Abstract
Tumor-forbundet makrofager er kjent for å påvirke kreft progresjon ved modulering av immunforsvar, angiogenese, og celle metastaser, men lite er kjent om chemokin signaliserer nettverk som regulerer denne prosessen. Utnytte CT26 tykktarmskreftceller og RAW 264,7 makrofager som modell mobilsystemet, viser vi at behandling av CT26 celler med RAW 264,7 kondisjonert medium induserer cellemigrasjon, invasjon og metastasering. Inflammatorisk genet microarray analyse indikerte CT26-stimulerte RAW 264,7 makrofager oppregulere SDF-1α og VEGF, og at disse cytokiner bidra til CT26 migrasjon
in vitro
. RAW 264,7 makrofager viste også en robust kjemotaktisk respons mot CT26-avledet chemokiner. Spesielt microarray analyse og funksjonelle tester avslørte CSF-en som den store kjemotiltrekkende for RAW 264,7 makrofager. Interessant, i kylling CAM-modellen av kreft progresjon, RAW 264.7 makrofager lokalisert spesifikt til tumor periferien hvor de ble funnet å øke CT26 tumorvekst, mikrovaskulær tetthet, vaskulære forstyrrelser, og lunge- metastase, tyder disse cellene hjem til aktivt å invadere områder av svulst, men ikke den hypoksiske kjerne av tumormassen. Til støtte for disse funnene, hypoksiske forhold nedregulert CSF-1 produksjon i flere tumorcellelinjer og redusert RAW 264,7 makrofagen migrasjon
in vitro
. Sammen våre funn tyder på en modell der normoksisk tumorceller utgivelsen CSF-en for å rekruttere makrofager til svulsten periferien hvor de skiller ut motilitet og angiogene faktorer som fremmer tumorcelle invasjon og metastase
Citation: Grønn. CE, Liu T, Montel V, Hsiao G, Lester RD, Subramaniam S, et al. (2009) kjemotiltrekkende Signa mellom tumorceller og makrofager Regulerer Cancer Cell Migrasjon, metastaser og neovaskularisering. PLoS ONE 4 (8): e6713. doi: 10,1371 /journal.pone.0006713
Redaktør: Derya Unutmaz, New York University School of Medicine, USA
mottatt: May 22, 2009; Godkjent: 09.07.2009; Publisert: 21 august 2009
Copyright: © 2009 Green et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. CEG, TL og R.L.K støttes av NIH tilskudd R01CA097022 og R01GM068487. V.M., R.D.L og S.L.G. støttes av NIH stipend R01CA94900. G.H. og S.S. støttes av NIH stipend R01GM078005. www.nih.gov. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tilbøyelighet for svulster til fremgang og metastasere gjenspeiler ikke bare de onkogene mutasjoner i kreftcellene, men også dynamisk interaksjon mellom ikke-ondartede celler i svulsten cellen mikromiljøet. Ikke-maligne celler som infiltrerer en utvikling av kreft omfatter fibroblaster, adipocytter, endotelceller, perivaskulære celler og immunceller, som alle kan bidra til kreft progresjon [1]. Blant de immunceller, har makrofager vist seg å spille en støttende rolle, fremme svulst celle overlevelse, spredning og metastase [2]. Tumorassosierte makrofager (TAM) er avledet fra sirkulerende perifere blodmonocytter som er tiltrukket til tumorvaskulatur hvor de ekstravasere inn i interstitium og differensiere [3]. Selv homing av makrofager til svulster er dårlig forstått, er kreftceller kjent for å frigjøre makro chemoattractants inkludert CCL2, CCL5, CCL7, CCL8, CXCL12, VEGF og CSF-1 [4]. Sammenlignet med klassisk aktiverte makrofager (M1) som fungerer som primære effektorceller i det medfødte immunsystemet, M2 TAMs støtte svulst overlevelse ved å fremme lokal angiogenese og vev remodeling, mens undertrykke immunresponsen [5]. TAMs lokalisere de invasive områdene av tumoren, hvor de utskiller en rekke cytokiner og proteaser som er involvert i tumorcelleinvasjon og metastase [6], [7]. I denne rollen TAMs bidra aktivt til tumorprogresjon og overgangen til malignitet som ofte korrelerer med dårlig klinisk utfall. Imidlertid forklaring på de forskjellige tumor-celle kjemokin nettverk som regulerer progresjon kreft
in vivo
er fortsatt en stor utfordring.
