient prognose [ ,,,0],13,14]. TAMs kan deles inn i to fenotyper, M1 og M2. M1-polariserte TAMs frigjøre reaktive oksygen- og nitrogen-mellomprodukter for å drepe kreftceller eller frigjøre immunmodulerende faktorer, slik som interleukin-1β (IL-1β) og IL-12, som fremkalle CD8
+ T-celler til å angripe kreftceller [13, 14]. M2-polariserte TAMs ha motsatt effekt. De slipper epidermal vekstfaktor (EGF), blodplateavledet vekstfaktor (PDGF), tumor-transformerende vekstfaktor (TGF) -β, vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) og andre trofiske faktorer som fremmer kreftcellevekst og kreft vaskularisering prosessen [ ,,,0],13,14]. Videre kan disse M2 TAMs produsere en rekke matriksmetalloproteinaser (MMP2, MMP7, MMP9 og MMP12) og chemokiner [CXC motiv ligand (CXCL) 8, CC motiv ligand (CCL) 13, CCL18 og CCL23] som letter kreft micrometastasis [13 , 14]. Tidligere studier har vist at en relativt høy tetthet av infiltrerende M1 TAMs og en høy M1 /M2-forholdet er positivt korrelert med fem-års overlevelse av kreftpasienter (som pasienter med ikke-småcellet lungekreft, prostatakreft og tykktarmskreft ) [15-17]. I tillegg, eliminerer M2-polarisert TAMs hjelp kjemoterapeutika kan hemme sykdomsutviklingen og forbedre pasientens utfall [18,19]. En rekke stoffer som frigjøres av kreftceller, slik som IL4, IL10 og kolonistimulerende faktor (CSF) -1, har blitt funnet å indusere monocytter /umodne makrofager (M0) til å differensiere til M2 TAMs [20,21]. Imidlertid er rollen til slimstoffer utskilt av cancerceller i TAM differensieringsprosessen er fortsatt uklar.
Fordi MUC2 er blitt funnet å samhandle med TAMs gjennom deres reseptorer (dvs. makrofagen scavenger reseptor) på celleoverflaten, vi var ganske interessert i om de kan også påvirke M1 /M2 differensiering av disse immunceller. Samtidig er det også nødvendig å tolke funnene i Inaba et al. i en klinisk relevant kontekst, som kan være til nytte for klinisk behandling og overvåking av ovarian kreftpasienter. For disse formål i denne studien, vi analysert kvantitativt antall, tetthet og molekylære karakteristika for makrofager innenfor eggstokkreft vev og evaluert forbindelsene til de oppnådde TAM parametrene med nivået av MUC2 ekspresjon i kreftvev. Vi fant ut at MUC2 spilte en betydelig rolle i intratumoral TAM differensiering prosess, favoriserer M2 fenotype. Videre basert på resultatene av Inaba et al. [12], vi utforsket og analysert mulig COX-2-induksjon mekanismen som MUC2 formidler M2 polarisering av TAMs og bestemt den kliniske betydningen av denne mekanismen for den langsiktige pasient overlevelse.
Resultater
forholdet mellom MUC2 uttrykk nivå og pasient demografiske, kliniske og patologiske egenskaper
i alt 102 saker ble undersøkt (tabell 1). Immunhistokjemi viste at prøvene av 47,1% (48 tilfeller) av de inkluderte pasientene viste ulike nivåer av MUC2 uttrykk (+, ++ eller +++). For å skille overekspresjon statusen MUC2 fra sin baseline uttrykk, utførte vi en parallell immunhistokjemiske eksperiment på 33 godartet eggstokkene vevsprøver (metoder for innsamling av disse prøvene ble gitt av materialer og metoder S1 i File S1, demografiske og patologiske egenskaper av 33 pasienter var levert av Tabell S1). Resultatene viste «+» MUC2-farging i 36,4% av godartede tilfeller, og ble oppdaget ingen godartet svulst tilfeller med høyere farging nivåer (se figur S1 i File S2). Disse resultatene tyder på at referanse MUC2 ekspresjon i benigne ovarietumorer tilsvarer MUC2 – /+ farging, mens MUC2 ++ /+++ immunofarging er mer spesifikt til ondartede svulster, og representerer en reell overekspresjon status [23-25]. Vi har derfor delt de tilsvarende pasienter i to grupper: en høy MUC2 uttrykk gruppe (++ og +++) og en lav MUC2 uttrykk gruppe (- og +), med 23 og 79 tilfeller, respektivt. Deretter sammenlignet vi de demografiske, kliniske og patologiske kjennetegn ved pasientene i de to gruppene. Vi fant en signifikant korrelasjon mellom MUC2 uttrykk nivå og kreft histotype. Satsen for MUC2 overekspresjon ble betydelig økt i mucinous eggstokkreft (p = 0,002, χ
2 test, tabell 1). Men observerte vi ingen signifikante sammenhenger mellom noen av de andre parametrene, inkludert pasientens alder, kroppsmasseindeks (BMI), graviditet, paritet, kreft metastasestatus, klinisk stadium og patologisk karakter, og MUC2 uttrykk nivå (tabell 1).
