Abstract
FBP1, fruktose-1,6-bisfosfatase-en, en glukoneogenesen regulatorisk enzym katalyserer hydrolyse av fruktose 1, 6-bisfosfat til fruktose-6-fosfat og uorganisk fosfat. Mekanismen at den fungerer til å motvirke glykolyse og ble epigenetiske inaktivert gjennom NF-kappaB veien i magekreft har blitt rapportert. Men fortsatt sin rolle i leveren kreft fortsatt ukjent. Her, undersøkte vi uttrykket og DNA-metylering av FBP1 i primær HCC og tykktarm tumor. FBP1 ble ydmyk uttrykt i 80% (8/10) human leverkreft, 66,7% (6/9) leverkreft cellelinjer og 100% (6/6) tykktarmskreft cellelinjer, men var høyere i sammenkoblede tilstøtende ikke-tumorvev og udødelig normale cellelinjer, som var godt korrelert med sin promoter metylering status. Metylering ble videre påvist i primær HCCs, mage og tykktarm tumorvev, men ingen eller sporadisk i sammenkoblede tilstøtende ikke-tumorvev. Detaljert metylering analyse av 29 CpG sider på et 327-bp promoter-regionen med sulfitt genomisk sekvense bekreftet sin metylering. FBP1 lyddemping kan bli reversert ved kjemisk demetylering behandling med 5-aza-2′-deoxycytidine (AZA), noe som indikerer direkte epigenetisk lyddemping. Gjenopprette FBP1 uttrykk i lave uttrykt celler betydelig hemmet cellevekst og kolonidannelse evne gjennom induksjon av G2-M fasen cellesyklus arrest. Videre er de observerte effektene falt sammen med en økning av reaktive oksygenarter (ROS) generasjon. Oppsummert er også vanlig i human lever og tykktarm kreft epigenetisk inaktivering av FBP1. FBP1 synes å være en funksjonell tumor suppressor involvert i leveren og kolon kreft
Citation. Chen M, Zhang J, Li N, Qian Z, Zhu M, Li Q, et al. (2011) Arrangøren Hypermethylation mediert nedregulering av FBP1 i Human leverkreft og tykktarmskreft. PLoS ONE 6 (10): e25564. doi: 10,1371 /journal.pone.0025564
Redaktør: Xin Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kina
mottatt: 13 juni 2011; Godkjent: 05.09.2011; Publisert: 19 oktober 2011
Copyright: © 2011 Chen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Major Science and Technology spesielt prosjekt i Kina Eleventh Five-Year Plan (No. 2008ZX1002-004), den kinesiske staten Basic Research Foundation Grant (2007CB512904), Shanghai Sci og Tech Research program (08JC1403900), og programmet for fremragende medisinsk faglig leder av Shanghai (08GWD19). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
leverkreft (HCC) er fortsatt den tredje største årsaken til kreftdød på verdensbasis, og den nest vanligste kreftformen hos Kina. Den molekylære patogenesen av HCC fortsatt i stor grad ukjent. Det har vært en teori om at utvikling og progresjon av HCC er konsekvensen av kumulative genetiske og epigenetiske hendelser. CpG hypermethylation fungerer som en alternativ mekanisme for å genet inaktivering, og det er nå anerkjent som en viktig mekanisme i startfasen og progresjon, inkludert leverkreft [1], [2]. Det er viktig og spennende å identifisere nye gener forstummet av arrangøren hypermethylation leverkreft fordi avvikende tumor suppressor gen (TSG) hypermethylation er både en mekanisme og en biomarkør for tumorigenesis [3].