Angiogenese, som er kritisk for kreft progresjon, blir styrt av en rekke faktorer som er kjent for å stimulere blodkarvekst og /eller modning, herunder VEGF, TGF-β, EGF, bFGF og TNF-α. TAMs representerer en primær kilde til mange av disse angiogene proteiner i tumoren microenvironement [8], [9], [10]. Spesielt er VEGF utgitt av TAMs og er et kraftig stimulus for vekst av nye blodkar, øket mikrovaskulær tetthet, vaskulære forstyrrelser, og lekkasje [11]. Blodårer som er under ombygging er porøs og skjør og således mer utsatt for tumorcelle intravasation [12]. Derfor ved invasiv front, kan TAMs fremme metastase ved å stimulere dannelsen av tette mikrovaskulære nettverk av lekk fartøy som er tillatt å tumorcelle intravasation, samtidig aktivere kreft celle migrasjon og invasjon ved å slippe en rekke kjemokiner, mitogener og proteaser.
i tillegg til invasiv foran, kan TAMs også lokaliseres til den avaskulære hypoksisk kjerne av tumoren [13], [14]. VEGF er utgitt av TAMs i tumoren kjernen som reaksjon på hypoksi og stabilisering av HIF1α og HIF2α [15], [16]. VEGF kan også være involvert i rekruttering TAMs til tumoren kjerne, i tillegg til andre dårlig definerte faktorer som er tilstede i cellerester som følge av tumor-nekrose [13]. Når lokalisert til kjernen, TAMs kan ikke bare lett cellulært avfall, men også regulere neovaskularisering og tumor overlevelse. Dermed er det undergrupper av TAMs som er forskjellig fordelt i svulsten mikromiljøet som kan tjene spesialiserte roller under kreft progresjon [2]. Vi hypotese at tumor oksygene er veldig avgjørende for macrophage aktivitet i kreft. For eksempel, i den hypoksiske tumor kjerne, kan TAMs være primært angiogene og fagocytisk, mens i henhold til normoksisk forhold på tumor periferien, kan TAMs bidra til tumormetastase ved å øke vev-omforming og vaskulær tetthet. I sistnevnte tilfelle kan VEGF utgivelsen av TAMs reguleres uavhengig av hypoksi gjennom interaksjoner med invasive tumorceller eller stromale celler.
Forstå rollen TAMs i kreft progresjon
in vivo
kompliseres av den i evnen til å dechiffrere de mange faktorer som er tilstede i mikromiljøet av tumoren. Derfor modellsystemer som rekapitulere
in vivo
tumorcelle-TAM interaksjoner
in vitro
er nødvendig for å hjelpe avdekke kompleksiteten i tumorprogresjon og metastase under definerte forhold. I denne studien har vi utviklet et modellsystem for å direkte undersøke cytokin signalering mellom CT26 tykktarmskreftceller og RAW 264,7 makrofager. Ved hjelp av denne unike modellsystemet, viser vi at RAW 264.7 makrofager og CT26 tumorceller er gjensidig tiltrukket til hverandre, og at makrofager indusere en svært trekkende og protrusive fenotype i tumorcellene. Inflammatorisk gen rekke analyse og funksjonell testing avslørte at tumorcelle-avledet CSF-1 er den viktigste kjemoattraktant for RAW 264.7 makrofager, mens makrofag-avledet SDF-1α og VEGF bidra til CT26 kreftcelle invasjon. Videre er en total av 270 gener i RAW 264.7 makrofager og 85 gener i CT26 tumorceller ble opp- eller nedregulert i løpet av inkubasjon i kondisjonert medium, noe som tyder på at ytterligere trasé utover de som ble testet er sannsynlig aktivert i løpet av toveis signalering. I kylling CAM inokulert med tumorceller, RAW 264,7 makrofager lokal til svulsten periferien, hvor de lette vaskulær remodellering og potensere tumorcelle metastaser til chick lungene. Disse resultatene understøtter en modell hvor parakrin signalering mellom tumorceller og makrofager regulerer lokalisering av makrofager i tumoren og tilbøyelighet av tumorcellene til å metastasere.
