Abstract
Bakgrunn
Vekstfaktorer aktivering av ErbB reseptorer har blitt beskrevet i prostatakreft. Androgen avhengige prostatakreft-cellelinje, LNCaP, uttrykker ErbB-1, ErbB-2 og erbB-3-reseptor-tyrosin-kinaser. Tidligere ble det vist at NRG aktiverer ErbB-2 /ErbB-3 heterodimerer for å indusere LNCaP celledød, mens EGF aktiverer ErbB-1 /ErbB-1 eller ErbB-1 /ErbB-2-dimerer å indusere cellevekst og overlevelse. Det ble også vist at PI3K hemmere fortrengt dette celledød tyder på at i androgen fratatt LNCaP celler, aktiverer NRG et PI3K avhengig vei assosiert med celledød.
Metodikk /hovedfunnene
I den foreliggende studien viser vi at NRG induserer autofagi i LNCaP celler, ved hjelp av LC3 som markør. Imidlertid kan autophagy indusert av NRG være ufullstendig siden P62 nivåer heve. Vi har også vist at nrg- indusert autofagi er uavhengig av mammalian target of rapamycin (mTOR) hemming siden NRG induserer Akt og S6K aktivering. Interessant, hemming av reaktive oksygenforbindelser (ROS) av
N
acetylcysteine (NAC), hemmet NRG-indusert autofagi og celledød. Vår studie også identifisert JNK og Beclin 1 som viktige komponenter i NRG-indusert autofagi og celledød. NRG indusert økning i JNK-fosforylering som ble inhibert av NAC. Videre hemmer av JNK hemmet NRG-indusert autofagi og celledød. Også, i celler som overuttrykker Bcl-2 eller celler som uttrykker sh-RNA mot Beclin 1, effekten av NRG, nemlig induksjon av autophagy og celledød, ble hemmet.
Konklusjoner /Betydningen
Således , i LNCaP-celler, NRG-induserer ufullstendig autofagi og celledød som avhenger av ROS nivåer. Disse effektene av NRG formidles av signalveien som aktiverer JNK og Beclin 1, men er uavhengig av mTOR-hemming
Citation. Schmukler E, Shai B, Ehrlich M, Pinkas-Kramarski R (2012) neuregulin Fremmer Ufullstendig autophagy av prostata kreft celler som er uavhengig av mTOR Pathway Hemming. PLoS ONE 7 (5): e36828. doi: 10,1371 /journal.pone.0036828
Redaktør: Antimo Migliaccio, II Università di Napoli, Italia
mottatt: 05.01.2012; Godkjent: 06.04.2012; Publisert: May 14, 2012 |
Copyright: © 2012 Schmukler et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Israel Science Foundation (bevilgning nr 732/08), av Israel Ministry of Health (tilskudd No. 3942), av Israel Cancer Association (bevilgning nr 4914422) og av Kauffman Prostate Cancer Research Fund. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
prostatakarsinom er en av de vanligste mannlige kreftformer. Prostata-celler vekst reguleres av hormoner, vekstfaktorer og deres respektive reseptorer. Blant de vanligste gruppen av reseptorer implisert i human cancer er den ErbB familien av reseptor-tyrosin-kinaser [1], [2], [3]. Denne familien omfatter fire reseptorer ErbB-en-ErbB-4. Mens ErbB-1-reseptoren (også kjent som epidermal vekstfaktor-reseptor, EGFR), aktiveres av EGF og EGF-lignende ligander, ErbB-3 og ErbB-4-reseptorer aktiveres av NRG /neuregulin-isoformer og ErbB-2-reseptoren har ingen kjent ligand [4]. Disse reseptorer er uttrykt i prostata epitel, mens, ErbB-1 ligander er uttrykt i stroma og NRGs er uttrykt i stroma og i basal og sekretoriske epitelet [5].
aktivering av ErbB-en signale av EGF og EGF-lignende vekstfaktorer spiller en viktig rolle i prostatacancer celleproliferasjon og tilsetning av EGF til kulturer av prostata kreft celler stimulerer deres vekst [6]. Videre er ErbB-2 overekspresjon en felles hendelse som ser ut til å gi en selektiv fordel til flere typer karsinomer inkludert prostata kreft [3], [7]. Normalt er ErbB-2 uttrykt i prostata epitelceller [7], [8]. Høyere nivåer av ErbB-2, sammenlignet med normale vev ble observert i prostatatumorer [9], [10]. I tillegg har overekspresjon av erbB-2 og erbB-3 vært implisert i neoplastisk transformasjon av prostatacancer [11]. Selv om den nøyaktige rollen til disse onkogener og vekstfaktorer i prostata carcinoma er fremdeles uklar, har overekspresjon av erbB-1 og ErbB-2 vært relatert til dårlig prognose og fjern metastase [12].