Kjennetegn
lav MUC2 uttrykk gruppe (n = 79)
Høy MUC2 uttrykk gruppe (n = 23)
p-verdi
†
Demografi :Alder (years)59.2±6.159.8±6.70.680Gravidity4.2±1.23.6±1.20.107Parity1.1±0.41.2±0.50.544BMI23.2±2.623.0±1.90.769Oral prevensjonsbruk 6 måneder 7 (8,9) 2 (8,7) 0.980Smoking 6 months12 (15,2) 5 (21,7) 0.458Alcohol misbruk 6 months1 (1,3) 1 (4,3) 0.348Clinical funksjoner: Ascites20 (25,3) 7 (30.4) 0.624Peritoneal metastase (inkludert intestinal, blære og levermetastaser og peritoneal lavage cytologisk prøve +) 62 (78,5) 16 (69,5) 0.375Lymph node metastasis30 (38,0) 8 (34,8) 0.781Drug motstand under de primære kjemoterapeutiske course2 (2,5 ) 1 (4,3) 0.650Pathology: Stage
**
0.383II23(29.1)4(17.4)III53(67.1)17(73.9)IV3(3.8)2(8.7)Histotype0.002
§
Serøs 57 (72,2) 10 (43,5) mucinous 7 (8,9) 10 (43,5) Endometrioid8 (10,1) 1 (4,3) Clear cell5 (6,3) 2 (8,7) Undifferentiated2 (2,5) 0 (0) Vurder
**
0,182 G140 (50,6) 8 (34,8) G219 (24,1) 10 (43,5) G320 (25,3) 5 (21,7) Tabell 1. Forholdet mellom pasientkarakteristikker og MUC2 uttrykket nivåer *. product: * data er presentert som middelverdier ± standardavvik eller som antall (prosent)
** se referanse 22
† En tosidig t-test eller χ
2 test ble brukt etter behov.
§ Statistisk signifikans. CSV Last ned CSV
Sammenheng mellom eggstokkreft vev MUC2 uttrykk status og TAM M1 /M2 forholdet
De TAMs i eggstokkreft prøvene ble analysert kvantitativt basert på CD68 enkel farging [17,26]. De tettheter av CD68
+ celler i kreftvevet fra den høye MUC2 uttrykk gruppe og den lave MUC2 uttrykk gruppen var tilsvarende (27,3 ± 13,6 mm
-2 vs 26,0 ± 11,9 mm
2); og ingen statistisk signifikans ble etablert (p = 0,654, Student t-test). Deretter kreftprøver ble dobbelt immunostained å utforske intratumoral differensiering status for TAM. Den anti-CD68 + anti-humant leukocyttantigen (HLA) dr og anti-CD68 + anti-induserbar nitrogenoksid syntase (iNOS) antistoff paneler ble anvendt for å identifisere M1-polarisert TAMs, og den anti-CD68 + anti-CD163 og anti-CD68 + anti-VEGF-antistoff paneler ble anvendt for å identifisere M2-polarisert TAMs (figur 1) [17,26]. Vår foreløpige test bekreftet at HLA-DR
+ CD163
+, HLA-DR
+ VEGF
+, iNOS
+ CD163
+ og iNOS
+ VEGF
+ TAMs utgjorde mindre enn 3% (1,2%, 1,7%, 2,1% og 2,6%, respektivt) av den totale TAMs, noe som indikerer at TAMs er knapt dobbeltmerket med både M1 og M2 signaturer. Ved å undersøke de kreft vev seksjoner, observerte vi at intra-holmen tetthet av M1-polarisert TAMs (CD68
+ HLA-DR
+ eller CD68
+ iNOS
+) var betydelig lavere i høy MUC2 uttrykk gruppen enn i lav MUC2 uttrykk (p 0,01, Student t test, tabell 2). I motsetning til den intra-islet tetthet av M2-polarisert TAMs (CD68
+ CD163
+ eller CD68
+ VEGF
+) i den høye MUC2 uttrykket gruppe var signifikant høyere enn for den lave MUC2 uttrykk (p 0,001, Student t test, tabell 2). Videre analyserte vi M1 /M2 forholdstall basert på TAMs flekker med CD68
+ HLA-DR
+ eller CD68
+ CD163
+ i to påfølgende kreft seksjoner fra hver pasient. Den resulterende midlere M1 /M2-forholdet var betydelig lavere i høy MUC2 uttrykk gruppen enn i lav MUC2 uttrykk (p 0,001, Student t test, tabell 2), noe som var i samsvar med de M1 /M2 distribusjon mønstre av TAMs av disse to gruppene (figur 1).