Materialer og metoder
Cellelinjer, reagenser og antistoffer
CT26 mus tykktarmskreft linje, ble RAW 264,7 musemakrofag linje og MDA-MB-468 brystkreft linje erholdt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). CL16, en metastatisk variant av MDA-MB-435, ble utledet som tidligere beskrevet [17]. CT26 celler ble holdt i RPMI 1640 supplert med 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA) og 1% glutamin. RAW 264.7, MDA-MB-468 og CL16-celler ble dyrket i DMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA) supplert med 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin og 1% Glutamax (Invitrogen, CA). RAW 264,7 uttrykker GFP ble gjort ved å infisere celler med Lenti-grønn supernatant (BioGenova, Rockville, MD). De høyeste 0,1% uttrykkende celler ble deretter sortert ved hjelp av FACS. CT26 celler som uttrykker DsRed ble generert ved å infisere celler med lentivirus, pEF1-DsRed-pur, etterfulgt av seleksjon i puromycin (1 pg /ml). Hvor angitt, ble cellene behandlet med blokkering av anti-CSF-1R mAb (AFS98, eBioscience, San Diego, CA), som blokkerer anti-EGF-R (Millipore, Billerica, Massachusetts), rekombinant mus CSF-1 (R . D Systems, Minneapolis, MN), rekombinant mus SDF-1α (Millipore, Billerica, MA) eller rekombinant VEGF165 (Millipore, Billerica, MA)
Kvantitativ celle migrasjon og invasjon analyser
for time-lapse avbildning av celle migrasjon i co-kultur, RAW 264,7-GFP ble inkubert på fibronektin (10 mikrogram /ml, Sigma-Aldrich) belagt Lab-Tek kammer lysbilder (Nunc, Rochester, NY) i 30 minutter ved 37 ° C før tilsetning av CT26-DsRed (10
7 celler /ml). Når CT26 ble lagt, ble kammeret lysbildet umiddelbart plassert i et Inc-2000 Inkubator System (20/20 Technology Inc., Wilmington, NC) og deretter fotografert på 20X (NA = 0,75) i 15 timer ved 4 rammer /t ved hjelp av et Nikon C1-Si invertert confocal mikroskop (Nikon Instruments Inc., Melville, New York) er utstyrt med PMT detektorer og lasere som passer for GFP (488 nm) og DsRed (561 nm). Descanned bildene ble anskaffet ved hjelp av Nikon EZ-C1 programvare deretter gjengitt for celle sporing og form analyse ved hjelp Imaris (bitplan, Saint Paul, MN). Ved vedheft ble stedets koordinater centroids for individuelle CT26-DsRed cellene innspilt på hver ramme over tidsforløpet av migrasjon. Disse koordinatene ble deretter brukt til å lage migrasjons spor fra hvilket migrering retthet, fortrengning og total avstand ble bestemt. Migrasjon retthet er dimensjonsløs verdi som gjelder antall avdelings poeng eller svinger i et spor til den totale migrasjon avstand. Total oppgraderingsveg lengde ble bestemt ved å summere migrasjonsvise avstander hver ramme hele videosekvens. Netto oppgraderingsveg forskyvning ble kvantifisert som den direkte avstanden mellom begynnelsen av overføringen og slutten av overføringen. Formen indeks er forholdet mellom den store akse lengde over den minste aksen lengden for de enkelte celler som spores over tidsforløpet av migrasjon.