Autophagy, en prosess regulert omsetning av cellulære bestanddeler, er viktig for normal vekst kontroll, men kan være defekt ved sykdommer [13], [14]. Under begrenset næringsstoffer eller vekstfaktorer betingelser, er denne prosessen viktig å opprettholde energiproduksjon for celleoverlevelse [15]. Autofagi kan også tjene som en mekanisme som celler kvitte seg fra defekte organeller og resirkulere proteiner [16]. På den annen side kan autophagy føre til ikke-apoptotiske type celledød (type II celledød) å spille en rolle i utviklings celledød og død på grunn av toksiske stimuli [17].
Dannelsen av autophagosomes er kontrollert av flere atg proteiner. Atg8 protein (den humane homologen er MAP-LC3) er forbundet med autophagosomal membran og tjener som en markør for autophagosome formasjon [18]. Dannelse av autophagosome krever også klasse III fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K) [19]. Autophagy mediert av PI3K avhenger av interaksjonen av den sistnevnte med atg6 protein, hvorav Beclin 1 er den humane homologen [20]. Beclin 1 ble vist å virke som et tumorsuppressorgen ved å kontrollere prosessen med autophagy [21]. Dets interaksjon med det anti-apoptotiske protein Bcl-2 [22] hemmer autofagi [23]. Nedregulering av Bcl-2 kan tilsynelatende fremme autophagy [24], som tyder på at Beclin 1-mediert autofagi kan bli inhibert av dens interaksjon med Bcl-2. Flere nylig, flere studier identifisert BCL-2 samspill domene i Beclin 1 (en BH3 domene) [25], [26], [27].
Tidligere studier har vist at NRG (ErbB3 og ErbB4 ligand) hemmer vekst av androgenavhengige LNCaP prostatakreftceller når de ble dyrket i fullstendig medium [28], mens i fravær av androgen, NRG-indusert død av LNCaP-celler [29]. Interessant, PI3K-inhibitor (3-metyladenin) som også hemmer autofagi, hemmet NRG-indusert celledød, noe som tyder på at NRG kan indusere autophagic celledød i disse celler [29]. I denne studien, adressert vi hypotesen om at NRG formidler autofagi i LNCaP celler og studerte signalveier som formidler NRG indusert autofagi og celledød. Ved å bruke LC3 som en markør, viser vi at NRG øker LC3-II. Imidlertid er nivåene av p62 /SQSTM1 proteinet, som binder LC3 og nedbrytes av autofagi [30], ble ikke redusert ved NRG behandling, noe som indikerer at autophagy indusert av NRG er ufullstendig.
Vi demonstrerer også at inhibering av reaktive oksygenforbindelser (ROS) av
N
acetylcysteine (NAC) hemmer NRG-mediert autofagi og celledød. Våre resultater tyder på at NRG aktiverer klasse I PI3K, Akt, mTOR og pS6K vei, en kjent autophagy hemmende vei, som ikke er hemmet av NAC. I tillegg, viser vi at NRG induserer JNK-aktivering, som hemmes av NAC. Videre JNK inhibitor, Beclin en lyddemping og BCL-2 overekspresjon, hemmet NRG-indusert autofagi og celledød. Således foreslår en modell ved hvilken NRG-indusert autofagi og celledød av LNCaP-celler involverer Beclin 1 og JNK-signalveier, og er uavhengig av PI3K /Akt /mTOR signalveien inhibering.