FBP1, fruktose-1, 6-bisfosfatase-1, en glukoneogenese regulatorisk enzym katalyserer hydrolysen av fruktose 1,6-bisfosfat til fruktose-6-fosfat og uorganisk fosfat. Fruktose-1,6-diphosphatase Mangel er forbundet med hypoglykemi og metabolsk acidose. Det ble rapportert [4] som FBP1 som virker til å antagonisere glykolyse ble nedregulert ved NF-kappaB bane i Ras-transformerte NIH3T3-celler. NF-kappaB funksjoner nedstrøms av Ras å fremme epigenetisk nedregulering av FBP1. Hemming av NF-kappaB reverseres promoter metylering-mediert FBP1 downregulation. Videre arrangøren metylering av FBP1 var relevant for magekreftutvikling, for eksempel, ble kjønn, TNM scener og overlevelse signifikant assosiert med FBP1 promoter metylering. Dessuten ble det undersøkt [5] som FBP1 promoter metylering bidrar til redusert ekspresjon av FBPase i brystkreft. Når ikke-maligne og maligne vevsprøver fra samme pasient ble sammenlignet en sammenheng mellom økning av FBPase-promoteren metylering og en reduksjon av FBPase mRNA-nivåer ble observert. Imidlertid er ingen funn vist for FBP1 epigenetisk inaktivering i leveren kreftutvikling.
reaktive oksygenforbindelser (ROS), kjemisk reaktive molekyler som inneholder oksygen, inkludert oksygen ioner og peroksider, er de viktigste formidlere av mobilnettet oksidativt stress og Redox feilregulering involvert i kreft initiering og progresjon. Det er nå bredt akseptert at konstitutivt forhøyede nivåer av celle oksidativt stress og avhengighet av mitogen og anti-apoptotiske ROS-signalering i kreftceller er involvert i kreftutvikling. Paradoksalt nok, bortsett fra å bli involvert i proliferative, anti-apoptotisk, metastatisk, og angiogene signalering, ROS kan også utøve cytotoksiske og proapoptotiske funksjoner som ville begrense tumorigenicity og ondartet progresjon [6], [7]. FBP1 er et multifunksjonelt protein som er, i tillegg til sin funksjon i glukoneogenese, som er involvert i ROS-produksjon etter behandling med MMS eller i kronologisk alderen celler [8]. I fravær av FBP1 celler overlever MMS behandling bedre og enda sprer etter langtidsbehandling. Dette kan være et resultat av redusert produksjon av ROS observert i ΔFBP1 mutant som reaksjon på alkyleringsmidlet methylmethane sulfonat (MMS) behandling og aldring. Mangel på FBP1 forbedret overlevende av alderen celler i sin helhet medium og resulterte i en forsinket induksjon av ROS produksjon. Overekspresjon av FBP1 redusert evne til å danne kolonier og med ubehandlede kulturer, kortere levetid og øket induksjonen av RNR2 promoteren etter MMS behandling.
Her viste vi at FBP1 gikk promoter CpG hypermethylation-assosiert stanse i human leveren og tykktarmskreft. Analysen av lever og tykktarm kreft cellelinjer og vev viste at FBP1 hypermethylation var en vanlig hendelse i human lever og tykktarmskreft. Vi har også vist at FBP1 fungerer som en TSG for å undertrykke kreftcellevekst gjennom induksjon av G2-M-fase cellesyklus-stans og en økning i ROS-generasjonsnivåer. Epigenetiske forandringer i mobilnettet redoks homeostase og ROS-nivåer vil påvirke levedyktigheten gjennom Redox modulering av mitokondriell permeabilitet overgangen pore åpning fører til cytokrom C utgivelsen, apoptosome montering og aktivering av bøddelens caspases, som er støttende for ROS-rettet kreft kjemoterapeutika.