kjemotakse analyser ble utført som tidligere beskrevet med mindre modifikasjoner [18]. I korthet, modifisert Boyden kammere (Transwell, 6,5 mm diameter, Corning, Lowell, MA) inneholdende polykarbonat-membraner med 8 um porer ble belagt på begge sider med fibronektin (10 ug /ml, Sigma-Aldrich) i 2 timer ved 37 ° C, skylt en gang med PBS, og deretter plassert inn i det nedre kammer inneholdende 500 ul migrasjon adhesjon buffer (MAB; DMEM med 0,1% RIA grad av fraksjon V BSA (Sigma-Aldrich), 1% penicillin-streptomycin, 1% glutamin), fullstendige media (DMEM supplert med 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin, 1% glutamin), kondisjonert medium eller migrering buffer inneholdende SDF-1α (100 ng /ml), VEGF165 (10 ng /ml), EGF (100 ng /ml) eller CSF-1 (40 ng /ml), som angitt. Betinget medier ble samlet inn fra CT26 eller RAW 264,7 kulturer etter 48 timer inkubasjon ved 37 ° C. Fortynninger av kondisjonert medier ble tatt opp i passende base kulturmedier. Der det er angitt, anti-CSF-1R (20 ug /ml) og anti-EGF-R (20 ug /ml) var til stede i både topp- og bunn brønner over hele analysen. Serum-sultet RAW 264.7 eller CT26 celler ble fjernet fra kulturskåler med Hanks «balanserte saltløsning inneholdende 5 mM EDTA og 25 mM Hepes, pH 7,2, og 0,01% trypsin, vasket to ganger med migrasjon buffer og deretter resuspendert i migreringsbuffer ved 10
6 celler /ml. 10
5-celler i 100 ul migreringsbuffer ble deretter tilsatt til toppen av hver enkelt migrasjon kammeret og tillatt å migrere til undersiden av den porøse membran til forskjellige tider i tre eksemplarer. RAW 264,7 migrert i 24 timer under alle forhold og CT26 migrert for 3 timer under alle forhold. De nonmigratory cellene på den øvre membranoverflate ble fjernet med en bomullsdott, og den vandrende celler festet til bunnflaten av membranen farget med 0,1% krystallfiolett i 0,1 M borat, pH 9,0, og 2% etanol i 20 min ved værelses temperatur. Antallet celler pr chemotaxing Membranen ble telt ved bruk av et invertert fasekontrastmikroskop ved 40X. For RAW 264.7 kjemotakse henhold hypoksiske betingelser ble det nedre kammer supplert med fullstendig DMEM inneholdende 10% FBS for å skape et kjemotaktisk gradient. RAW 264.7 ble deretter tillatt å migrere i 24 timer under et normoksiske (21% oksygen) eller hypoksisk (1% oksygen) betingelser ved anvendelse av en IsoTemp inkubator (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Migrerende celler ble fiksert med 100% metanol i 5 minutter og farget med 0,1% krystallfiolett i 0,1 M borat, pH 9,0, 2% etanol i 20 min. Membraner ble kuttet fra Transwell og plassert i 200 ml 10% syre eddik å eluere flekken da absorbans ble avlest ved 570 nm.
For å undersøke makrofag invasjonen i collagen, CT26-DsRed eller rød fluorescerende (580 nm eksitasjon /605 nm emisjon) polystyren sfærer (10 mikrometer; molekylære prober, Carlsbad, CA) ble forankret i sterilt filtrert type 1 kollagen gel (PureCol; Nutacon, Leimuiden, Nederland) som inneholder 1X RPMI (Sigma-Aldrich), 25 mM natrium bikarbonat og justert til pH 7,4 ved anvendelse av 0,1 M natriumhydroksid, som tidligere beskrevet [19]. Kollagen løsning inneholdende CT26-DsRed (10
7 celler /ml) eller vulster (10
7 perler /ml) fikk til gelen i 10 mL alikvoter på fibronektin (10 ug /ml, Sigma-Aldrich) belagt Lab-Tek kammers objektglass (Nunc, Rochester, NY) i 30 minutter før tilsetning av RAW 264.7-GFP (10
5 celler /ml). Initial migrasjon av RAW 264,7-GFP i grensesnittet med kollagen fallet ble fotografert på 20X (NA = 0,75) i 12 timer ved 4 rammer /t ved hjelp av et Nikon C1-Si invertert confocal mikroskop (Nikon Instruments Inc., Melville, NY) utstyrt med PMT detektorer og lasere som passer for GFP (488 nm) og DsRed (561 nm). Descanned bildene ble anskaffet ved hjelp av Nikon EZ-C1 programvare deretter gjengitt for celle sporing ved hjelp Imaris (bitplan, Saint Paul, MN). Sted koordinatene centroids for individuell RAW 264,7-GFP ble registrert ved hver ramme over tidsforløpet av migrasjon. Disse koordinatene ble deretter anvendt for å beregne forskyvningen og den totale avstand migrert for celler innenfor og utenfor 100 um av kollagen rullegrensen. Platene ble inkubert i ytterligere 7 dager og deretter avbildes ved hjelp av konfokal mikroskopi (10X, NA = 0,45). 1 mikrometer trinn gjennom hele Z-aksen av kollagen fallet