Resultatene
NRG induserer Autophagy, som hemmes av 3-metyladenin (3-MA) i LNCaP-celler
LNCaP er en androgen responsiv prostata carcinoma cellelinje som uttrykker ErbB-reseptorer [29]. Tidligere viste vi at NRG induserer celledød som ble inhibert av 3-MA, et PI3K-inhibitor [29], og er uavhengig caspase (Ikke vist og [29]). Det ble også demonstrert at NRG induserer morfologiske forandringer i LNCaP-celler som ble inhibert av 3-MA (Video-S1 og [29]). I denne studien analyserte vi effekten av NRG på autofagi og celledød av LNCaP celler dyrket uten androgen mimetisk. For å bestemme autophagy induksjon, vi brukte LC3 protein som en markør. Som vist i figur 1 A, oppviste LNCaP-celler ble behandlet med NRG i 14 timer og 24 timer, forbedret omdannelse av LC3-I til LC3-II, som ble inhibert av 3-MA, noe som indikerer at faktisk NRG induserer autophagy i LNCaP-celler. For ytterligere å demonstrere autophagy induksjon, anvendte vi LNCaP-celler som stabilt uttrykker GFP-LC3 ekspresjonsvektor. Som vist i figur 1B, NRG-indusert forbedret autophagosome formasjon som reflekteres ved økt punctuated farging av GFP-LC3. Som en positiv kontroll ble celler behandlet med rapamycin, som også indusert autophagy i LNCaP-celler (figur 1B). Dermed LNCaP celler svare på NRG av økt autofagi induksjon. For ytterligere å studere autofagi indusert av NRG, undersøkte vi uttrykket nivået av p62 /SQSTM1. Den p62 /SQSTM1 protein binder LC3-II og blir degradert av autofagi [30]. Overraskende, NRG behandling ikke forbedre p62 degradering indikerer at autofagi indusert av NRG kan være ufullstendig. Som en kontroll, ble cellene behandlet med Earles balanserte saltløsning (EBSS), og nivåene av LC3-II og p62 ble bestemt ved Immunoblot (figur S1). Som vist, EBSS indusert LC3-II heving og p62 degradering som forventet. Av notatet, 3-MA behandlings redusert LC3-II i NRG behandlet celler samt P62 nivåer i fravær av NRG. Forklaringen for disse resultatene er ennå ikke kjent.
(A) LNCaP-celler ble behandlet med 100 ng /ml neuregulin (NRG) i nærvær eller i fravær av 10 mM 3-metyladenin (3-MA) for den angitte tidsperioden. Helcellelysater ble fremstilt og underkastet en immunoblot-analyse med anti-LC3 og anti-P62-antistoffer.
Øvre panel,
representative resultater.
Nedre panel, etter densitometrisk analyse blir presentert som fold induksjon over kontroll ubehandlede celler (n = 3 betyr ± S.D; * p 0,05). (B) LNCaP-celler som stabilt uttrykker LC3-GFP ble behandlet med 50 nM rapamycin for over natten eller med 100 ng /ml NRG i 5 timer. Cellene ble fiksert med 4% paraformaldehyde og kjerner ble farget med bisdenzimide (Hoecsht 33258). Etter fiksering og farging ble cellene fotografert ved hjelp av Nikon optisk fluorescens mikroskop Model TE-2000S (60 x forstørrelse).
Øvre panel
, representative bilder.
Nedre panel
, autofagi ble kvantifisert ved å telle antall LC3 punkter per celle ved hjelp av ImageJ programvare. Resultatet er vist er representative for to uavhengige eksperimenter. 70-80 celler ble analysert pr behandling; data presentert som gjennomsnitt ± SD (*
p
0,05)
NRG-indusert Autophagy er ufullstendig
NRG behandling induserer autofagi, men også fører til en. økning i P62 nivåer, noe som indikerer at autophagy indusert av NRG er ufullstendig (figur 1). For ytterligere å bekrefte disse resultatene, ble LNCaP-celler som stabilt uttrykker LC3-GFP-fusjonsprotein, enten behandlet med NRG i 24 timer eller inkubert med EBSS medium i flere timer. Cellelysater ble immunoblottet med anti-GFP-antistoff for å påvise nivåene av GFP-merket LC3-I og LC3-II. Som vist i figur 2A, både EBSS og NRG indusere autophagy, som bedømt ved økningen av LC3-II-GFP nivåer sammenlignet med ubehandlede celler. Men i celler inkubert med EBSS, LC3-II-GFP nivåer avtar over tid, mens i celler behandlet med NRG nivåene av LC3-II-GFP er relativt høy, selv etter 24 timers inkubering. Videre, i nærvær av bafilomycin-A
1 (inhibitor av autophagosome-lysosomet fusjon) akkumulering av LC3-II-GFP er vesentlig høyere i EBSS behandlede celler sammenlignet med NRG behandlede celler (figur 2B). Samlet utgjør disse funn tyder på at NRG-indusert autofagi er ufullstendig.