(A) Representant MUC2 og CD68 enkelt immunostained og CD68 /HLA-DR, CD68 /iNOS, CD68 /CD163, CD68 /VEGF dobbelt immunostained seksjoner fra den høye MUC2 uttrykk gruppe. (B) Representant MUC2 og CD68 enkelt immunostained og CD68 /HLA-DR, CD68 /iNOS, CD68 /CD163, CD68 /VEGF dobbelt immunostained seksjoner fra lav MUC2 uttrykk gruppe. For VEGF- og iNOS-farging, kan kreftceller (i rødt) som uavhengig uttrykte disse to proteiner som finnes i kreft vev seksjoner fra begge gruppene (pilspiss). Asterisk, TAMs (i brunt) som uttrykte CD68 protein. Arrow, CD68
+ TAMs (i lilla) som co-uttrykte de angitte proteiner (HLA-DR, iNOS, CD163 eller VEGF). Scale bar (svart), 100 mikrometer. Inset skala bar (hvit), 10 mikrometer. (C) Sammenligning av prosenter av ulike M1 og M2 celle undergrupper (dvs. M1 /M2 distribusjonsmønster) blant alle TAM. Det kan bemerkes at prosentandelene av M1 makrofager var betydelig høyere enn de som er av M2 makrofager i høy MUC2 uttrykket gruppe; men tvert imot, prosentandelene av M1 makrofager var signifikant lavere enn de av M2 makrofager i den lave MUC2 uttrykket gruppe. *, P 0,05, ANOVA.
Grupper
Total CD68
+ TAM tetthet
*
M1 tetthet
* (HLA-DR)
M1 tetthet
* (iNOS)
M2 tetthet
* (CD163)
M2 tetthet
* (VEGF)
M1 /M2 ratio (beregnet)
†
M1 /M2 ratio (faktisk)
†
Høy MUC2 uttrykk group17.4 ± 8.36.7 ± 5.86.6 ± 4.79.9 ± 7.211.5 ± 7.90.69 ± 0.280.58 ± 0.12Low MUC2 uttrykk group16.1 ± 8.211.0 ± 7.212.0 ± 7.34.6 ± 3.94.5 ± 3.82.75 ± 2.422.83 ± 2.16p value
**0.5230.008
§0.001
§ 0.001
§ 0.001
§ 0.001
§ 0.001
§Table 2. Tetthet og M1 /M2 forholdet mellom TAMs innenfor holmen regionen av eggstokkreft vev. Product: * Data er presentert som middelverdier ± SD per mm
2. Den totale TAM tetthet ble bestemt av CD68 enkel farging, og M1 og M2 TAM tettheter ble bestemt med CD68-baserte dobbel farging. Underskriftene som brukes til å identifisere M1 og M2 fenotyper av TAMs er angitt i parentes. ** To-tailed Student t-test.
† M1 /M2-forholdet ble beregnet ved å dividere M1 TAM tetthet (CD68 og HLA-DR-positive) ved M2 TAM tetthet (CD68 og CD163-positive) i to representative deler
.17,23 The selve M1 /M2-forholdet er definert som antall CD68
+ HLA-DR
+ celler dividert med antall CD68
+ CD163
+ celler i de samme områder av to etterfølgende seksjoner.
