Abstract
Eggstokkreft er en av de viktigste årsakene til kvinnelig død og utvikling av nye terapeutiske tilnærminger er påtrengende nødvendig. Nukleær faktor-kB (NF-kB) blir konstitutivt aktivert i flere typer kreft, inkludert eggstokkreft, og er kjent for å understøtte overlevelsen av kreftceller. Men molekylære mekanismer for vedvarende aktivering av NF-kB i eggstokkreft fortsatt i stor grad ukjent. Vi rapporterer her at i tillegg til den tidligere rapporterte kanoniske aktivering, er NF-kB aktivert gjennom noncanonical reaksjonsveien i eggstokkreft celler. RNA interferens-mediert stanse av NF-kB induserende kinase (NIK), en sentral regulator av noncanonical vei, redusert NF-κB2 /P52 DNA-bindende aktivitet og NF-kB-avhengige reportergenekspresjon i tillegg til NF-kB målgenet uttrykk. Spesielt, ble forankringsavhengig og-uavhengig cellevekst svekket i NIK-utarmet celler. Nedbryting av NIK også undertrykte tumordannelse i naken mus xenograft analysen. Disse resultatene indikerer at NIK spiller en nøkkelrolle i konstituerende NF-kB aktivering og progresjon av eggstokkreft celler og foreslår at NIK representerer en attraktiv terapeutisk mål for eggstokkreft
Citation. Uno M, Saitoh Y, Mochida K, Tsuruyama E, Kiyono T, Imoto jeg, et al. (2014) NF-kB Inducing kinase, en Sentral signale komponent av Non-Canonical Pathway av NF-kB, Bidrar til Ovarian Cancer Progresjon. PLoS ONE 9 (2): e88347. doi: 10,1371 /journal.pone.0088347
Redaktør: Javier S. Castresana, Universitetet i Navarra, Spania
mottatt: 30 august 2013; Godkjent: 12 januar 2014; Publisert: 12 februar 2014
Copyright: © 2014 Uno et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av et stipend-i-aid for vitenskapelig forskning på innovative områder fra departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi fra Japan til S.Yamaoka (22117004). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ovarialcancer er en av de mest dødelige gynekologiske kreftformer og dens overlevelse er mye lavere enn andre kreftformer som rammer kvinner. Siden eggstokkreft i utgangspunktet viser subtile og uspesifikke symptomer, de fleste av pasientene stede med avansert sykdom, slik at aggressiv kirurgisk behandling i kombinasjon med cellegift forblir standard vare. Selv om fremskritt i kjemoterapi bedret overlevelse av eggstokkreft kreftpasienter, de ofte ikke svare på innledende kjemoterapi eller tilbakefall etter å ha oppnådd en positiv respons [1]. Derfor er nye terapeutiske tilnærminger presserende behov for å oppnå bedre behandlingsresultat.
NF-kB er en transkripsjonsfaktor involvert i forskjellige biologiske prosesser slik som immunrespons, betennelse, kreft og celledød [2]. I pattedyrceller, er NF-kB sammensatt av homo- og heterodimerer av fem medlemmer, NF-κB1 (p50 og dens forløper P105), NF-κB2 (P52 og dens forløper p100), Rela (p65), relB og c-Rel . I hvilende celler, blir aktiviteten av NF-kB strengt regulert av dets interaksjon med hemmende IkB proteiner. Forløperproteinet p105 gjennomgår konstitutiv behandling av den cellulære proteasom som eliminerer IkB-lignende C-terminale område for å generere p50. I motsetning til dette, krever P52 produksjon IKB-kinase (IKK) -indusert fosforylering og proteasom-mediert behandling av P100. NF-kB signalering medieres av to veier som kalles de kanoniske og noncanonical veier. Aktivering av den kanoniske reaksjonsveien er hovedsakelig utløses av cytokin stimuli slik som tumornekrosefaktor-α (TNF-alfa) og interleukin-1β, etterfulgt av aktivering av IKK-komplekset, som består av to proteinkinaser IKKα og IKKβ og et regulatorisk protein NF-kB viktig modulator (NEMO også kalt IKKγ). Aktivert ikk-indusert fosforylering av IκBα fører til sin polyubiquitination og proteasomal nedbrytning, etterfulgt av translokasjon av den p50-rela heterodimer til