(A) LNCaP celler som stabilt uttrykker LC3-GFP ble behandlet med 100 ng /ml NRG i 24 timer eller inkubert med EBSS medium for den angitte tid perioder. Helcellelysater ble fremstilt og underkastet en immunoblot-analyse med anti-GFP-antistoff. (B) LNCaP-celler som stabilt uttrykker LC3-GFP ble behandlet med 100 ng /ml NRG i 24 timer eller inkubert med EBSS medium for 2 og 4 timer. Behandlinger ble utført i nærvær eller fravær av 10 nM bafilomycin-A1 (Bafilo-A1). Helcellelysater ble fremstilt og underkastet en immunoblot-analyse med anti-GFP-antistoff.
Øvre panel
, representant blot.
Nedre panel
blir densitometrisk analyse presentert som gangers induksjon over kontroll ubehandlede celler (venstre grafen; *, p 0,05 og **, p 0,02 sammenlignet med kontrollgruppen) eller som forskjellen mellom de målte verdier med eller uten 10 nM Bafilo-A1 i hver gruppe (høyre graf, *, p 0,05 og **, p 0,02 sammenlignet med NRG tretment) (n = 3 betyr ± SD)
. NRG-indusert autophagy og celledød av LNCaP-celler inhiberes av reduksjon av reaktive oksygen arter (ROS) Nivåer
det ble tidligere vist at autofagi induksjon er avhengig av dannelse og akkumulering av ROS [23], [31] , [32], [33]. Derfor, for å karakterisere virkningen av ROS på NRG-mediert autofagi og celledød, ble LNCaP-celler stimulert med NRG i nærvær eller i fravær av den generelle anti-oxidant
N
acetylcysteine (NAC) [34 ], og LC3 og P62-nivåer ble bestemt ved immunoblot (fig. 3A). Pre-inkubasjon med NAC fullstendig hemmet NRG-indusert LC3-II høyde, noe som indikerer at NRG-indusert autofagi er ROS-avhengig. Deretter undersøkte vi om NAC kan beskytte mot NRG-indusert celledød. LNCaP-celler ble forbehandlet med NAC med og uten NRG behandling, og cellelevedyktigheten ble bestemt ved anvendelse av metylen-blå farging assay. Som vist i figur 3B, tilstedeværelse av NAC hindres reduksjon i celleviabilitet indusert av NRG. Ytterligere to metoder for påvisning av celledød (Hoecsht fargestoff eksklusjon analysen og flowcytometri) videre støttet disse resultatene. NRG indusert forbedret celledød, slik det fremgår av økningen i sub-populasjon G1 (figur 3C) eller ved høy prosentandel av Hoecsht-positive celler (figur 3D). Dette celledød ble markert hemmet av NAC. Videre NAC behandling hemmet NRG-indusert morfologisk endring (S5). Derfor våre funn viser klart at NAC hemmer LC3-II akkumulering, celledød og morfologiske endringer indusert av NRG i LNCaP celler.
(A) LNCaP celler ble behandlet med 100 ng /ml NRG med eller uten 10 mM
N
acetylcysteine (NAC) i 24 timer. Helcellelysater ble fremstilt og underkastet en immunoblot-analyse med anti-LC3 og anti-P62-antistoffer.
Venstre panel,
representative resultater.
Høyre panel, etter densitometrisk analyse blir presentert som fold induksjon over kontroll ubehandlede celler (n = 6 betyr ± S.D; * p 0,05). (B) LNCaP-celler ble testet for cellelevedyktighet ved bruk av metylen-blå farging assay. Celler ble behandlet med 100 ng /ml NRG i nærvær eller i fravær av 10 mM NAC. Metylenblått Analysen ble utført 60 timer senere. Resultatene er presentert som% av kontroll, og er gjennomsnitt ± S.D av 4-6 bestemmelser (** p 0,0001). Dette eksperimentet ble gjentatt tre ganger med lignende resultater. (C) LNCaP-celler ble behandlet med 100 ng /ml NRG med eller uten 10 mM NAC. Cellene ble høstet 60 timer senere og analysert med henblikk på deres DNA-innhold ved strømningscytometri. Prosentandelen av celler i forskjellige cellesyklusstadier er indikert. (D) LNCaP-celler ble behandlet med 100 ng /ml NRG i nærvær eller i fravær av 10 mM NAC i 60 timer. Cellene ble farget med det fluorescerende DNA-fargestoff bisbenzimide (Hoecsht 33258, 1 ug /ml) for å vurdere antall døende celler. Etter farging ble cellene fotografert med Olympus optisk invertert fase-kontrast mikroskop Modell IX70 (20 × forstørrelse; skala barer, 50 mikrometer).