Materialer og metoder
Cancer Cell Lines, Primær tumorvev og RNA /DNA Extraction
Ni humane leverkreft cellelinjer (HepG2, Hep3B, Huh7, HCC-LM3, BEL-7402, SMMC-7721, ble Sk-Hep1, mhcc-97h og mhcc-97L) som brukes for HCCs analyse. En udødeliggjort normale humane levercellelinjer L02 ble brukt som «normale» kontroller for HCCs analyse. Seks menneskelige tykktarmskreft cellelinjer (HT29, SW480, SW620, HCT116, LoVo og RKO) ble brukt for tykktarmskreft analyse og humane normale voksen kolon vev ble brukt som «normale» kontroller. Alle cellelinjer ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, Va., USA). Mindre dette er spesielt angitt, ble cellene dyrket i DMEM-medium (Invitrogen, Carlsbad, Calif., USA) supplert med 10% føtalt bovint serum ved 37 ° C med 5% CO
2 og 95% fuktighet. For farmakologiske demetylering, ble cellene behandlet med 5 uM 5-aza-2′-deoksycytidin (Aza) (Sigma, St. Louis, Mo., USA) i 3 påfølgende dager. Kulturmediet ble byttet hver 24. time. En ekvivalent konsentrasjon av bærer (DMSO) ble anvendt som kontroll
Primære HCCs ble oppnådd fra leverkreftpasienter i Huashan Hospital ved tidspunktet for kirurgi.; matchet ikke-tumorprøver fra leverkreftpasienter ble også erholdt på minst 2 cm fjernt fra svulsten. Ikke-tumor porsjonene ble trimmet bort fra de frosne tumorvev, og de selekterte tumorområdene hadde mer enn 80% tumorceller som bekreftet ved histologi. Menneskelig mage, tykktarm tumorvev og normale voksne kolon vev ble levert av kinesisk medisin Hospital of Zhejiang. Alle pasienter ga informert samtykke for å få studie prøver.
Total RNA og genomisk DNA ble ekstrahert ved Trizol reagens (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. Totalt RNA og DNA-konsentrasjoner ble kvantifisert ved Nanodrop 1000 (Nanodrop, Wilmington, Del., USA).
Real-Time RT-PCR
En omvendt transkripsjon reaksjonen ble utført ved hjelp av en ug av total RNA med høy kapasitet cDNA Reverse Transcription kit (Applied Biosystems, Foster City, California., USA). De mRNA uttrykk nivåer av FBP1 ble bestemt av Real-Time RT-PCR bruker SYBR Grønn Master Mix Kit og ABI 7500 Real-Time RT-PCR System (Applied Biosystems, Foster City, California., USA). Glyseraldehyd-3- fosfat-dehydrogenase (GAPDH) ble anvendt som en intern kontroll RNA integritet. Real-Time RT-PCR ble utført i tre eksemplarer. Primerne anvendt for FBP1 var:. FBP1-F 5′-ATCCCCTTGATGGATCTTCC-3 «og FBP1-R 5′-TCCAGCATGAAGCAGTTGAC-3» (208 bp produkt)
Bisulfite Behandling av DNA og Metylering-spesifikke PCR
Genomisk DNA ble bisulfitt-behandlet med Zymo DNA Modifikasjon Kit (Zymo Research, Orange, Calif., USA) i henhold til protokollen gitt. Metylering-spesifikk PCR (MSP) ble utført i 40 sykluser med glødetemperaturen ved 60 ° C. Metylering-spesifikke primere var: FBP1-MF 5′-TGAAGATTTAAGTAGGCGGAGTC-3 «og FBP1-MR 5′-ATAAACACTAACCG CAAATACGAA-3′, og unmethylation-spesifikke primere var: FBP1-UF 5»-GAAGATTTAAGTA GGTGGA GTTGTG-3 «og FBP1 -UR 5»-CTAACAAAAAAACTAACAAACCAAC-3 «
bisulfite genomisk sekvense
bisulfite behandlet genomisk DNA ble forsterket ved hjelp av sulfitt genomisk sekvense (BGS) primere, FBP1-BF. 5′-TGATTTTGGAGGAAATAGTTATAGTTTTT- 3 «og FBP1-BR: 5′-TAATACAACTAAACCAAACCAAAC-3». PCR-produktene ble renset med Illustra GFX ™ PCR og gel bandet rensing kit (GE Healthcare Life Science, Uppsala, Sverige) og klonet inn pCR4-TOPO vektor for sekvensering (Invitrogen). Minst fire kolonier ble tilfeldig valgt for plasmid utvinning og sekvensering analyse ved hjelp av ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit i ABI 3100 sequencer (Applied Biosystems).