17,23
§ Statistisk signifikans. CSV Last ned CSV
Sammenheng mellom eggstokkreft vev MUC2 uttrykk status og TAM COX-2 uttrykk
For å etablere forholdet mellom uttrykk statusen MUC2 i kreftvev og COX-2 uttrykk nivå i TAMs vi sammen tettheten av COX-2
+ TAMs i cancerprøver mellom de høye og lave MUC2 uttrykk grupper. Som vist i figur 2, har vi funnet at, uavhengig av det totale MUC2 ekspresjonsnivået, tettheten av CD68
+ COX-2
+ TAMs var signifikant høyere i kreft holmer, hvori MUC2 molekyler ble kraftig utskilt, enn i de stromale regioner, hvori MUC2 molekyler ble neppe utskilt (p 0,001, ANOVA, figur 2). Videre, enten i kreft øyer eller i de stromale regionene, tettheten av CD68
+ COX-2
+ TAMs var signifikant høyere i høy MUC2 ekspresjon gruppe enn i den lave MUC2 uttrykket (p 0,001, ANOVA, figur 2). I tillegg, i hele seksjonen (kreft holme + stromal region), var gjennomsnittlig forholdet mellom CD68
+ COX-2
+ TAMs /totalt CD68
+ TAMs var signifikant høyere i høy MUC2 uttrykk gruppen enn i den lave MUC2 uttrykk (p 0,001, Student t test, figur 2). Et antall CD68
-COX-2
+ kreftceller ble observert rundt CD68
-COX-2
+ TAMs, særlig i prøvene fra den høye MUC2 uttrykket gruppe (figur 2).
(A) CD68
+ COX-2
+ TAMs i et representativt kreftvev delen fra den høye MUC2 uttrykk gruppe ble vist. (B) CD68
+ COX-2
+ TAMs i et representativt kreftvev delen fra lav MUC2 uttrykk gruppe ble vist. Kjerner ble farget med SYTO 40, vist i lilla. Arrowhead, CD68
+ COX-2
+ TAM. Arrow, CD68
+ COX-2
– TAM. Asterisk, COX-2
+ kreftceller (CD68
-) rundt CD68
+ COX-2
+ TAM. (C) intratumorale tettheter av CD68
+ TAMs og CD68
+ COX-2
+ TAMs og CD68
+ COX-2
+ /CD68
+ TAM prosenter av de høye og lave MUC2 uttrykk grupper ble sammenlignet, som var de tilsvarende verdier for kreft holmen og stromale regioner. Det kan bli funnet at forholdet mellom CD68
+ COX-2
+ /CD68
+ TAMs var signifikant høyere i høy MUC2 uttrykk gruppen enn i lav MUC2 uttrykk gruppe *, p 0,05, Student t-test. **, P 0,05, ANOVA.
M1 og M2 differensiering mønstre og deres forhold til TAM COX-2 uttrykk
For å etablere forholdet mellom COX-2 uttrykk nivå og differensiering status for TAMs, brukte vi en trippel-farging teknikk for å bestemme M1 og M2-differensierings mønstre av CD68
+ COX-2
+ TAMs som hadde infiltrert eggstokkreft vev. Vanligvis, i alle prøvene, 3% -20% av CD68
+ COX-2
+ TAMs ble identifisert som M1 polarisert (HLA-DR
+ eller iNOS
+), og 63% -89% ble identifisert som M2 polarisert (CD163
+ eller VEGF
+), uavhengig av MUC2 uttrykk status. Men den gjennomsnittlige andelen av M1-polarisert COX-2
+ TAMs var betydelig lavere i høy MUC2 uttrykk gruppen enn i lav MUC2 uttrykk (p 0,001, ANOVA); og den gjennomsnittlige andelen av M2-polarisert COX-2
+ TAMs var signifikant større i høy MUC2 uttrykket (p 0,001, ANOVA, figur 3). I tillegg har COX-2
+ celler i kreft vevssnittene utgjorde 3% -13% av all den observerte M1 TAMs (dvs. CD68
+ HLA-DR
+ eller CD68
+ iNOS
+ celler), og sto for 93% -100% av M2 TAMs observert (CD68
+ CD163
+ eller CD68
+ VEGF
+). Forholdet mellom COX-2
+ celler i M1 og M2 TAM populasjoner av de to MUC2 uttrykk gruppene var ikke signifikant forskjellig (for M1 undergrupper, p = 0,161, og for M2 undergrupper, p = 0,610, ANOVA, Figur 3) .