Venstre panel
, representative bilder.
Høyre panel
, andel av døende celler ble beregnet ved å telle antall Hoecsht-positive celler i forhold til antallet totale celler i hvert felt (10-15 felt for hver behandling, 100-200 celler pr felt). Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± SD (** p 0,0001)
NRG-indusert LC3-II Elevation og celledød i LNCaP celler er uavhengig av Akt /mTOR signalveien
for å bestemme den signalveien som fører til NRG-indusert autofagi og celledød, vi først undersøkt Akt /mTOR-signalveien. LNCaP-celler uttrykker PTEN mutasjon som fører til aktivering Akt [35], [36]. Akt aktiverer mTOR, som er en kjent negativ regulator av autophagy [37], [38]. Således var det rimelig å undersøke fosforylering og aktivering av disse proteinene. LNCaP-celler ble behandlet med NRG i 24 timer og aktivering av Akt og mTOR ble undersøkt ved hjelp av anti-fosfo Akt og anti-fosfo S6K antistoffer. Som vist i figur 4A, basalnivået av fosforylert Akt og S6K ble observert i kontroll ubehandlede celler, men NRG behandlingen økte nivået av fosforylert Akt og S6K. NAC, som hemmer NRG-indusert autophagy, hadde ingen effekt på fosforylering nivåer av hverken Akt eller S6K. Disse resultatene kan tyde på at NRG-indusert autofagi er uavhengig av mTOR-hemming. For ytterligere å undersøke signalveien som er involvert i NRG-indusert autophagy i LNCaP-celler, vi neste undersøkte aktivering av JNK og Erk, to kjente mitogen aktivert protein-kinaser (MAPK) som er nedstrøms signalkomponentene av ErbB-reseptorer [39]. Spesifikke anti fosfo-protein-antistoffer mot ERK1 /2 og JNK ble anvendt. Som vist i figur 4, NRG induserte en økning i fosforylering av ERK1 /2 og JNK. NAC, som hemmer NRG-indusert autophagy, hadde ingen effekt på ERK1 /2 fosforylering, hvilket indikerer at Erk aktivering ikke er involvert i NRG-indusert autofagi eller at NAC virker nedstrøms til Erk aktivering. På den annen side ble JNK fosforylering sterkt redusert i nærvær av NAC, noe som indikerer at JNK kan være en potensiell mediator av NRG-indusert autofagi.
(A) LNCaP-celler ble behandlet med 100 ng /ml med NRG eller uten 10 mM NAC i 24 timer. Helcellelysater ble fremstilt og underkastet en immunoblotanalyse med de angitte antistoffer. (B) Densitometrisk analyse av flere gjentagelser er presentert som gangers induksjon av kontroll ubehandlede celler. Det betyr av band intensitet ble standardisert i forhold til de totale ufosforylerte proteinsignaler (Dataene er middelverdien fold induksjon ± SD; * p 0,05).
Siden NRG indusert S6K fosforylering men også indusert autofagi, vi neste forhold autofagi indusert av mTOR-hemming til autofagi indusert av NRG. Den mTOR-hemmer, rapamycin, ble tidligere vist å indusere autofagi av downregulating mTOR aktivitet [37], [40]. Vi fant at rapamycin behandling så vel som behandling NRG indusert autophagy, bedømt ved hjelp av den økede LC3-II /LC3-I-forholdet (figur 5A og B) og med forbedret LC3 puncta dannelse (figur 1B). Imidlertid, som forventet, var S6K fosforylering øket følgende NRG behandling, men redusert etter behandling rapamycin. I tillegg NAC behandling hemmet autofagi indusert av rapamycin og NRG, men det har ingen effekt på NRG-indusert S6K fosforylering. Interessant, rapamycin behandling selv om inhiberte cellevekst [29], hadde ingen effekt på celler morfologi, mens NRG forårsaket en dramatisk morfologisk endring som tidligere beskrevet [28], [29] og som vist i figur 5C og fig S1 (rund og frigjorte celler ). Disse resultater viser at NRG-indusert autofagi skiller seg fra autofagi utløst av rapamycin. Deretter undersøkte vi effekten av NRG og rapamycin co-behandling på autofagi-inducion i LNCaP celler (Figur 5D). Som vist, kombinert behandling induserte høyere nivåer av LC3II sammenlignet med hver behandling alene, noe som tyder på at rapamycin og NRG kan virke gjennom forskjellige signalveier for å indusere autofagi.