kjernen og induksjon av mål-genekspresjon. Den noncanonical NF-kB-veien aktiveres gjennom bestemte TNF-reseptor familiemedlemmer, slik som B-celle-aktiverende faktor (BAFF) reseptoren, CD40 og lymfotoksin-beta-reseptor som bindes til TNF-reseptor-assosiert faktor (TRAF) 2 eller TRAF3. Noncanonical NF-kB-aktivering er blitt rapportert å stole på forhøyet ekspresjon av NF-kB-induserende kinase (NIK), som oppnås på to måter, enten ved svekking av K48 polyubiquitination av NIK eller ved forsterket mRNA-ekspresjon. I ikke-stimulerte celler, koblinger TRAF3 NIK til en multi-underenheten E3 ubiquitin ligase kompleks sammensatt av TRAF2 og cellulær inhibitor av apoptose 1 og 2 (cIAP1 og cIAP2), som fører til K48 polyubiquitination og proteasomal nedbrytning av NIK, og dermed opprettholde NIK ekspresjon på et lavt nivå. I respons til stimulering med cytokiner slik som BAFF eller CD40-ligand, er TRAF3 rekruttert til reseptoren og gjennomgår ubiquitinering-mediert proteasomal degradering. Dette resulterer i stabilisering og akkumulering av nylig syntetisert NIK, mens disse stimuli ikke øke
NIK
mRNA nivå [3], [4]. I blodkreft kreftceller som multippel myelom og voksen T-celle leukemi samt lunge kreftceller, enten stabilisering av NIK protein gjennom svekket negativ regulering av TRAF3 /TRAF2 /CIAP kompleks eller avvikende uttrykk for
NIK
mRNA er blitt rapportert [5], [6], [7], [8]. I alle fall, akkumulering av NIK resulterer i aktivering av IKK-komplekset, som i sin tur fosforylerer p100 som fører til behandling til P52 og nukleær translokasjon av P52 /relB heterodimeren. I motsetning til aktivering av den kanoniske vei, betyr noncanonical NF-kB-aktivering ikke kreve tilknytning av NEMO med den ikk-komplekset og er forholdsvis vedvarende [9].
Tidligere rapporter viste konstitutiv aktivering av NF-kB og dens bidrag til manifestasjonen av maligne fenotype i flere typer kreft. NF-kB aktivering resulterer i forhøyet ekspresjon av gener relatert til cellesyklusprogresjon, overlevelse og invasjon av kreftceller. For eksempel overekspresjon av cyklin D1, en viktig regulator av cellesyklusen, fremmer cancer celleproliferasjon, mens deregulert ekspresjon av B-celle-lymfom-xl beskytter kreftceller fra apoptose. I tillegg matrise metallopeptidase 9 (MMP-9) og vaskulær endotelial vekstfaktor fremmer tumorinvasjon og angiogenese [10]. Som for eggstokkreft, hemming av IKKβ aktivitet, enten ved et lite molekyl kinase inhibitor eller av RNAi-mediert genet Slå, ble rapportert å undertrykke proliferasjon og invasjon av ovarie cancer-cellelinjer [11]. Blokade av NF-kB signalering av uttrykk for en dominerende negativ form for IκBα endret tumorigenesis av eggstokkreft cellelinjer [12]. I tillegg ble akkumulering av kjernekraft RELA i ovarietumorer rapportert å assosiere med dårlig prognose [13]. Likevel har mekanismene bak vedvarende NF-kB aktivering i eggstokkreft celler forble i stor grad ukjent. Rattan et al. viste at ekspresjonen av transkripsjons elongeringsfaktor A-liknende 7, en suppressor av rela-avhengige gentranskripsjon, er ofte nedregulert i eggstokkreft celler [14]. Vi har nylig rapportert forhøyet ekspresjon av NIK og dens rolle i onkogene egenskaper av voksen T-celle leukemi og lungekreftceller, hvori
NIK
mRNA ble uttrykt abnormt [7], [8]. I denne studien, viser vi viktige roller for NIK i spredning
in vitro Hotell og tumorigenicity av eggstokkreft celler.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Eksperimenter med primær eggstokkreft prøver ble godkjent av etisk komité av Tokyo Medical og Dental University og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter. Alle dyreforsøk ble utført med godkjenning av Animal Study Committee of Tokyo Medical and Dental University (Permit Nei 0120286A) og dannet alle relevante retningslinjer og lover.