(A) Representant CD68, COX-2 og M1 /M2 signatur trippel-immunostained seksjoner vises. Arrowhead, COX-2
+ TAMs som uttrykte M1 eller M2 signaturer. Gul pil, COX-2
+ TAMs som ikke uttrykker M1 eller M2 signatur indekser. Blå pilen, COX-2
– M1 eller M2 TAM. Asterisk, COX-2
+ kreftceller. Scale bar, 10 mikrometer. (B) Prosentandelene av M1 og M2-polariserte TAMs i CD68
+ COX-2
+ TAM populasjoner som infiltrerte det kreftvev i de to MUC2 ekspresjon nivå grupper ble sammenlignet. (C) Prosentandelene av COX-2
+ celler i M1 og M2 populasjoner av de intratumorale TAMs i to MUC2 ekspresjon nivå grupper ble sammenlignet. Det kan bemerkes at det meste av COX-2
+ TAMs i både høye og lave MUC2 uttrykk grupper oppviste M2-signaturer (dvs. CD163
+ og VEGF
+). *, P 0,05, ANOVA. NS, ingen betydning, ANOVA.
Sammenheng mellom MUC2 uttrykk status og COX-2 uttrykk status på eggstokkreft vev
Det ble tidligere rapportert at PGE
2, den katalytiske produktet av COX-2 utgitt av COX-2
+ TAMs kan oppregulere intracellulær ekspresjon av COX-2 i de dyrkede kreftceller [27]. Følgelig undersøkte vi sammenhengen mellom COX-2 uttrykk statusene eggstokkreft celler og infiltrere TAMs i registrert pasientpopulasjonen. De oppnådde data viste at tettheten av COX-2
+ kreftceller var signifikant høyere i høy MUC2 uttrykket gruppe (p = 0,017, Student t test, figur 4), med en betydelig økt lokal konsentrasjon av PGE
2 detekteres ved hjelp av enzymbundet immunosorbent assay (ELISA) (metoder for å utføre ELISA ble levert av materialer og metoder S2 i File S1, ble resultatene av PGE
2 ELISA eksperiment gitt av fig S2 i File S2) sammenlignet den lave MUC2 uttrykk gruppe. Dessuten ble en statistisk signifikant korrelasjon funnet mellom tettheten av COX-2
+ kreftceller og som av COX-2
+ TAMs i prøvene fra den høye MUC2 uttrykket gruppe, og det meste av COX-2
+ kreftceller ble oppdaget i områdene nær COX-2
+ TAMs (p = 0,035, Pearsons korrelasjonsanalyse, figur 4). Imidlertid ingen slik korrelasjon ble funnet i den lave MUC2 uttrykket gruppe, noe som tyder på at hoveddelen av COX-2
+ kreftceller ble observert i de eggstokkreft eksemplarer av denne gruppen som er mest sannsynlig et resultat av spontane genekspresjon, men ikke uttrykket indusert av noen nabo COX2
+ TAMs (p = 0,389, Pearsons korrelasjonsanalyse, figur 4).
(A) Representative mikroskopiske felt i kreft vevssnitt fra de høye og lave MUC2 uttrykk grupper. I de kreft vevssnittene fra den høye MUC2 uttrykket gruppe, COX-2
+ kreftceller og COX-2
+ TAMs (med cytoplasma i røde) var ofte fordelt over hele holmen region, mens i kreftvevet fra den lave MUC2 uttrykket gruppe, COX-2
+ kreftceller og COX-2
+ TAMs var begge observert sjeldnere. Arrow, CD68
+ TAMs (venstre, CD68
+ COX-2
+ TAMs i lilla, høyre, CD68
+ COX-2
– TAM i brunt). Scale bar, 50 mikrometer. (B) Sammenligning av COX-2
+ cancercelletettheter mellom de høye og lave MUC2 uttrykk grupper. *, P 0,05, t-test. (C) Spredningsplott av COX-2
+ kreftcelletettheten versus COX-2
+ TAM tetthet i prøver fra de høye (23 tilfeller) og lav MUC2 uttrykk (79 tilfeller) grupper. r, Pearsons produkt-moment korrelasjonskoeffisient.