(A) LNCaP-celler ble behandlet med enten 100 ng /ml NRG eller 50 nM rapamycin (Mana) i 24 timer, i nærvær eller i fravær av 10 mM NAC. Helcellelysater ble fremstilt og underkastet en immunoblot-analyse med anti-LC3, anti-fosfo-S6K og anti-S6K antistoffer. (B) Densitometrisk analyse av resultatene som er beskrevet i A er representert som gangers induksjon av kontroll ubehandlede celler (n = 3, middelverdier ± S.D). (C) Representative bilder av cellemorfologi følgende behandlinger med NRG og rapamycin vises (Olympus, 20 × forstørrelse). (D) LNCaP-celler ble behandlet med enten 100 ng /ml NRG, 50 nM rapamycin eller begge deler i 24 timer. Helcellelysater ble fremstilt og underkastet en immunoblot-analyse med anti-LC3 antistoffer. Dette eksperimentet ble gjentatt tre ganger med samme resultat.
NRG-indusert autophagic celledød i LNCaP celler Avhenger av JNK Activation
Fordi mTOR veien ikke er involvert i NRG-indusert autofagi og celledød, søkte vi etter andre mulige mediatorer. Vi valgte å undersøke involveringen av JNK, da NRG indusert fosforylering JNK, som ble inhibert av NAC. Derfor må vi først undersøkt effekten av JNK inhibitor SP600125 på NRG-indusert autofagi (Figur 6A). Som vist, i nærvær av SP600125, NRG-indusert autophagy ble hemmet, som bedømt ved det reduserte LC3-II /LC3-I-forhold. Likevel, SP600125 behandling hadde ingen virkning på P62 nivåer. Deretter undersøkte vi effekten av JNK inhibitor av cellelevedyktighet ved hjelp Hoecsht fargestoff utelukkelse og metylen blå farging analyser (fig. 6B og C, henholdsvis). Som vist, i nærvær av JNK inhibitor, ble NRG-indusert celledød inhiberes; indikerer at JNK-aktivering av NRG kan være viktig for induksjon av autophagy og celledød av LNCaP-celler.
(A) LNCaP-celler ble behandlet med 100 ng /ml NRG i 24 timer med eller uten 20 mM SP600125. Helcellelysater ble fremstilt og underkastet en immunoblot-analyse med anti-LC3, anti-p62, anti-p-JNK og anti-JNK-antistoffer.
Venstre panel,
representative resultater.
Høyre panel, etter densitometrisk analyse blir presentert som fold induksjon over kontroll ubehandlede celler (n = 5 betyr ± S.D; * p 0,05). (B) LNCaP-celler ble behandlet med 100 ng /ml NRG i nærvær eller i fravær av 20 pM SP600125 i 60 timer. Cellene ble farget med det fluorescerende DNA-fargestoff bisbenzimide (Hoecsht 33258, 1 ug /ml) for å vurdere antall døende celler. Etter farging ble cellene fotografert med Olympus optisk invertert fase-kontrast mikroskop Modell IX70 (20 × forstørrelse; skala bar, 50 mikrometer).
Venstre panel
, representative bilder vises.
Høyre panel
, andel av døende celler ble beregnet ved å telle antall Hoecsht-positive celler i forhold til antallet totale celler i hvert felt (10-15 felt for hver behandling, 100-200 celler pr felt). Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± S.D (** p 0,0001). (C) LNCaP-celler ble testet for cellelevedyktighet ved bruk av metylen-blå farging assay. Celler ble behandlet med 100 ng /ml NRG i nærvær eller i fravær av 20 pM SP600125. Metylenblått Analysen ble utført 60 timer senere. Resultatene er presentert som% av kontroll, og er gjennomsnitt ± S.D av 4-6 bestemmelser (** p 0,0001). Dette eksperimentet ble gjentatt tre ganger med samme resultat.