cellekultur og primærprøver
Fire menneske eggstokkreft cellelinjer, RMG-i, RMUG-S, RMUG-L og MCAS ble hentet fra den japanske Innsamling av forsknings Bioressurser Cell Bank (Tokyo, Japan) og 2 eggstokkreft cellelinjer, OMC-3 og JHOC- 5, var fra Riken Cell Bank of Japan (Tsukuba, Japan) [15]. RMG-I, RMUG-S, RMUG-L og OMC-3 ble dyrket i Hams F-12 medium supplert med 10% FBS. JHOC-5 ble dyrket i 01:01 blanding av Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) og Hams F12, inneholdende 0,1 mM ikke-essensielle aminosyrer supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS). MCAS var dyrket i Eagle er Minimum Essential Medium inneholder 20% FBS. Alle de andre ovarie cancer cellelinjer ble beskrevet andre steder [16], [17], [18]. Humane embryonale nyrecellelinjer, HEK293 og HEK293T ble dyrket i DMEM inneholdende 10% FBS. HOSE1C er en immortalisert menneskelig eggstokkreft overflaten epithelial cellelinje etablert fra primære humane eggstokkene overflaten epitel (slange) celler etter infeksjon med retrovirus uttrykker mutant Cdk4, cyclinD1 og menneskelig telomerase revers transkriptase [19]. HOSE1C-celler ble dyrket i 01:01 blanding av DMEM og Ham F12 supplert med 10% FBS. Alle medier ble brukt var supplert med 100 U /ml penicillin G og 100 ug /ml streptomycin sulfat. Primære eggstokkreft prøver ble innhentet fra 12 pasienter i et tilknyttet sykehuset i Tokyo Medical and Dental University. Median alder for pasientene var 56,5 år, som strekker seg fra 27 til 80 år. Av de 12 eggstokkreft, fem var histologisk serøs karsinom, 4 var klar cell carcinoma, 2 var endometrioid karsinom og en var yalk sac tumor.
Utarbeidelse av celleekstrakter
For tilberedning av hel- celleekstrakter, ble cellene høstet og lysert i RIPA-buffer [20 mM tris (hydroksymetyl) aminometan-HCl (pH 7,5), 137 mM NaCl, 1% Nonidet P-40 (NP-40), 0,5% deoksykolat, 0,1% SDS] . For utvinning av cytoplasmiske og kjerneproteiner, ble cellene først lysert i hypotonisk buffer [20 mM 4- (2-hydroksyetyl) -1-piperazinetansulfonsyre (HEPES) (pH 7,8), 0,15 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), 0.15 mM ethyleneglycoltetracetic syre , 10 mM KCl] og inkubert på is i 10 minutter. NP-40 ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 1%, og cellesuspensjoner ble sentrifugert ved 14000 rpm i 5 minutter. Supernatantene ble anvendt som cytoplasmiske ekstrakter. Pelletene ble vasket tre ganger med isotonisk buffer [20 mM HEPES (pH 7,8), 100 mM NaCl, 0,1 mM EDTA og 25% glycerol] og resuspendert i atom utvinning buffer [20 mM HEPES (pH 7,8), 400 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 25% glyserol og 1 mM ditiotreitol (DTT)]. Etter 30 minutters inkubering ved 4 ° C med konstant omrøring ble suspensjonen sentrifugert ved 14.000 rpm i 2 minutter. Supernatantene ble utvunnet og anvendt som nukleære ekstrakter. Ripa, hypotoniske og atomutvinnings buffere ble supplert med 1 mg /ml aprotinin, 1 pg /ml leupeptin, 0,57 mM phenylmethanesulfonylfluoride, 100 uM natriumvanadat, og 20 mM β-glycerofosfat. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved Bradford-analysen.
Elektroforetisk mobilitet skift analyse (EMSA)
Fem mikrogram av nukleære ekstrakter ble inkubert i 2 timer ved romtemperatur i bindingsbuffer [10 mM HEPES ( pH 7,8), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 2,5% glycerol og 0,5 ug av poly (di-dC)] med 0,5 ng
32P-merket NF-kB-spesifikk probe avledet fra H -2Kb promotor eller
32P-merket Oct-en sonde [20], [21]. For super-skift-analyser, ble kjerneekstrakter preinkubert med spesifikke antistoffer eller antiserum i 1 time på is før inkubasjon med den merkede proben. De følgende antistoffer eller antiserum som ble anvendt for preinkubering: antistoff til p50 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA, # sc-7178 X), renset kanin-IgG (Cedarlane Laboratories, Hornby, Canada) og anti-P52 serum ( Upstate bioteknologi, Lake Placid, NY, USA, 06-413). Pre-immunserum, anti-RELA og anti-relB sera ble vennlig levert av legene. N.R. Rice (NCI, MA) og A. Israel (Institut Pasteur, Paris). For kompetitive bindingsanalyse, ble kjerneproteiner inkubert med 100-gangers molart overskudd kald-oligonukleotid før tilsetning av den merkede probe. De protein-DNA-kompleksene ble separert på en polyakrylamidgel inneholdende 2,5% glycerol, etterfulgt av autoradiografi.