kylling CAM-analysen
den kyllingembryo metastase analyse ble utført som tidligere beskrevet [20], [21]. I korthet, CT26-DsRed (2 x 10
6 celler) alene eller i kombinasjon med RAW 264.7-GFP (2 x 10
5-celler) celler ble suspendert på is i Matrigel (BD Bioscience) og deretter inokulert på kyllingen chorioallantoic membran (CAM) på utviklings dag 9. etter 11 dager, på utviklings dag 20, ble embryoer ofret og primære svulster ble fjernet, fotografert på 0.63X og 2X ved stereomikroskopi, veid og målt for diameter. Hjerte og lunger ble isolert, og celle-spredning ble kvantifisert ved telling av cellegrupper ved hjelp av konfokal mikroskopi ved 10X (R = 0,45) med et trinn avstand på 1 mikrometer. Svulster ble deretter seksjonert og plasseres direkte på et glass dekkglass for bildedannelse ved konfokal mikroskopi (10X; R = 0,45). Tumorer ble fotografert 0 til 0,5 cm fra omkretsen eller kanten (tumor periferien), 0,5 cm til 1 cm fra periferien (tumor vegg) og 1,0 cm til 3 cm fra tumor periferi (tumor kjerne). Kvantifisering av RAW 264.7-GFP distribusjon innenfor CT26-DsRed tumorer ble bestemt ved å ta gjennomsnittet GFP piksel punktmatriser over et synsfelt for å frembringe en midlere fluorescensintensitet for hver region av tumoren ved bruk av Image Pro Plus v4.5 (Media Cybernetics, Bethesda , MD). Lysstyrke og kontrast justeringer ble gjort likt for alle kanaler, og ikke endre de relative forskjellene mellom GFP pikselintensiteten i ulike regioner av svulsten.
qPCR
CT26, MDA-MB-468 eller CL16 tumorceller ble inkubert ved 37 ° C i riktig komplett medium i 24 timer under et hypoksisk (1,0% oksygen) eller normoksiske (21% oksygen) betingelser. Totalt RNA ble deretter ekstrahert ved bruk av TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA), i henhold til produsentens anbefalinger. cDNA ble syntetisert fra 2 ug av total-RNA ved hjelp av iScript cDNA syntesesett (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). qPCR ble utført ved hjelp av en System 7300 instrument (Applied Biosystems, Foster City, CA) og en ett-trinns program: 95 ° C, 10 min; 95 ° C, 30 x, 60 ° C, 1 min for 40 sykluser. CSF-1 og GAPDH mRNA nivåene ble målt i tre paralleller og normalisert mot HPRT-1 mRNA.
Microarray analyse
For å undersøke inflammatorisk genekspresjon, klimaanlegg buffere ble samlet inn fra CT26 eller RAW 264,7 kulturer følgende 48 timer med inkubering ved 37 ° C og anvendt på kulturer av det motstående celletype i 24 timer. mRNA ble så isolert med RNeasy kit (Quiagen, Valencia, CA), revers transkribert ved hjelp av iScript cDNA syntese kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) og analysert i tre eksemplarer ved hybridisering til Code pattedyr Betennelse Bioarray inneholder enkelttrådet 30 -mer oligonukleotidprober (GE Healthcare, Piscataway, New Jersey), i henhold til produsentens anbefalinger. Raw genuttrykk for gjentak var gjennomsnitt og normalisert ved hjelp av Code Gene Expression Analysis v5.0 programvare (GE Healthcare, Piscataway, NJ). For å bestemme statistisk signifikant oppregulering eller nedregulering av genet transkripsjoner, søkte vi i Avviks Modellert Bakre Inference med Regional exponentials (VAMPIRE) microarray analyse web suite til rå avskrift uttrykk verdier, som tidligere beskrevet [22], [23]. Gruppe-messig feil i forbindelse med flere sammenligninger ble rettet opp ved hjelp av en konservativ Bonferroni korrigert terskelen på 5% (alfa = 0,05). Hierarkisk gruppering av standardiserte array-data ble utført ved anvendelse av dChip (distanse: korrelasjon, binding: tyngdepunkt) basert på genet ontologispråk kommentarer for angiogensis, celledeling og kjemotaksis [24]. For heatmap analysen ble intensitetspoeng beregnet basert på betydningen av genet opp- eller nedregulering, som bestemmes av VAMPIRE analyse. Disse genene ble deretter organisert basert på genet ontologi kommentarer for angiogensis, celleproliferasjon og chemotaxis bruker dChip (avstand metrisk: korrelasjon, lenke metode: gjennomsnitt).