Beclin 1 er nødvendig for og BCL-2 gir resistens mot NRG-indusert Autophagy og celledød
Beclin en, en komponent av den klasse-III-PI3K-komplekset, er en viktig regulator av kjent autophagy [41], [42]. For å bestemme involvering av denne veien i NRG-indusert autofagi, ble LNCaP celler transfektert med sh-Beclin en eller kontroll egge sh-RNA ekspresjonsvektorer. Som vist i figur 7A, NRG behandling forbedret autophagy i kontrollcellene. Men i sh-Beclin 1 transfekterte celler, ble NRG-mediert autofagi redusert i forhold til kontrollcellene. Disse resultatene indikerer at Beclin 1 protein er involvert i NRG mediert autofagi i LNCaP-celler.
(A) LNCaP-celler ble transfektert med Beclin en sh-RNA (3 ug) eller kontroll egge sh-RNA (3 ug) og inkubert i normalt medium i 72 timer. Cellene ble så behandlet med 100 ng /ml NRG for ytterligere 24 timer. Helcellelysater ble fremstilt og underkastet en immunoblot-analyse med anti-LC3 og anti-Beclin 1-antistoffer.
Venstre panel
, representant eksperimentet er vist.
Høyre panel
, kvantifisering av resultatene er vist. Resultatene er presentert som gangers induksjon sammenlignet med kontroll ubehandlede celler (n = 3, middelverdier ± S.D; * p 0,05). (B) naive eller Bcl-2-GFP som stabilt uttrykker LNCaP-celler ble behandlet med 100 ng /ml NRG for de angitte tidsperioder. Helcellelysater ble fremstilt og underkastet en immunoblot-analyse med anti-LC3 og anti-Bcl-2-antistoffer.
Venstre panel
, representant blot er vist.
Høyre panel
, kvantifisering av resultatene er presentert som gangers induksjon sammenlignet med kontroll ubehandlede celler (n = 3, middelverdier ± S.D; * p 0,05). (C) Naive og Bcl-2-GFP som stabilt uttrykker LNCaP-celler ble testet for cellelevedyktighet ved bruk av metylen-blå farging assay. Celler ble behandlet med 100 ng /ml NRG og metylenblått analysen ble utført 60 timer senere. Resultatene er presentert som% av kontroll, og er gjennomsnitt ± S.D av 4-6 bestemmelser (** p 0,0001). Dette eksperimentet ble gjentatt tre ganger med lignende resultater.
Medlemmer av Bcl-2 anti-apoptotiske familie ble tidligere vist å inhibere autophagy-fremmende aktivitet av Beclin 1 [23]. Det ble også vist at i løpet av autofagi inhiberes interaksjonen mellom BCL-2 anti-apoptotiske proteiner og Beclin 1. Forutsatt at Beclin en er involvert i NRG-indusert autofagi og celledød, hypotese vi at overekspresjon av Bcl-2 ville beskytte LNCaP celler fra NRG-indusert autofagi og celledød. Således vi ved undersøkt effekten av Bcl-2-GFP overekspresjon på NRG-mediert autofagi av LNCaP-celler (figur 7B). Som vist, ble autophagy i naive LNCaP-celler økt etter 16 timer og 24 timer av NRG behandling, mens i LNCaP-celler som stabilt overuttrykk Bcl-2-GFP, NRG behandling hadde ingen virkning på nivåene av autophagy induksjon. Videre Bcl-2-GFP overekspresjon LNCaP-celler var resistente mot NRG-indusert celledød i forhold til naive LNCaP-celler (Fig. 7C). Til sammen våre resultater tyder sterkt på at i tillegg til JNK-aktivering, Beclin en er også avgjørende for autophagic prosessen fremmet av NRG.