Kaplan-Meier overlevelsesanalyse og multivariat Cox regresjonsanalyse av resultatene
Siden vi observert at MUC2 uttrykket nivået påvirket M1 /M2 forholdet mellom TAMs i de evaluerte kreftvevet, vi videre undersøkt om denne lokale immunologiske endringen kan utøve en betydelig innflytelse på 5-års overlevelse av de inkluderte kreftpasienter. Vi utførte en Kaplan-Meier-overlevelsesanalyse og en multivariat Cox regresjonsanalyse for å undersøke forholdet mellom den MUC2 ekspresjonsnivået og pasientens overlevelse. Referanseparametrene som benyttes i de to analysemetoder inkludert pasientens alder, BMI, ascites status og metastase, såvel som kreft stadium, histotype og karakter, størrelsen av gjenværende området, M1 /M2-forholdet av de TAMs og COX-2 ekspresjon nivåer av TAMs og kreftceller. Kaplan-Meier overlevelsesanalyse viste at 5-års progresjonsfri overlevelse (PFS) rate og total overlevelse (OS) rate var begge signifikant lavere i høy MUC2 uttrykk gruppen enn i lav MUC2 uttrykk (p 0,001 for PFS og p 0,001 for OS, log-rank test, figur 5). I tillegg er en redusert M1 /M2-forhold og økt tetthet av COX-2
+ TAMs og COX-2
+ kreftceller ble begge de prediktorene for dårlig prognose (figur 5, for prognostisk betydning av andre parametere, se Figur S3 i File S2). Den multivariate Cox regresjonsanalyse viste at nivået av MUC2 ekspresjon i kreftcellene, peritoneal metastasis, kreft stadium, histotype og karakter, størrelsen av gjenværende området, M1 /M2-forholdet av de TAMs og tettheten av COX-2
+ TAMs og COX-2
+ kreftcellene var uavhengige prognostiske faktorer for eggstokkreft kreftpasientutfall (Tabell 3).
(A) MUC2 uttrykk nivå, lav (immunofarging – /+) vs. høy (farging ++ /+++). (B) M1 /M2-forhold, lavere vs. høyere enn middelverdien. (C) COX-2
+ TAM tetthet, lavere vs. høyere enn middelverdien. (D) COX-2
+ kreftcelletetthet, lavere vs. høyere enn middelverdien. PFS, progresjonsfri overlevelse. OS, total overlevelse.
Parameter *
Hazard ratio
†
95% konfidensintervall
p-verdi
Age 59.1 years0.9910.939-1.0450.731BMI 23.20.9870.880-1.1080.830Existence av ascites0.9910.472-1.8190.824Existence av peritoneal metastasis2.2481.126-5.6290.002
§Existence av lymfatisk metastasis1.2260.607-2.4770.570Size av rest nettstedet 2 cm3.0731.240-7.223 0.001
§Stage0.004
§III2.5561.128-9.036IV5.9361.057-16.078Histotype0.016
§Mucinous1.0731.075-3.969Endometrioid0.7501.571-5.394Clear cell1.0551.334-7.881Undifferentiated2.3451.450-12.216Grade0.015
§G21.9011.445-7.827G32.3811.785-9.788Density av CD68
+ COX-2
+ TAMs 10,4 mm
-21.0101.006-1.0350.042
§Density av CD68
-COX-2
+ kreftceller 239,4 mm
-21.0061.002-1.0090.002
§TAM M1 /M2 ratio ≤ 2.41.7671.061-6.9570.019
§MUC2-farging ++ /+++ 2.3541.031-10.7070.005
§Table 3. multivariat Cox regresjonsanalyse av potensielle prognostiske faktorer for eggstokkreft. product: * for å være kortfattet, referansegruppene (hazard ratio = 1) for hver parameter ble utelatt. Disse gruppene var «Age ≤ 59,1 år», «BMI ≤ 23,2», «No ascites», «No peritoneal metastase», «Nei lymfatisk metastase», «Størrelse rest nettstedet ≤ 2 cm», «Stage II», «Serøs «,» G1 «,» tetthet av CD68
+ COX-2
+ TAMs ≤ 10,4 mm
-2 «,» tetthet av CD68
-COX-2
+ kreftceller ≤ 239.4 mm
-2 «,» TAM M1 /M2 ratio 2,4 «og» MUC2-immunofarging – /+ «, henholdsvis. Alle pasientene akseptert en standard taxol + platina terapi, derfor ble kjemoterapi scenario ikke inkludert som et parameter for den multivariate analysen.