Statistisk analyse
Dataanalyse ble utført hjelp GraphPad Prism versjon 4.0-programvaren (GraphPad Software, San Diego, CA.). Alle data er rapportert som gjennomsnitt ± SE. Metriske gruppere data ble analysert med variansanalyse (ANOVA) og Neuman-Keuls post-test. Gaussian fordelt middelverdier ble analysert ved Student
t
test. Gruppe sammenligninger ble ansett som vesentlig for 2-tailed
P
verdier under 0,05.
Resultater
Migrasjon og morfologisk analyse av CT26 kreftceller Co-Cultured med RAW 264,7 Makrofager
Vi først utført en kinematisk analyse av tumor celle migrasjon atferd og bestemte celle formen endringer i respons til co-kultur med makrofager. Å direkte undersøke hvordan makrofager endre vandringsmønstrene og utholdenhet av tykktarm kreft celler, ble CT26 mus tykktarm kreft celler fotografert av konfokalmikroskopi ved samtidig kultur i 15 timer i nærvær eller fravær av RAW 264,7 musemakrofager (Fig. 1
A
). CT26 celler alene utstilt en samlet migrasjon lengde på 199 ± 78 mikrometer (gjennomsnitt ± SD) (Fig. 1
B
). Denne verdien var umulig å skille fra CT26 co-kultivert med RAW 264.7 celler, som viste en migrering lengde på 154 ± 46 nm. Men til tross for tilsvarende migrasjon lengder, CT26 som samtidig var dyrket med RAW 264.7 celler migrert langs en betydelig rettere bane, med rett verdier av 0,34 for CT26 co-dyrket med RAW 264.7 celler sammenlignet med 0,15 for CT26 alene (Fig. 1
B
). Denne 2-ganger økning i retthet ble ledsaget av en betydelig økning i total forskyvning eller utholdenhet av migrasjon av CT26 celler co-dyrket med RAW 264.7 celler. CT26 celler co-dyrket med makrofager viste en gjennomsnittlig forskyvning på 49 ± 24 mikrometer mot 28 ± 20 mikrometer for CT26 celler alene (Fig. 1
B
). Disse funnene tyder på at RAW 264,7 makrofager fremme migrasjon av CT26 celler
in vitro
. Viktigere, CT26 celler dyrket med eller uten makrofager viste lignende levedyktighet. Faktisk, analyse av tumorcellevekst over flere dager indikerte at CT26 celler vokste hurtigere i nærvær av makrofager (resultater ikke vist). Co-dyrking av RAW 264.7 celler med CT26 celler endret ikke RAW 264,7 celle adhesjon til ekstracellulære matrix proteiner. Videre evaluering av RAW 264,7 celle oppførsel i denne analyse avdekket ikke signifikante forskjeller i migrasjons avstand, forskyvning, retthet, eller celleform når cellene ble ko-dyrket med CT26 celler (resultater ikke vist), noe som tyder på fravær av kjemiske gradienter tilstrekkelig for makro chemotaxis. Sammen utgjør disse funnene tyder på at RAW 264,7 makrofager indusere vedvarende CT26 kreft celle migrasjon på 2-D overflater.
A, B) CT26-DsRed (10
5 /ml) ble inkubert på fibronektin med RAW 264,7 -GFP (10
5 /ml), som angitt, i 12 timer ved 37 ° C. I løpet av denne tiden, retthet, total lengde reist og total kumulativ forskyvning av enkelt CT26 celle centroids ble sporet (gule linjer) på 4 rammer /time i nærvær og fravær av RAW 264,7 makrofager ved hjelp konfokalmikroskopi på 20X. Data presentert som enkeltsporet kvantifisering for 55-75 celler over 3 eksperimenter, med gjennomsnittlig angitt med bar. Forstørrelse skala bar representerer 30 mikrometer. * Angir signifikant forskjell i oppgraderingsveg retthet (p 0,0001). ** Betegner betydelig forskjell i oppgraderingsveg forskyvning (p 0,0001).