Bygging av FBP1 Uttrykke Vector
FBP1 uttrykke vektoren ble konstruert ved kloning av full-lengde FBP1 åpen leseramme inn i pattedyr-ekspresjonsvektor pcDNA3.1. The full-lengde FBP1 åpen leseramme ble forsterket fra normale mage cDNA ved hjelp av høy-fidelity PFU DNA polymerase (Invitrogen). Primere som brukes for kloning var FBP1-CF: 5′-CGGAATTCCGATGGCTGACCAGGCGCCCTTCGA-3 «og FBP1-CR: 5′-GCAAGCTTCCTGGGCAGAGTGCTTCTCATACACC-3» accomp- anied med dobbel enzym skjæresider EcoRI og Hind III. Sekvensen og orientering av innsatsen ble bekreftet ved DNA-sekvensering.
kolonidannelse analysen
Menneske lever kreftceller transient transfektert med pcDNA3.1 tom vektor eller pcDNA-FBP1 uttrykke vektoren ble brukt til monolag kolonidannelse analyse for å vurdere cellevekst in vitro. Cellene ble dyrket over natten i en 12-brønns plate (5 × 10
5 celler /brønn) og transfektert med pcDNA3.1 tom vektor eller pcDNA-FBP1 uttrykke vektoren ved hjelp Fugene 6 (Roche Applied Science, Mannheim, Tyskland). Førtiåtte timer senere ble transfektanter platet i triplikat og dyrket i 10~15 dager i fullstendig DMEM medium inneholdende G418 (400 ug /ml). Overlevende kolonier ble farget med Gentian Violet etter metanol fiksering og synlige kolonier (≥ 50 celler) ble talt opp. Eksperimentene ble gjentatt tre ganger.
Cell Growth Assay
Celler vekst ble bestemt ved en ikke-radioaktiv proliferasjonsanalyse basert på evnen av metabolsk aktive celler til å omdanne 3- (4,5- dimetyltiazol-2-yl) -5 (3-carboxymethonyphenol) -2 – (4-sulfofenyl) -2H-tetrazolium (MTS) (Promega, Madison, WI, USA) til formazan. Overlevende celler etter G418-seleksjon ble utsådd i en 96-brønns plate med forskjellig celleantall og dyrket i fullstendig DMEM medium inneholdende G418 (400 ug /ml) i ytterligere 72 timer. Mengden av formazan ble målt som ovenfor. Mengden av formazanforbindelsen ble målt ved 490 nm absorbans etter en times inkubasjon med CellTiter 96 vandige løsning Reagens følge instruksjonene.
Cell Cycle Analysis og Bestemmelse av ROS Produksjon
Surviving celler etter G418 utvalg ble trypsinert, vasket i fosfatbufret saltvann og fiksert i iskald 70% etanol-fosfat-bufret saltløsning. Etter vasking med etanol, ble de fikserte cellene behandlet med 0,01% RNase (10 mg /ml, Sigma, St. Louis, MO, USA) i 10 minutter ved 37 ° C og deretter farget med 0,05% propidiumjodid i 20 minutter ved 4 ° C i mørket. Cellesyklus distribusjon ble bestemt ved hjelp av en FACScan flowcytometri (Becton Dickinson, Mountain View, CA, USA) og analysert med Modfit programvare (Phoenix, San Diego, CA, USA). Celler som gjennomgår apoptose ble oppdaget som sub-G1 befolkningen på grunn av tap av fragmentert DNA.
ROS-nivåene ble målt ved hjelp av 2′-7 «-Dichlorodihydrofluorescein diacetat (DCFH-DA) (Invitrogen) i en flowcytometri analyse som beskrevet [9].
