Abstract
bakgrunner
Peritoneal invasjon i tykktarmskreft er en viktig prognostisk faktor. Peritoneal invasjon objektivt kan identifiseres som periotoneal elastisk laminær invasjon (ELI) ved hjelp av elastica flekken, og den kreft mikromiljøet som dannes av peritoneal invasjon (CMPI) kan også observeres. Saker med ELI vise oftere fjernmetastaser og gjentakelse. Derfor kan CMPI representere et bestemt miljø som muliggjør tumorprogresjon. Patologiske og biologiske undersøkelser i CMPI kan kaste lys over dette muligens særegne kreft mikromiljøet.
Metoder
analysert områdespesifikke microarray for å bestemme de patologiske trekk ved CMPI, og formert subperitoneal fibroblaster (solkrem ) og submukøse fibroblaster (SMFs) fra menneskelige colonic vev. Biologiske egenskaper og resultatene av genekspresjon profil analyser ble sammenlignet for å bedre forstå peritoneal invasjon av kreft i tykktarmen, og hvordan denne kan danne en spesiell mikromiljøet gjennom interaksjon med solkrem. Muse xenografttumorer, avledet av co-injeksjon av kreftceller med enten solkrem eller SMFs, ble etablert for å evaluere sin aktive rolle på tumorprogresjon og metastasering.
Resultater
Vi fant ut at fibrose med alfa glatt muskulatur aktin (α-SMA) uttrykk var en betydelig patologisk trekk ved CMPI. Forskjellene i spredning og genekspresjon profil analyser antydet solkrem og SMFs var distinkte populasjoner, og at solkrem var preget av en høyere uttrykk av ekstracellulære matriks (ECM) -associated gener. Videre sammenlignet med SMFs, solkrem viste mer variabel endring i genekspresjon etter kreft-celle-kondisjonert medium stimulering. Gene ontologi analyse viste at solkrem-spesifikke oppregulert gener ble beriket av aktin-bindende eller kontraktile assosierte gener inkludert α-SMA koding ACTA2. Mus xenograft tumorer avledet ved ko-injeksjon av kreftceller med solkrem viste forbedring av tumorvekst, metastase, og kapasiteten for tumordannelse sammenlignet med de som er avledet fra ko-injeksjon med cancerceller og SMFs.
Konklusjoner
CMPI er en spesiell mikromiljøet, og samspillet mellom solkrem og kreftceller innen CMPI fremme tumorvekst og metastase
Citation. Kojima M, Higuchi Y, Yokota M, Ishii G, Saito N, Aoyagi K, et al. (2014) Menneskelig Subperitoneal fibroblast og Cancer Cell Samhandling skaper mikromiljøet som fremhever tumorprogresjon og metastasering. PLoS ONE 9 (2): e88018. doi: 10,1371 /journal.pone.0088018
Redaktør: Soroku Yagihashi, Hirosaki Universitetet Graduate School of Medicine, Japan
mottatt: 27 september 2013; Godkjent: 02.01.2014; Publisert: 04.02.2014
Copyright: © 2014 Kojima et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av JSP KAKENHI stipend nummer 24590458, og et tilskudd av en tredje sikt Omfattende 10-års strategi for Cancer Control (23-A-3). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Selv om tumorstørrelse er en viktig prognostisk faktor i mange kreftformer, prognose i gastrointestinal kreft er lagdelt ikke av tumorstørrelse, men etter tumor spredning [1]. Peritoneal invasjonen i kolorektal kreft har blitt rapportert å være en sterk prognostisk faktor, men dette begrepet ble ikke godt definert og deteksjon og diagnose metoder har blitt avhørt [2] – [4]. Nyere patologiske rapporter har vist at elastica flekken, som fremhever peritoneal elastisk lamina nær periotoneal overflaten, er nyttig for objektiv påvisning av peritoneal invasjon. Vi og andre har bestemt at peritoneal invasjon definert som tumorinvasjon utover peritoneal elastisk lamina (elastisk laminær invasjon: ELI) er en sterk prognostisk faktor som kan påvirke fremtidige PT kriteriene i Union for International Cancer Control (UICC) TNM klassifikasjon [5] – [7]. Peritoneum er en meget tynn membran, innenfor 500 um tykt, og det peritoneale elastiske lamina eksisterer i denne membran. Hyppigheten av synkron metastaser og tilbakefall er økt med 2 til 4 ganger når en svulst invaderer den trange plassen [5]. Disse resultatene kan tyde på at tumorprogresjon og metastase er tilrettelagt av en kreft mikro dannet av peritoneal invasjon (CMPI). Graden av CMPI kan identifiseres ved hjelp av elastica flekken, og patologiske trekk ved CMPI kan også bestemmes.