Evnen til kreftceller for å danne invadapodia og membran utstikkere har vært knyttet til økt migrasjon og vev invasivitet [25]. Derfor undersøkte vi CT26 cellemorfologi svar på co-dyrking med RAW 264,7 makrofager. Innen 6 timer, co-dyrking med RAW 264,7 makrofager fremmet en forbedret mesenchymale fenotype i CT26 celler, preget av mange lange membran utstikkere som utstrålte utover fra cellekroppen (fig. 2
A
). Denne morfologi ble opprettholdt i mer enn 12 timer, og var tydelig i alle CT26 celler i ko-kultur som var i kontakt med ett eller flere makrofager (Fig. 2
B
). For å bestemme minste tid for RAW 264.7 celler til å lokke fram CT26 morfologi endringer, målte vi kinetikken form for bevegelse (fig. 2
C
). Fra og med første adhesjon av celler til parabolen, ble de store og små akser av trekkende CT26 celler bestemmes hvert 20 min hele 12 timer med kultur med eller uten RAW 264.7 celler ved hjelp av et kammer lysbilde og konfokalmikroskopi. Som forventet, CT26 celler alene eller i co-kultur var effektivt runde ved første vedheft til parabolen med form indekser av ~ 1. CT26 celler inkubert med RAW 264.7 celler gjennomgikk hurtig celleforlengelse, som den store aksen langs de polariserte membran utvidelsene ble ~4 ganger lenger enn den minste akse så tidlig som 4 timer etter innledende celle adhesjon sammenlignet med celler dyrket i fravær av RAW 264,7 makrofager (fig. 2
C
). Formen endring nådd et platå på ~5.5 etter åtte timer med co-kultur. Som forventet, CT26 celler som ble dyrket alene oppviste også en innledende økning i form forlengelse som de klebet og spredning. Men i dette tilfelle er cellene bare utvidet korte fremspring og mislyktes i å forlenge seg betydelig, som formen indeksen bare nådde et maksimum på ca. 2 etter 6 timer med dyrking (Fig. 2
C
). Tatt sammen, kvantitativ analyse av CT26 celle migrasjon og morfologi dynamikk indikerer at RAW 264.7 makrofagene frembringe en rask og vedvarende økning i cellemigrering som er forbundet med økt dannelse av membranfremspring.
DsRed-CT26 (10
5 /ml) ble inkubert på fibronektin med GFP-RAW 264.7 (10
5 /ml), som angitt, i 15 timer ved 37 ° C. Fluorescent bildene ble anskaffet ved hjelp konfokalmikroskopi (20X) 4 bilder /hr. A) Tid løpet av Ds-Red-CT26 dynamikk over 12 timer når inkubert alene eller sammen med RAW 264,7-GFP makrofager. Bildene er representative for CT26 bevegelse over 3 separate eksperimenter. Forstørrelse skala bar representerer 20 mikrometer. B) Akkumulert CT26-DsRed distribusjon og utvekst etter 15 timers inkubasjon alene (høyre) eller med RAW 264,7-GFP makrofager (venstre og sentrum, med grønne kanalen slått av). Bildene er representative for 3 separate eksperimenter. Forstørrelse skala bar representerer 30 mikrometer. C) Formen indeks (hovedakse /lille aksen) av CT26 celler i nærvær eller fravær av RAW 264,7 celler ble sporet over 12 timer ved migrasjon. Dataene representerer gjennomsnittet ± SEM for 10 celler enn 3 separate eksperimenter.
RAW 264,7 makrofager og CT26 tumorceller Slipp Løselig Kjemotaktiske faktorer som fremmer gjensidig Chemotaxis
Vi neste undersøkt om induksjon av en invasiv fenotype i CT26 celler ved RAW 264.7 celler var på grunn av en direkte interaksjon med makrofager eller en respons til løselige kjemotaktiske faktorer utgitt av makrofager ved anvendelse av en standard Boyden kammer analyse [18]. CT26 celler demonstrerte en doseavhengig og robust kjemotaktiske respons mot en gradient av RAW 264,7 celle kondisjonert medium (CM), mens eksponering for å kontrollere basalmedium alene induserte ikke en vandrende respons (fig. 3
A
). Viktigere, cellemigrasjon var overveiende retnings mot konsentrasjonsgradienten, som tumor cellemigrasjon ble redusert med -60% når RAW 264,7 celle CM ble lagt jevnt til både topp og bunn kammer (Fig. 3
A
). Disse funnene tyder på at RAW 264.7 makrofager frigi løselige faktorer som fremmer retnings migrering av CT26 tykktarmskreftceller.