NF-kB-DNA-bindende aktivitet
Binding av P52 eller relB til NF-kB bindende sekvens ble kvantifisert med Transam ™ NF-kB Familie Kit (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet ble 5 ug av nukleære ekstrakter ble tilsatt til en 96-brønns plate forhåndsbelagt med oligonukleotidet inneholdende NF-kB konsensussekvensen. Den aktiverte P52 eller relB stede i ekstrakter binding til dette nucleotide ble oppdaget av sekundære antistoffer konjugert til HRP.
Immunoblotting
Hel-celle (30 mikrogram), cytoplasma (30 mikrogram) og kjernekraft (10 ug) lysatene ble oppløst ved SDS-PAGE og analysert ved immunblotting. De følgende antistoffer ble anvendt: anti-NF-κB2 P52 (C-5) (Santa Cruz Biotechnology, # sc-7386) for deteksjon av P52 og dens forløper P100; anti-NIK (Cell Signaling, Danvers, MA, USA, # 4994); anti-relB (C-19) (Santa Cruz Biotechnology, # sc-226); anti-fosfo-p100 (Ser866 /870) (cellesignalisering, # 4810); anti-fosfor-IκBα (Ser32 /36) (5A5) (Cell Signaling, # 5205); anti-IκBα (C-21) (Santa Cruz Biotechnology, # sc-371); anti-fosfor-IKKα (Ser180) /IKKβ (Ser181) (Cell Signaling, # 2681), anti-IKKα (H-744, Santa Cruz Biotechnology, # sc-7218), anti-IKKα /β (H-470, Santa Cruz Biotechnology, # sc-7607), anti-TRAF2 (C90-481) (BD Biosciences, San Jose, CA, USA, 558890); anti-TRAF3 (H-122) (Santa Cruz Biotechnology, SC-1828); anti-cIAP1 (R anti-Lamin A /C (4C11) (Cell signalering, # 4774); anti-α-tubulin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA, T9026). For påvisning av NIK endogent protein, ble cellene behandlet med 0,1% DMSO eller 20 uM av MG132 (peptid INSTITUTE, Osaka, Japan) i 6 timer og cytoplasmiske ekstrakter ble underkastet immunoblotanalyse.
Sanntids revers transkripsjon -PCR (RT-PCR) -analyse
Sanntids tids~~POS=HEADCOMP RT-PCR-analyse ble utført hovedsakelig som beskrevet tidligere [7]. I korthet, ble total RNA ekstrahert fra cellelinjer og eggstokkreft vev ved hjelp av ISOGEN (Nippon Gene, Tokyo, Japan) i henhold til produsentens instruksjoner. De mRNA nivåer av
NIK
,
Cyclin D1 Hotell og
MMP-9
ble kvantifisert ved hjelp StepOnePlus real-time RT-PCR system (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Ett hundre ng av total RNA ble underkastet kvantitativ RT-PCR ved bruk av TaqMan® ett-trinns RT-PCR masterblanding Reagenser Kit (Applied Biosystems). Revers transkripsjon ble utført ved 48 ° C i 30 minutter og Taq DNA-polymerase ble aktivert ved 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 45 forsterknings sykluser med denaturering ved 95 ° C i 15 sekunder og annealing og ekstensjon ved 60 ° C i 1 minutt . De mRNA-nivåer ble normalisert til den 18S ribosomale RNA-nivåer målt ved sanntids-RT-PCR ved bruk av 100 pg av total RNA. Uttrykk av MIR-31 ble undersøkt ved hjelp TaqMan® Micro RNA analyser (Applied Biosystems) i henhold til produsentens instruksjoner. Mir-31 nivåer ble normalisert med RNU48 uttrykket nivåer.