A vev microarray muliggjør evaluering av protein ekspresjon for et stort antall vevsblokker fra én enkelt prøve, og områdespesifikke microarray har blitt rapportert å være nyttige for å studere bestemte tumor områder i store kullene [8]. Etter bestemmelse av CMPI ved hjelp elastica flekken, kan en vev kjerne hentes fra dette området, og en sammenligning med funksjonene i andre svulst områder kan også utføres. Denne prosessen kan gi rom for en vurdering av de viktigste biologiske fenomener som forekommer i denne kreftformen mikromiljøet.
Nylige fremskritt innen kreftforskning har etablert begrepet kreft mikromiljøet som fremmer startfasen, invasjon og metastasering [9]. Selv om kreft mikromiljøet er sammensatt av mange celletyper, kan bruken av områdespesifikke microarray gi rom for et fokus på cellekomponenter som karakteriserer CMPI. Videre, hvis disse cellekomponenter kan dyrkes fra histologisk tilsvar subperitoneal region, en biologisk studie for å belyse denne antatte kreftfremmende mikromiljøet kan utføres.
Formålet med denne studien var å forklare hvordan tykktarmskreft prognose påvirkes av peritoneal invasjon. Vi bygget areal-spesifikke vev microarray system for å bestemme karakteristiske cellekomponenter av CMPI. Neste, dyrket vi bestemte fibroblast subpopulasjoner fra submucosal og subperitoneal lag av den menneskelige kolon veggen. De biologiske egenskaper og gen-profiler av submukosale fibroblaster (SMFs) og subperitoneal fibroblaster (solkrem) med eller uten kreft-celle-kondisjonert medium (CCCM) stimulering ble sammenlignet. Deretter konstruerte vi xenografttumorer av co-injeksjon av kreftceller med enten solkrem eller SMFs. Vår studie foreslått en ny kandidat for en kreftfremmende mikromiljøet i tykktarmskreft og belyst solkrem som viktige aktører i forbedringen av tumorprogresjon og metastasering.
Pasienter og metoder
Etikk erklæringen
Denne studien ble godkjent av National Cancer Center Hospital East Institutional Review Board (No: 19-021). En skriftlig generelt samtykke til bruk av biologiske materialer for forskning ble innhentet fra hver deltaker før vev oppkjøpet. Dyreforsøk ble godkjent av dyreetikk komité i National Cancer Center Hospital East (K11-032).
Pasient Kjennetegn og Påvisning av ELI
Fire hundre påfølgende pasienter med TNM klassifikasjon (5
th edition) pT3 og pT4a tykktarmskreft [10], operert mellom 1996 og 2003 ved National Cancer Center Hospital East, ble inkludert. Ved hjelp elastica flekken, vi identifisert 173 tilfeller med ELI og videre undersøkt disse ved hjelp av områdespesifikke microarray [5], [8]. Av de 173 tilfellene med ELI, 107 var pT3 og 66 var pT4a.
Bygging av områdespesifikke microarray
For å belyse de patologiske trekk ved CMPI i tykktarm kreft vev, vi definerte kreft mikromiljøet som følger: (a) CMPI har en svulst grense med peritoneal invasjon og (b) den kreft mikromiljøet som dannes av submucosal invasjon (CMSI) har en submucosal invasive svulster grensen (figur 1A) [5]. Den to-punkts vev mikroarray ble deretter etablert som tidligere beskrevet [8]. Hver tumorområdet ble markert med blekk på histologiske lysbilde; et enkelt vev kjerne av 2 mm i diameter ble oppnådd fra hver kreft mikromiljø og overføres til en mottaker ved hjelp av en blokk Tissue Microarrayer (Azumaya, Tokyo, Japan). I 24 tilfeller ble utilstrekkelig cancer vev oppnådd fra CMPI. Imidlertid var tilstrekkelig vev oppnådd i 149 tilfeller; disse ble analysert histologisk og immunhistokjemisk (se materialer og metoder S1, og tabell S1).