Statistisk Analyse
resultatene ble uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik (SD). Student
t
test ble brukt for å sammenligne forskjellene i FBP1 uttrykk på effekten av kolonidannelse og celledeling. Alle statistiske beregninger ble gjort ved hjelp av SPSS versjon 11.0 for Windows (SPSS, Inc., Chicago, IL). Verdien av
P
. 0,05 ble tatt som statistisk signifikans
Resultater
nedregulering av FBP1 i Human lever og andre fordøyelses Kreft
uttrykk for FBP1 ble dramatisk nedregulert i 66,7% (6/9) humane lever kreft cellelinjer inkludert HepG2, BEL-7402, SMMC-7721, Sk-Hep1, mhcc-97h og mhcc-97L (figur 1A) sammenlignet med humane normale leverceller lo2. Tilsvarende downregualtion av FBP1 ble også funnet i 100% (6/6) humane tykktarmkreft cellelinjer inkludert HT29, SW480, SW620, HCT116, LoVo og RKO (figur 1A) sammenlignet med humant normalt voksent kolon vev. For å vite om nedregulering av FBP1 bør tilskrives DNA metylering, uttrykk for FBP1 i human lever og tykktarm kreft cellelinjer før og etter Aza behandling ble bestemt av Real-Time RT-PCR. Uttrykket av FBP1 var signifikant oppregulert i lever kreft cellelinjer HepG2, BEL-7402, SMMC-7721, Sk-Hep1, mhcc-97h og mhcc-97L (6/9, 66,7%) etter Aza behandling (Figur 1b) og også i tykktarm kreft cellelinjer HT29, SW620, LoVo og RKO (4/6, 66,7%) (figur 1B), noe som indikerer at FBP1 er sannsynlig downregulated gjennom arrangøren hypermethylation i human lever og tykktarmskreft.
(A) FBP1 uttrykk i menneskelige leveren og tykktarmskreft cellelinjer og normale kontroller ble bestemt av real-Time RT-PCR. GAPDH ble anvendt for å normalisere mal mengde. (B) Relativ FBP1 uttrykk før og etter Aza behandling ble bestemt av Real-Time RT-PCR. GAPDH ble anvendt for å normalisere mal mengde. Den ble vist som gjennomsnittlig fold endringer ± SD.
metylering av FBP1 arrangøren i Human Liver og tykktarm kreft
faktisk en typisk CpG Øyene (CGI) ble funnet rundt FBP1 exon 1 bruker følgende kriterier: GC innhold 55%, Obs CpG /Exp CpG 0,65 og lengde 500 bp (Figur 2A). Metylering status for dette CGI i humane lever og tykktarm kreft celler ble bestemt av MSP. Som vist i figur 2B, ble metylering av FBP1 promoter lett oppdages i leverkreft cellelinjer HepG2, HuH7, HCC-LM3, BEL-7402, SMMC-7721, Sk-Hep1, mhcc-97h og mhcc-97L, og menneskelige tykktarmskreft cellelinjer HT29, SW480, SW620, HCT116, LoVo og RKO. Dessuten BGS også avdekket at FBP1 arrangøren var tungt denaturert i HepG2, Huh7, BEL-7402 celler og 8T svulstvev, og ingen metylering ble dedtected i 8N tilstøtende ikke-svulstvev (figur 2C).
(A ) Skjematisk struktur av FBP1 CGI, med ekson 1 og MSP og BGS region indikert. Hvert kort vertikal linje representerer en CpG nettstedet. Posisjonen til MSP primere ble merket som piler. Metyleringen status for FBP1 CGI ble analysert ved hjelp av MSP (B) og BGS (C). MSP = Metylering spesifikke PCR; USP = Unmethylation spesifikke PCR. For BGS i (C), indikerer hver sirkel en CpG stedet og sirkler fylt i svart representerer metylert CpG nettsteder. En rad med sirkler representerer en enkelt koloni.
Nedregulering og arrangøren Hypermethylation av FBP1 i Human Primary tumorvev
For ytterligere å bekrefte relevansen av FBP1 promoter CGI hypermethylation i formidling sin stanse i human lever, mage og tykktarm kreft, FBP1 uttrykk og formidler metylering i primær leverkreft, mage og tykktarm tumorvev og tilstøtende ikke-tumorvev ble analysert ved real-Time RT-PCR og MSP, henholdsvis. FBP1 ekspresjon ble betydelig nedregulert i 80% (8/10) humane levertumorvevet, 100% (5/5) i mage og 80% (4/5) colon tumor-vev (figur 3A) når sammenlignet med tilstøtende ikke-tumorvev . I tillegg ble promotor metylering ofte påvist ved hjelp av MSP i tumorprøver, men ikke ikke-tumorvev (figur 3B), noe som indikerer at nedregulering av FBP1 var involvert i kreftutvikling av human lever og andre fordøyelseskreftformer.