lentiviruses
lentiviral vektorer som kan uttrykke shRNA målretting
NIK plakater (PCS-puro-Niki-en og PC-er -puro-Niki-2) ble beskrevet tidligere [7]. Den targeting sekvens spesifikk for
grønt fluorescerende protein plakater (GFP) 5′-ACCCGCGCCGAGGTGAAG-3 «ble satt inn umiddelbart nedstrøms for H1 arrangøren av pSuperRetoro vektor (Oligoengine, Seattle, WA, USA), genererer PSR-GFPi . Den shRNA ekspresjonskassetten ble overført til lentiviral vektor, PCS-puro-PRE, bærer puromycin motstand genet uttrykt under kontroll av fosfoglyceratkinase promoter [7]. Det resulterende plasmid ble kalt PCS-puro-GFPi. For produksjon av lentiviruses stand til å uttrykke shRNA ble HEK293T celler transfektert med PC-puro-GFPi (shCtl), PC-puro-Niki-en (shNIK-1) eller PC-puro-Niki-2 (shNIK-2) sammen med den pCMV-ΔR8.2 emballasje konstruere og pHCMV-VSV-G (kind gaver fra Dr. ISY Chen) ved hjelp FuGENE6 (Promega, Madison, WI, USA). Kultursupernatanter ble samlet opp og filtrert 56 timer etter transfeksjon. RMG-I og JHOC-5-celler ble infisert med disse lentiviruses i 12 timer i nærvær av 10 ug /ml polybrene. Infiserte celler ble utvalgt i nærvær av 4 ug /ml puromycin (Sigma-Aldrich) 24 timer etter infeksjon.
NF-kB reportergen analysen
RMG-I og JHOC-5-celler ble infisert med lentivirus vektorer som bærer enten en NF-kB-responsiv promoter-drevet Firefly
luciferase
genet (CS-kB-R2.2) eller forlengelse faktor (EF) -1α promoter-drevet
Renilla luciferase
gen (pCERp) [8], [22]. Resulterende celle bassenger ble deretter smittet med lentiviruses stand til å uttrykke hver shRNA. Etter seleksjon med 4 ug /ml puromycin i 3 dager ble cellene høstet og luciferase-aktivitet ble målt ved bruk av dual-luciferase reporter Assay System (Promega). NF-kB avhengig Firefly luciferase aktivitet var normalisert med EF-1α promoter-drevet avhengig
Renilla
luciferase aktivitet.
Cell-syklus analyse
Celler ble fiksert i 70% etanol og inkubert med 0,5 mg /ml RNase i 45 minutter og deretter farget med 30 ug /ml propidiumjodid i 30 minutter ved romtemperatur. DNA innholdet i cellene ble målt ved hjelp av FACS Calibur system (BD Biosciences) og analysert Cellquest programvare (BD Biosciences).
Soft agar assay
RMG-I celler som uttrykker shCtl eller shNIK-en var utsådd i F-12 medium inneholdende 0,33% agar. Etter 4 uker med inkubasjon, kolonier større enn 60 mikrometer i diameter ble telt for å evaluere forankringsuavhengig cellevekst.
Mus xenograft tumor modell
BALB /cAJcl-nu /nu mus (CLEA Japan , Tokyo, Japan) ble opprettholdt under spesifikke patogen-fri tilstand på Experimental Animal Center of Tokyo Medical and Dental University. RMG-I-celler som uttrykker shCtl eller shNIK-1 ble suspendert i serumfritt medium. Atymisk mus (5-6 uker gamle) ble inokulert subkutant i postauricular region med 5 x 10
6 celler. Tumorvolumet ble registrert hver uke. Den største langsgående diameter (lengde) og den største transversale diameter (bredde) ble målt med et skyvelære. Tumor volum ble beregnet ved hjelp av følgende formel: tumorvolumet = lengde × bredde
2/2. Alle mus ble avlivet 3 uker etter inokulering og vekten av hver tumor ble målt.