(A) Schema av kreft mikromiljøet dannet av peritoneal invasjon (CMPI) og kreft mikromiljøet dannet av submucosal invasjon (CMSI) definert som (a) invasiv foran med peritoneal invasjon og (b) submucosal invasiv front, henholdsvis. (B) Fordelingen av fibrose i human colon cancer vev. Mørkegrå søylene viser antall saker med fibrose over 50% av kjernen fra hver tumorområdet, og lys grå søylene viser antall saker uten omfattende fibrose. Kjerneprøver med CMPI viste en høyere frekvens av merket fibrose enn gjorde kjerneprøver med CMSI (
P
0,01). (C) Fordeling av α-SMA-ekspresjon i humane colon cancer vev. CMPI viste høyere α-SMA uttrykk enn de som ses i CMSI (
P
0,01). (D) Fordeling av CD3-positive celler i human tykktarmskreft vev. Antall CD3-positive celler var ikke signifikant forskjellig mellom CMPI og CMSI. (E) Fordeling av CD68-positive celler i human tykktarmskreft vev. Antall CD68-positive celler var ikke signifikant forskjellig mellom CMPI og CMSI. (F) Fordeling av CD31-positive fartøy i human tykktarmskreft vev. Numrene på CD31-positive fartøyene var ikke signifikant forskjellig mellom CMPI og CMSI. Resultater i (B) er presentert av saksnummer, og de i (C-F) er presentert som gjennomsnitt ± SD av 149 tilfeller (**
P
0,01).
Antistoffer, Regents, og Immunohistochemistry
antistoffer, reagenser, og immunhistokjemiske prosedyrer som brukes er beskrevet i Materialer og metoder S1 og Tabell S2.
Evaluering av områdespesifikke Tissue microarray seksjoner
Høy oppløsning lysbildene ble kjøpt fra alle vev kjerner med hematoxylin-eosin (HE) og immunhistokjemi flekker, bruker NanoZoomer 2,0-HT lysbilde skanner (Hamamatsu Photonics, Hamamatsu, Japan). Alle kjerner ble undersøkt ved hjelp av visningsprogramvare (NDP syn: Hamamatsu Photonics, Hamamatsu, Japan). Når det området av fibrose oversteg 50% av en hel vev kjerne med en diameter på 2 mm H.E farging, ble det definert som positiv for markert fibrose. På immunhistokjemisk farging, hot spots med CD3-, CD31- og CD68-positive celler eller fartøy ble valgt i betrakteren programvare, så et bilde av x20 forstørrelse (0,51 mm
2) ble tatt, og lagres som en JPEG-fil . Positive celler eller fartøyer ble telt i hvert bilde ved hjelp morfometrisk programvare (WinRoof, Mitani Corporation, Fukui, Japan). Videre ble området med høyest alpha glatt muskel aktin (α-SMA) uttrykk i fibroblaster valgt, deretter en x20 forstørrelse (0,51 mm
2) Bildet ble tatt, og lagres som en JPEG-fil. Forholdet mellom det α-SMA-positive område i bildet ble beregnet ved anvendelse morfometrisk programvare, som tidligere beskrevet [11]. Den α-SMA-ekspresjon i normalt muskelvev, som bestemt ved sammenligning med en serie H.E lysbilde, ikke ble evaluert. HE og immunhistokjemisk farging data for CMPI ble sammenlignet med den for CMSI å belyse de histologiske karakteristika CMPI.
primærceller og cellelinjer
submukosale vev ble oppnådd fra colon sigmoideum vev mer enn 5 cm fjernt fra svulsten. Tarmvev ble dissekert fra muskellaget på luminal side, og lamina propria og slimhinnelags vev ble erholdt. Deretter ble lamina propria vaskes vekk for å oppnå submucosal vev. Subperitoneal vev ble oppnådd fra sigmoid kolon mesenteriet på mer enn 5 cm i avstand fra svulsten ved hjelp av drifts pinsett og sakser. Disse vev ble vasket med fosfat-bufret saltvann (PBS) og inkubert i 5% trypsin i 20 minutter 3 ganger. Supernatanten ble sentrifugert, belagt på en tallerken, og submukosale fibroblaster (SMFs) og subperitoneal fibroblaster (solkrem) ble oppnådd og deretter dyrket og opprettholdt i MF-medium (Toyobo, Tokyo, Japan) [12]. Alle forsøkene ble utført på celler innen 8 passeringer.