Diskusjoner
Prostata kreft vanligvis starter som androgen-sensitive lesjoner men ofte utvikle seg til androgen-insensitive lesjoner med progresjonen til avanserte stadier. Den LNCaP androgen-avhengige cellelinje uttrykker høye nivåer av ErbB-2 og erbB-3 sammenlignet med andre humane prostatacancerceller [28]. I tillegg har disse cellene ikke uttrykker NRG men de uttrykker TGF-α og EGF, som kan fungere som autokrine aktivatorer av EGFR [28]. Tidligere ble det vist at i LNCaP-celler dyrket uten androgen mimetiske, induserer NRG men ikke EGF celledød. Denne effekten av NRG på celledød er mediert av erbB-2 /ErbB-3 heterodimerer [29]. Det ble også vist at celledød indusert av NRG hemmes av PI3K-inhibitorer, noe som indikerer at NRG kan indusere autophagic celledød [29]. I den foreliggende undersøkelse har vi demonstrerer for første gang at NRG faktisk induserer autophagy i LNCaP-celler, ved hjelp av to analyser: immunoblot-analyse med anti-LC3 antistoffer og mikroskopisk analyse av LC3-GFP farging i LNCaP-celler. Denne effekten av NRG ble også inhibert av 3-MA. Imidlertid autophagy indusert av NRG er ufullstendig fordi ingen degradering av p62-protein følgende NRG behandling ble detektert. Dermed NRG aktivere ErbB2 /ErbB3 heterodimerer induserer ufullstendig autofagi og celledød i LNCaP celler.
reaktive oksygenforbindelser (ROS) ble innblandet i signalveier initiert av reseptor tyrosin kinaser, inkludert ErbB reseptorer [43], [ ,,,0],44]. Flere linje av bevis viser at reaktive oksygenarter (ROS) spiller en rolle i autophagy. Først ROS er nødvendig for sult-indusert autofagi, tilsynelatende på grunn av reguleringen av Atg4 aktivitet [32]. For det andre kan ROS seg indusere autofagi i visse cellelinjer [31], [45]. Våre resultater tyder på at NRG-indusert autofagi er følsom for ROS-nivåer, fordi i nærvær av den generelle antioksidant NAC, NRG-indusert autofagi og celledød ble hemmet.
Det ble tidligere vist at mTOR tjener som en negativ regulator av autofagi ved å undertrykke aktiviteten til Atg13 /Atg1 komplekse [46]. Således, vekstfaktorer og visse hormoner utøve sin anti-autophagic effekt ved å aktivere den klasse-I PI3K /Akt /mTOR sti [47]. På den annen side, pro-autophagic stimuli, slik som næringsstoffer sult og rapamycin behandling, føre til mTOR inaktivering etterfulgt av autophagy induksjon. Faktisk, hemming av mTOR av rapamycin indusert autofagi i LNCaP celler. På de samme cellene, våre resultater viser at NRG induserer mTOR aktivering som fremgår av fosforylering av S6K, og dens oppstrøms regulator Akt. I tillegg ble det tidligere vist at NRG induserer ErbB2 /ErbB3 heterodimerdannelse og klasse-I PI3K aktivering i LNCaP-celler [28]. Tatt sammen, viser det seg at NRG aktiverer en anti-autophagic signalveien, nemlig ErbB /klasse-I PI3K /Akt /mTOR reaksjonsvei og likevel fremmer autophagy induksjon i LNCaP-celler. NAC, som fullstendig blokkerer NRG-indusert autofagi, påvirket ikke fosforylering av verken Akt heller S6K. Derfor foreslår vi at NRG-indusert autofagi er uavhengig av mTOR-hemming.
NRG induserer aktivering av ulike signalveier. Det ble tidligere vist at i LNCaP celler, aktiverer NRG blant annet signalveier også MAP kinaser: Erk, p38, JNK og PI3K signalveier [28]. Vi forsøkte å følge signalveien som fører til NRG indusert autofagi og celledød. Våre resultater tyder på at JNK er involvert i NRG-indusert autofagi og celledød. Faktisk økende mengde bevis eksisterer om rollen JNK som en formidler av autofagi induksjon følgende ulike stimuli [48], [49], [50]. Etter avtale med disse funnene, viste vi at JNK fosforylering øker etter NRG behandling i LNCaP celler. Vi har også funnet at NAC, en inhibitor for NRG-indusert autofagi og celledød, blokker JNK fosforylering. Tatt sammen, foreslår vi at JNK formidler pro-autophagic effekten av NRG. Faktisk, i nærvær av JNK inhibitor SP600125, NRG-indusert celledød og autofagi ble inhibert.
kimdannelse og montering av autophagosome krever aktivering av klasse-III-PI3K-komplekset, som er sammensatt av PI3K (vps34 ), vps15, atg14 og atg6 (Beclin 1 i pattedyrceller) [19], [20]. Beclin 1-mediert autofagi er negativt regulert av sin interaksjon med BCL-2 anti apoptotiske proteiner.