statistikker og
Data er presentert som gjennomsnitt ± SD eller som representative bilder fra minst tre uavhengige eksperimenter. Den statistiske analysen ble utført ved hjelp av to-tailed t-test. For pasientprøven analyse og musemodell, ble signifikante forskjeller mellom gruppene bestemmes ved hjelp av Mann-Whitney U-test. En
P
verdien av 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Noncanonical NF-kB aktivering i eggstokkreft celler
For å undersøke hvor NF. -κB er konstitutivt aktivert i eggstokkreft celler, vi først undersøkte NF-kB DNA-bindende aktivitet ved EMSA. Eggstokkreft celler viste markert forhøyet NF-kB-DNA-bindende aktivitet i forhold til HEK293-celler som er kjent for å ha en basal NF-kB aktivitet. HOSE1C, en udødeliggjort ovarie overflate epitelcellelinje viste en NF-kB-bindingsaktivitet så lav som HEK293-celler og ble brukt som en kontroll i følgende studier (figur 1A). Bindingen til den radio-merkede probe ble effektivt konkurrerte med et overskudd av kald probe, noe som viser spesifisiteten av binding (figur 1B). Selv om den vedvarende aktivering av NF-kB er rapportert i eggstokk-kreft, har NF-kB-DNA-bindende komplekser som er involvert i disse cellene forble ukjent. Super-shift-analyser viste at ikke bare NFKB1 /p50 og RELA, men også NFKB2 /P52 og relB var involvert i NF-kB DNA-bindende komplekser i RMG-I og JHOC-5 celler (Figur 1b). Immunoblottings viste disse cellelinjene uttrykte et spesifikt fosforylerte formene for IKKα, IKKβ og IκBα (figur 1C). Fosforylering av IKKβ og IκBα var mer intens i JHOC-5 og MCAS celler mens IKKα var overveiende fosforylert i RMG-I og OMC-3 celler, noe som tyder på fortrinnsrett aktivering av de kanoniske og noncanonical trasé i hver cellelinjer. At uttrykk for NFKB2 /p100 avhenger i stor grad av NF-kB aktivering gjennom kanoniske sti kan delvis forklare rikelig uttrykk for NFKB2 /p100 og dens fosforylert skjema samt P52 i JHOC-5 celler. Den fosforylerte form av p100 ble påvist i ovarian cancer-cellelinjer med unntak av RMUG-S, men ikke i kontroll 293 eller HOSE1C celler. Tilstedeværelsen av forhold og relB i kjernen korrelert med resultatene av EMSA (figur 1D). Disse resultatene indikerer at både kanoniske og /eller noncanoncal NF-kB veier er forskjellig aktivert i eggstokkreft celler.
(A) Fem mikrogram atom utdrag fra de angitte cellelinjer ble utsatt for EMSA hjelp
32P-merkede oligonukleotider inneholdende en NF-kB-bindingssekvens eller Oct-1-bindende sekvens som prober. (B) For konkurranseanalyse kjerneprøver ble forinkubert med 100-gangers molart overskudd kald-oligonukleotid før tilsetning av den merkede probe (venstre panel). DNA-bindende NF-kB-komponenter i de angitte cellelinjer ble bestemt ved super-shift EMSA (høyre panel). Nukleære ekstrakter (5 ug) fra de angitte cellelinjer ble preinkubert i 30 minutter med renset muse-IgG, anti-P50 eller anti-c-Rel-antistoffer, pre-immun (PI), anti-P52, anti-rela eller anti-relB sera, og deretter underkastet EMSA med NF-kB-spesifikk probe. (C og D) Nuclear (10 ug), cytoplasmatisk (30 ug) eller hel-celle (30 ug) ekstrakter ble underkastet SDS-PAGE etterfulgt av immunoblottings med de angitte antistoffer.
NIK spiller en sentral rolle i konstituerende NF-kB aktivering i eggstokkreft celler
Forhøyet uttrykk for NFKB2 /P52 bedt oss om å undersøke NIK uttrykk i eggstokkreft celler. Kvantitativ RT-PCR-analyse viste at kontroll HOSE1C celler viste større CT forskjell enn de 28 eggstokkreft cellelinjer testet, hvorav 17 cellelinjer uttrykte 4 til 16 ganger mer
NIK
mRNA enn kontroll HOSE1C celler (Figur 2A). En fersk rapport viser at tapet av mikroRNA MIR-31 målretting
NIK
ligger under konstitutiv aktivering av NF-kB i voksen T-celle leukemiceller [23]. Vi vurderte derfor MIR-31 uttrykk i eggstokkreft celler ved kvantitativ RT-PCR. Fire av seks kreftcellelinjer hadde mindre enn 1/8 av MIR-31 RNA i HOSE1C cellene selv om sammenhengen mellom
NIK Hotell og Mir-31 RNA uttrykk var ikke signifikant (figur 2B og 2C). Viktigere, kvantitativ RT-PCR analyse av eggstokkreft vev avdekket en median på 2,4 ganger økning i
NIK
mRNA uttrykk i forhold til normal eggstokk vev (figur 2D). Men MIR-31 uttrykk i eggstokkreft vev var ikke signifikant forskjellig fra de i normale eggstokkene vev eller statistisk korrelert med
NIK
mRNA uttrykk (Figur 2E og 2F). Dermed visse tilfeller av
NIK
mRNA akkumulering kan ikke utelukkende forklares med redusert MIR-31 uttrykk og foreslår tidligere avduket mekanisme (r) av
NIK
mRNA overekspresjon.