( A) uttrykket av FBP1 i lever, mage og tykktarm tumorvev og tilstøtende ikke-tumorvev ble bestemt av real-Time RT-PCR. 1~10 T /N: leverkreft, 11-15 T /N: magekreft, 16~20 T /N: tykktarmskreft. (B) Den metylering status for FBP1 promoter i primær lever ble mage og tykktarm tumorvev og tilstøtende ikke-tumorvev oppdaget av MSP. Representative resultater ble vist. 1~3 T /N: leverkreft, 4~5 T /N: tykktarmskreft, 6~9 T /N: magekreft. «T» indikerer tumorvev og «N» representerer tilstøtende non-tumorvev.
FBP1 Overuttrykte Redusert Cancer Cell kolonidannelse Evner og hemmet veksten av leveren og kolon kreft celler
effekten av eksogent FBP1 ekspresjon på veksten av humane leverkreftceller ble undersøkt ved et monolag kolonidannelse assay. For ytterligere å undersøke den potensielle rolle FBP1 i tumor undertrykkelse, ble leverkreftceller SMMC-7721 og tykktarmskreft SW480 transfektert med pcDNA-FBP1 uttrykke vektoren og cellekolonidannelse evne ble undersøkt under valg av G418. Sammenlignet med kontroll-celler transfektert med tom vektor pcDNA3.1, kreftceller transfektert med pcDNA-FBP1 uttrykkende vektor viste redusert kolonidannelse evne (figur 4B). Disse data antyder at FBP1 kan spille en rolle i tumor suppresjon. Dessuten FBP1 stabil uttrykk nivåer i disse celler, inkludert SW480 og SMMC-7721 ble også bekreftet av Real-Time RT-PCR, som vist i figur 4A.
(A) FBP1 ekspresjonsnivået i den transfekterte SW480 og SMMC- 7721 celler ble bekreftet av real-Time RT-PCR. (B) Effekten av ektopisk FBP1 uttrykk på leverkreft cellevekst ble undersøkt av monokolonidannelse analysen. Den skannede kolonidannelse i seks-brønns plater ble vist i panelet .. (C) Veksten av leveren og tykktarmskreft cellelinjer (SW480 og SMMC-7721) med og uten FBP1 ekspresjon ble bestemt med MTS cellevekstanalyse. Stabil uttrykk for FBP1 undertrykte veksten av lever og tykktarm kreft celler. Resultatene er vist som verdier for middelverdi ± SD. P-verdier ble beregnet ved hjelp av t-test (* p 0,05).
Når pcDNA-FBP1 ble transfektert inn SW480 og SMMC-7721 celler, veksten hemmende funksjon FBP1 i disse cellene ble bekreftet av MTS cellevekst analysen. PcDNA-FBP1 uttrykkende vektor ble transfektert inn i disse cellene ble veksthastigheten av humane lever og tykktarmskreftceller etter FBP1 overekspresjon dramatisk redusert i MTT-cellevekstanalyse (p 0,05, figur 4C), som viser en vekst-suppressive virkning av FBP1 videre kreftceller.
Ektopisk Expression of FBP1 Induced G2-M fase Arrest
for å finne ut av den molekylære mekanismen som FBP1 trykt kolonidannelse og celleproliferasjon, undersøkte vi effekten av FBP1 på cellesyklus distribusjon . Etter propidiumjodidfarging, fluorescens-aktivert cellesorteringsanalyse av FBP1 overuttrykt SW480 og SMMC-7721-celler viste en økning i antallet av G2-M-faseceller og nedgang i antall S-faseceller (figur 5A og 5B).
cellesyklusfordelingen av lever og tykktarmskreft cellelinje (SW480 og SMMC-7721) med og uten FBP1 ekspresjon ble evaluert ved flow cytometri-analyse. (A) og (B) Representant fluorescens-aktivert celle sortering analyse av kreftceller transfektert med eller uten FBP1.
FBP1 Overuttrykte Økt Intracellulær ROS Produksjon
ROS-nivåene ble målt i kreftceller utransfekterte og transfektert med pcDNA-FBP1 uttrykke vektoren. Eksogene FBP1 uttrykk klart økte intracellulære ROS-nivåer i SMMC-7721 og SW480 celler (Figur 6A og 6B). Derfor FBP1 kunne øke produksjonen ROS som utøver cytotoksiske og proapoptotiske funksjoner og begrense tumorigenisitet og ondartet progresjon.