A) CT26 (10
5 /ml) ble tilsatt til den øvre av en Boyden kammer med RAW 264.7 kondisjonerte medier, kontrollbuffer eller fullstendig DMEM tilsatt til den nedre brønnen. CT26 ble tillatt å migrere i 3 timer ved 37 ° C før farging og kvantifisering av kjemotakse. Dataene representerer gjennomsnittet ± SEM for 15-30 tilfeldig utvalgte felt enn 3-6 separate forsøk. * Angir signifikans mellom 50% RAW CM og mediekontroll (p 0,001) og 50% RAW CM og 100% RAW CM topp /bunn (p 0,001). B) RAW 264.7 (10
5 /ml) ble tilsatt til den øvre brønnen i en Boyden kammer med CT26 kondisjonert medium, kontrollerer buffer eller fullstendig DMEM tilsatt til den nedre brønnen. RAW 264.7 ble tillatt å migrere i 24 timer ved 37 ° C før farging og kvantifisering av kjemotakse. Dataene representerer gjennomsnittet ± SEM for 15-30 tilfeldig utvalgte felt enn 3-6 separate forsøk. ** Betegner betydning mellom 25% CT26 CM og mediekontroll (p 0,001) og 25% CT26 CM og 100% CT26 CM topp /bunn (p 0,001). C) GFP-RAW 264.7 (10
5 /ml) ble inkubert på fibronektin belagt kammers objektglass med 10 pl kollagen dråper som inneholder ds-rød-CT26 (10
7 /ml) eller 10 um røde fluorescerende kuler (10
7 /ml). Makrofag invasjon inn i svulsten innstøpt eller innleiret vulst kollagen fallet ble fotografert etter 7 dager ved 10X ved konfokal mikroskopi. Side view og topp vise bilder er representative for den gjennomsnittlige makrofag respons over 6 kollagen svulster. Forstørrelse skala bar for beste vise bilder representerer 200 mikrometer. D) Grensesnittet mellom makrofager og kollagen svulst fallet ble fotografert ved hjelp av konfokal mikroskopi (20X) i 12 timer ved 4 rammer /t etter tilsetning av RAW 264,7 til kammeret lysbildet. I løpet av dette tidsrom ble dynamikken i makrofag migrerings kvantifisert ved å spore individuelle celle centroids ved 4 rammer /time. Makrofager initiere migrasjon innenfor 100 mikrometer av svulsten grensen (stiplet hvit linje) utviser gule spor. Makrofager initierende migrering enn 100 um av tumoren grense oppviser hvite spor. Bilde er representativ for den gjennomsnittlige makrofag respons til 6 separate kollagen tumorer. Forstørrelse skala bar representerer 30 mikrometer. E) Spor forskyvning og total sporlengde ble kvantifisert for makrofag migrasjon innenfor og utenfor 100 mikrometer av kollagen svulst grense. Dataene representerer gjennomsnittet ± SEM for 15 makrofager innenfor 100 nm og 15 makrofager utover 100 mikrometer av kollagen svulst grense. #denotes en betydelig forskjell i oppgraderingsveg forskyvning (p 0,05). ## Angir en signifikant forskjell i total migrering veilengde (p 0,0001)
RAW 264.7 makrofager oppviste en robust og doseavhengig kjemotaktiske respons på en gradient av CT26 celle CM (figur 3
B
). Faktisk, graden av cellevandring til ufortynnet CM var ~ 10-ganger større enn basalnivåer av migrasjon observert i respons til enten serumholdig medium eller migrering buffer inneholdende bare bovint serumalbumin. RAW 264,7 cellemigrasjon var svært retnings og ikke på grunn av tilfeldig chemokinetic bevegelse som legger CT26 CM til både øvre og nedre kammer fullstendig avskaffet migrasjon respons (Fig. 3
B
). Interessant, i motsetning til den ko-kultursystem hvor RAW 264.7 ikke utviste en økning i migreringen avstand eller forskyvning, gradienten av kjemotaktiske faktorer i Boyden kammer var tilstrekkelig bratt for å fremkalle robust kjemotakse av RAW 264,7 makrofager.
for ytterligere å undersøke makrofag kjemotaksis mot tumorceller, har vi utviklet en ny 3D-migrasjon analyse hvor CT26 celler ble innleiret i kollagen-gel og sted dråpevis på et dekkglass med RAW 264.7 celler fordelt jevnt langs omkretsen av gelmatriksen. Som vist på fig.