( A og D) Total RNA ble ekstrahert fra de angitte cellelinjer eller eggstokkreft vev og utsatt for real-time RT-PCR for kvantifisering
NIK
mRNA uttrykk. (A) ΔCT bestemmes som differansen mellom Ct verdi på
NIK
mRNA og den fortynnede 18S rRNA. Enkelt stjernetegn betegne betydelig reduksjon (
P
0,05) i ΔCT verdi i forhold til HOSE1C celler. (D)
NIK
mRNA nivåer ble normalisert til 18S RNA. Relativ
NIK
mRNA nivåer er vist ved dobling i mRNA overflod i forhold til gjennomsnittet av normale eggstokker (vilkårlig satt til 1). (B og E) Total RNA brukes i paneler A og D ble utsatt for real-time RT-PCR for MIR-31 kvantifisering. (B) Den ΔCT fastsettes som differansen mellom Ct verdien av MIR-31, og at internkontrollen RNU48. Enkelt stjernetegn betegne betydelig økning (
P
0,05) i ΔCT verdi i forhold til HOSE1C celler. (E) MIR-31 nivåer ble normalisert til de tilsvarende RNU48 nivåer. Relative MIR-31 nivåer er vist ved dobling i MIR-31 overflod i forhold til gjennomsnittet av normale eggstokker (vilkårlig satt til 1). (C, F) Pearson korrelasjonskoeffisient R «sup> 2 mellom NIK mRNA og MIR-31 nivåer ble beregnet. (G) Tretti mikrogram lysater ble underkastet SDS-PAGE etterfulgt av immunoblottings med de angitte antistoffer. For påvisning av endogent NIK, ble cellene behandlet med MG132 (20 uM) eller DMSO i 6 timer før fremstilling av cytoplasmiske ekstrakter. N.S., ikke signifikant.
Uttrykk av NIK protein er strengt regulert av polyubiquitination og proteasome-mediert degradering og er generelt holdt oppdages av immunblotting uten å hemme sin raske degradering. Uttrykket av TRAF2, 3 og cIAP1 i eggstokkreft cellelinjer som negativt regulerer NIK uttrykk forble sammenlignbar å kontrollere celler (Figur S1). Da vi var i stand til å oppdage NIK protein ved enkel immunoblotting eller immunoprecipitation koblet immunblotting ved hjelp av cytoplasmatiske lysatene fra disse celle, behandlet vi cellene med en proteasominhibitor MG132 før protein utvinning. NIK-proteinet var lett detekterbar i eggstokkreft celler i nærvær av MG132, men ikke i kontroll HOSE1C eller HEK293-celler (figur 2G), som indikerer forbedret produksjon av NIK-proteinet i eggstokkreft celler. Disse data kollektivt indikerer at NIK er abnormt uttrykt på pretranslational nivå i eggstokkreft celler.
Tidligere rapporter viste at dårlig prognose for eggstokkreft pasienter korrelerer med overekspresjon av pro-MMP-9 og cyclin D1 [24], [25], hvis ekspresjon er kjent for å bli regulert av NF-kB. Kvantitativ RT-PCR-analyser viste at
MMP-9
mRNA-nivåer i de fleste av de ovarie cancer-cellelinjer var høyere enn den for kontroll HOSE1C celler.
MMP-9
mRNA nivåer i hver cellelinje ikke korrelerer med
NIK
mRNA nivåer (figur 3A). Nivåer av
cyclinD1
mRNA i alle de testede eggstokkreft cellelinjer overskredet som HEK293 celler, mens HOSE1C celler rikelig uttrykt
cyclinD1
mRNA grunn tvunget uttrykk for dette genet for immortalization. I eggstokkreft vev,
MMP-9
mRNA uttrykk var signifikant oppregulert og
cyclin D1
mRNA nivåer tendens til å øke i eggstokkreft vev selv om disse mRNA uttrykk i hver prøve ikke korrelerer med
NIK
mRNA uttrykk (Figur 3B).