Virkningen av ektopisk ekspresjon FBP1 på oksidativt stress ble bestemt ved strømningscytometri-analyse som vist i (A) og (B ). Stabile-celler ble farget med DCFH-DA og deretter redoks-tilstanden til cellene ble målt ved flow-cytometri.
diskusjon
Flere og flere nye tumorsuppressorgener er blitt funnet å være inaktivert av arrangøren hypermethylation. Promoter metylering ble således foreslått som en viktig markør for identifisering av nye tumorsuppressorgener. I denne studien identifiserte vi at FBP1 ble ofte nedregulert i 66,7% HCC cellelinjer og 100% tykktarmskreft cellelinjer (figur 1A), og i 80% primær HCCs, 100% mage svulster og 80% colontumorer (Figur 3A). Hypermethylation ble videre påvist i 66,7% HCC cellelinjer og 100% tykktarmskreftcellelinjer (figur 2B), og også i primære tumorvev (figur 3B). I motsetning til dette ble FBP1 hypermethylation nesten ikke detektert i normale levercellelinjer og av og til i sammenkoblet tilstøtende ikke-tumorvev, noe som antyder en viktig rolle for FBP1 i patogenesen av leveren og andre fordøyelseskreftformer. Vi videre vist at behandling med demetylering reagent Aza oppregulert FBP1 uttrykk i ydmyk uttrykt kreftceller (figur 1B) og metylering status ble bekreftet av genomisk sekvensering, noe som indikerer at DNA hypermethylation mediert FBP1 inaktivering.
I kreft, dynamikken i genetisk og epigenetisk genet Slå er svært forskjellige. Somatisk genetisk mutasjon fører til en blokk i produksjonen av funksjonelt protein fra det mutante allelet. Hvis en selektiv fordel er overdratt til cellen, cellene ekspandere klonalt for å gi opphav til en svulst hvor alle cellene mangler evnen til å produsere proteinet. I motsetning til dette forekommer epigenetiske mediert genet Slå gradvis. Det begynner med en subtil reduksjon i transkripsjon, fremme en reduksjon i beskyttelsen av CpG øy fra spredning av flankerende heterochromatin og metylering i øya. Dette tapet resulterer i gradvis økning av individuelle CpG nettsteder, som varierer mellom kopier av det samme genet i forskjellige celler. For eksempel ble det høyere nivå av FBP1 påvist i Huh7 og HCC-LM3 celler med høy metylering nivå i promoter-regionen (figur 1A og 2B). Selv om arrangøren metylering ofte inaktivert FBP1 i menneskelige leveren og tykktarmskreft cellelinjer, kan vi ikke utelukke involvering av andre mekanismer ansvarlig for FBP1 downregulation, for eksempel feil i histone ombygging. For eksempel, i Hep3B, Huh7, HCC-LM3, SW480 og HCT116 cellene, FBP1 arrangøren ikke klarte å være fullt oppregulert etter Aza behandling (figur 1B).
I tillegg til å fungere som en ny markør for å definere roman tumorsuppressorgener, kan promoter hypermethylation også brukes som en markør følsom for kreftdiagnostikk og prognose forutsigelse [10], [11]. Dessverre, i mangel av et stort antall tumorvev, vi kunne ikke teste FBP1 metylering i rikelig vev og videre analysere sin tilknytning til kliniske egenskaper, for eksempel alder, kjønn, tumor klasse og overlevelse. Vi måtte bestemme FBP1 uttrykk og metylering status i bare 10 par av primær HCCs, 5 par mage tumorvev og 5 par kolon tumorvev (figur 3), noe som tyder på at FBP1 fungerer som en roman tumor suppressor kandidat downregulated gjennom promoter hypermethylation i leveren og tykktarmskreft. Dette er også den første rapporten som viser at FBP1 er epigenetiske forstummet i human lever og tykktarm kreftutvikling. Når FBP1 promoter metylering ble detektert ved en høy frekvens i primær carcinoma vev, men ikke ikke-tumor normal gastrisk vev, kan FBP1 promoter metylering være en potensiell biomarkør for kreftdiagnostikk.