† Hazard ratio ble definert som frekvensen av pasientens død i målgruppen dividert med frekvensen av pasientens død i referansegruppen i løpet av fem-års oppfølging.
§ Statistisk signifikans. CSV Last ned CSV
Diskusjoner
Så vidt vi vet, er det første til å undersøke selve immunmodulerende effekten av MUC2 molekyler utskilt av eggstokkreft celler basert på en molekylær patologi tilnærming, som ga ny innsikt i denne studien forholdet mellom kreftceller og TAM. MUC2 overekspresjon har gjentatte ganger blitt vist som en dårlig prognostisk faktor for ikke-fordøyelsessystemet kreftformer, som brystkreft, blærekreft og eggstokkreft, i tidligere studier [28-30]. Imidlertid, den detaljerte mekanisme ved hvilken det fremmer kreft progresjon ikke er tilstrekkelig undersøkt. I denne populasjonsbasert analyse, oppdaget vi en rekke kreftprogresjons fremme endringer (dvs. forhøyede nivåer av CD163, VEGF og COX-2 uttrykk) i TAMs som kontaktet MUC2
++ /+++ eggstokkreft vev og en rekke komplekse og særegne interaksjoner mellom kreftceller og de regjerende makrofager ble identifisert.
Som vist i Figur 1 og Tabell 2, bare M1 /M2-forholdet av de TAMs skilte seg mellom de høye og lave MUC2 uttrykk grupper, mens TAM tettheter i disse to gruppene var like. Dette fenomen antyder at MUC2 bare er involvert i prosessen med TAM differensiering, ikke er i ferd med å TAM rekruttering. Denne immunmodulerende virkning er forskjellig fra den til mange kjente cytokiner som besitter både TAM differensiering-induserende og kjemotaktiske effekter, for eksempel VEGF, CSF-1, CCL2 /3/5 og glypican-3 (GPC3) [31-34], og kanskje oppstår fordi MUC2 reseptor (dvs. makrofag scavenger reseptor) ikke er koblet til den cellulære adhesjons- og motilitetsforstyrrelser enheter i monocytter /makrofager [35]. De nåværende meninger om prognostisk virkningen av endrede M1 /M2 forholdet indusert av MUC2 uttrykk er noe motstridende. Ohri et al. indikerte at en høyere M1 /M2 forhold ført til økt fem års overlevelse på ikke-småcellet lungekreft pasienter, men de fant også at den endrede M1 /M2-forholdet ble ført fra betydelig økt infiltrasjon av M1 TAMs (med mindre økt infiltrasjon av M2 TAM), og var derfor ikke et resultat av en ubalansert TAM polarisering prosessen [15]. Senere Edin et al. indikerte at det var antall infiltrerende M1 TAMs, snarere enn endring i M1 /M2-forhold, som i vesentlig grad påvirket prognosen for pasienter med kolorektal kreft [16]. Men en studie utført av Zhang et al. fant motsatt. Forfatterne observerte at en økt M1 /M2 TAM forholdet alene var nok til å forutsi en bedre prognose for lungekreftpasienter [36]. Like etterpå Algars et al. bekreftet funn at det var M1 /M2-forholdet selv, snarere enn endrede tettheter av den infiltrerende M1 eller M2 TAMs, som spådde en redusert langsiktig forekomst av kreft tilbakefall eller levermetastaser hos pasienter med kolorektal kreft [37]. Derfor våre resultater validert resultatene av Zhang et al. og Algars et al. Vi demonstrerte at en endret M1 /M2-forholdet alene er en uavhengig prognostisk indikator for eggstokkkreftpasienter (tabell 3, figur 5), noe som også innebærer at den kjemotaktiske effekt på monocytter /makrofager er ikke nødvendig for noen immunsuppressive faktorer, som MUC2, å påvirke pasienten prognose.