Total RNA hentet fra de angitte cellelinjer (A) eller eggstokkreft vev (B) ble utsatt for real-time RT-PCR for kvantifisering
MMP-9
eller
Cyclin D1
mRNA uttrykk. (A) ΔCT fastsettes som differansen mellom Ct verdien av
MMP-9
eller
Cyclin D1
mRNA og som av utvannet 18S rRNA. Enkelt stjernetegn betegne signifikant forskjell (
P
0,05) i ΔCT verdi i forhold til HOSE1C celler (
MMP-9
) eller HEK293 celler (
Cyclin D1
). (B) mRNA-nivåer ble normalisert til 18S RNA. Relative mRNA-nivåer er vist ved gangers økning i mRNA-overflod i forhold til gjennomsnittet av normale eggstokker (vilkårlig satt til 1). Pearson korrelasjonskoeffisient R
2 mellom
MMP-9
eller
Cyclin D1 Hotell og
NIK
mRNA nivåer ble vist. Relative mRNA nivåer er beregnet ved dobling i mRNA overflod i forhold til at av HOSE1C celler (
MMP-9
) eller HEK293 celler (
Cyclin D1
).
For å undersøke hvor NIK regulerer NF-kB avhengig gentranskripsjon i eggstokkreft cellelinjer, etablerte vi en NF-kB reporter cellesystem med lentivirus transduksjon. RMG-I og JHOC-5-celler ble infisert med lentivirus vektorer som bærer en Firefly
luciferase
transkripsjonsenhet under styring av NF-kB-avhengige promotor eller
Renilla luciferase
transkripsjonsenhet under styring av konstitutiv elongeringsfaktor 1α-avledet promoter som en intern kontroll. Etablerte celle bassenger ble deretter infisert med lentivirus stand til å uttrykke enten shRNA målretting
NIK
eller
GFP Hotell og utsatt for luciferase analyser. Uttømming av NIK ble bekreftet ved kvantitativ RT-PCR og immunblotting i nærvær av MG132 (figur 4A). NIK uttømming redusert P52 ekspresjon og NF-kB-avhengige reportergenekspresjon i RMG-I og JHOC-5-celler (figur 4B og 4C). Uttrykk for en annen shRNA målretting
NIK
mRNA resultert i tilsvarende undertrykkelse av NF-kB-avhengig transkripsjon, unntatt muligheten for off target effekter (figur S2A, B).
(A) RMG- I og JHOC-5 celler ble infisert med lentivirus vektorer som uttrykker shRNA målretting
NIK plakater (shNIK-1) eller
GFP plakater (shCtl). Total RNA ble ekstrahert fra disse cellene og utsatt for real-time RT-PCR for kvantifisering
NIK
mRNA uttrykk.
NIK
mRNA nivåer ble normalisert til 18S RNA. Relativ
NIK
mRNA nivåer er vist ved dobling i mRNA overflod i forhold til gjennomsnittet av shCtl (vilkårlig satt til 1). Enkelt stjernetegn betegne betydelig reduksjon (
P
0,05) sammenlignet med shCtl celler. Parallelt ble celler behandlet med MG132 (20 uM) i 6 timer før fremstilling av cytoplasmiske ekstrakter. Cytoplasmiske ekstrakter (30 ug) ble underkastet immunoblotanalyse med de angitte antistoffer. (B) RMG-I og JHOC-5 celler infisert med et lentivirus vektor bærer en NF-kB-avhengige Firefly luciferase uttrykk kassett og at bærer et EF-1α promoter avhengige
Renilla
luciferaseekspresjon kassett. Etablerte celle bassenger ble infisert med lentivirus vektorer som uttrykker shRNA målretting
NIK plakater (shNIK-1) eller
GFP plakater (shCtl). Cellene ble selektert med puromycin (4 ug /ml) i 72 timer og underkastet den doble luciferase-analyse, i hvilket ildflueluciferase aktivitet ble normalisert med
Renilla
luciferase-aktivitet. Relative luciferase-aktivitet er uttrykt som lysenheten sammenlignet med kontrollen (shCtl). Yang et al.