Som vist i figur 4, restaurering av FBP1 uttrykk markert trykkes kreftceller vekst. Men den underliggende molekylære mekanismen ansvarlig for FBP1 fungerer som en tumor suppressor fortsatt ukjent. Det har blitt verifisert [4] som FBP1 funksjoner for å motvirke glykolyse. Slik det er velkjent, kreftcellene har et høyere rate av aerob glykolyse, men ikke oksidativ fosforylering. Fruktose-1,6-bisfosfat er en av de viktigste mellomprodukter i glykolysen, og dens nivå er i hovedsak kontrollert av fruktose-6-fosfat-kinase og fruktose-bisfosfatase-1,6-. Det ble funnet at produksjonen av laktat etter FBP1 ekspresjon ble betydelig redusert, noe som viser undertrykkelse av aerob glykolyse ved FBP1. Dessuten, cellesyklus sjekkpunkter er viktige kontrollmekanismer som sikrer forsvarlig gjennomføring av celle syklus hendelser. Den veksthemming indusert ved ektopisk FBP1 ekspresjon synes å være forårsaket av cellesyklus-stans ettersom antallet av celler med cellesyklus blokkering (G2-M fase rest) ble øket etter FBP1 re-ekspresjon (figur 5).
i lang tid, ble ROS ansett onkogen siden det ble innblandet i kreft progresjon og metastasering. Vedvarende oksidativt stress har blitt assosiert med brystcancer og mange epiteliale kreftformer som tykktarm og nakkekreft [12]. Imidlertid har en rekke studier vist den utløsende involvering av ROS-formasjonen i formidling av kreft celle apoptose indusert av ulike standard kjemoterapi inkludert paclitaxel, cisplatin, bortezomib og etoposid. Bemerkelsesverdig er det blitt demonstrert at cisplatin apoptogenicity er avhengig av dannelsen av ROS og forekommer uavhengig av nukleært DNA-skade, hvilket antyder at apoptogenic oksidativt stress er det avgjørende mekanisme av cisplatin-indusert kreft celledød [13]. I tillegg til å forårsake cellesyklus-stans i S-fasen, viktigst i denne studien, kan den veksthemmende virkning av FBP1 som en tumor suppressor også bli formidlet gjennom å øke produksjonen av intracellulær ROS (figur 6). Våre funn var i overensstemmelse med tidligere publiserte data [8] som viser fruktose-1,6-bisfosfatase formidler mellom cellulære responser til DNA-skade og aldring i Saccharomyces cerevisiae. Men hvordan ROS utøve cytotoksiske og proapoptotiske funksjoner som ville begrense tumorigenicity og ondartet progresjon, ble det foreslått at endringer i cellulære redoks homeostase og ROS-nivåer vil påvirke levedyktigheten gjennom Redox modulering av mitokondriell permeabilitet overgangen pore åpning fører til cytokrom C utgivelse, apoptosome montering, og aktivering av bøddelens caspases, hvis mobilnettet ROS-nivåene når en viss terskel uforenlig med mobilnettet overlevelse [7], [14].
i sammendraget, fant vi at FBP1 ofte redusert med arrangøren hypermethylation i de fleste lever og tykktarm kreft cellelinjer og primære tumorvev. Våre resultater antydet at epigenetisk inaktivering av FBP1 var en viktig faktor i menneskets lever og tykktarm kreftutvikling. Vi demonstrerte også at promoter hypermethylation-mediert stanse av FBP1 kan bli reversert ved farmakologisk demetylering og restaurering av FBP1 undertrykket tumorcellevekst ved å indusere G2-M-fase cellesyklus-stans og en økning i ROS generasjon. Derfor vil det være verdifullt å utforske mulig anvendelse av FBP1 som en molekylær markør for påvisning og behandling av disse kreftformer.
Takk
Vi takker Mr. Wang Cheng for nyttig diskusjon og teknisk assistanse. Vi takker også Mr. Jiang Jiukun for å gi mhcc-97h og mhcc-97L HCC cellelinjer og Dr. Chen Qian for å gi menneskelige mage og tykktarm kreft vev.