De humane tykktarmskreftcellelinjer DLD-1 og Caco-2 ble erholdt fra American Type Culture Collection og dyrkes i Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO, USA) inneholdende 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), og 10% føtalt bovint serum (FBS;. Gibco, Palo Alto, CA)
celleproliferasjonsanalyse, immunocytokjemisk Farging, og flowcytometri analyse
celleproliferasjon analyser, immunocytokjemisk flekker, og flowcytometri analyser ble utført som beskrevet i materialer og metoder S1.
Stimulering av fibroblaster ved Cancer Cell medium
å begynne med 1,7 x 10
4 /cm
2 av fibroblaster og DLD-1-celler ble dyrket separat i DMEM inneholdende 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin, og 10% FBS i 48 timer, og deretter ble sultet i 24 timer. Deretter ble mediet fjernet fra fibroblaster, og mediet fra de sultet DLD-1 celler ble tilsatt til de fibroblaster i 24 timer for å etablere fibroblaster med kreft-celle-kondisjonert medium (CCCM) stimulering. Som kontroll, ble fibroblaster sultet i 48 timer (noe som ga fibroblaster uten CCCM). Solkrem og SMFs enten med eller uten CCCM ble vurdert ved hjelp immunocytochemistry eller genekspresjonsanalyse. Som for evaluering av immunocytokjemisk α-SMA uttrykk, ble området med høyest α-SMA uttrykk valgt, deretter en x20 forstørrelse (0,51 mm
2) Bildet ble tatt, og lagres som en JPEG-fil. Forholdet mellom α-SMA positiv område i bildet ble beregnet ved hjelp morfometrisk programvare (WinRoof, Mitani Corporation, Fukui, Japan).
Gene Expression analyse ved hjelp av microarray
Tre sett med solkrem og SMFs , enten med eller uten CCCM, erholdt fra 3 forskjellige pasienter, ble anvendt i denne studien. Vi brukte Genechip Human Genome U133 Plus 2,0 arrays (Affymetrix, Santa Clara, CA). Målet cDNA ble generert fra 100 ng total-RNA ekstrahert fra hver prøve ved anvendelse av en 3′-IVT Express Kit (Affymetrix, Santa Clara, CA). Prosedyrene for target-hybridisering, vasking og farging for signalforsterkning ble utført i henhold til produsentens protokoller. Arrays ble skannet med en Gene Chip Scanner 3000 (Affymetrix, Santa Clara, CA), og intensiteten av hver funksjon av tabellen ble beregnet ved hjelp av Genechip Drifts Software, versjon 1.1.1 (Affymetrix, Santa Clara, CA). Den gjennomsnittlige intensitet ble standardisert til målet intensitet, som ble satt lik 1000, for pålitelig å sammenligne forskjellige matriser. Verdiene var log transformert og median sentrert. Den programmer GeneSpring (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) og Excel (Microsoft Corporation, Redmond, Washington) ble brukt til å utføre den numeriske analyser for genet utvalg.
Xenotransplantat Transplantasjon og tumordannelse Analyse
enten 1 × 10
6 menneskelige tykktarmskreftceller Caco-2 eller DLD-en alene, eller sammen med enten 1 × 10
6 solkrem eller SMFs, ble injisert subkutant (sc) på baksiden av SCID-mus (8 -12 ukers alder, Clea, Tokyo, Japan). Tumorvolumene ble beregnet ukentlig som tidligere beskrevet [13]. Mus injisert med Caco-2 alene, eller med enten solkrem eller SMFs ble avlivet etter 10 uker, og de som er injisert med DLD-1 alene eller sammen med enten solkrem eller SMFs ble drept etter 8 uker, og tumorvektene ble evaluert. For fjern metastatisk analyse, ble lungevevet og leveren fjernet og fiksert i 10% formalin, og for analyse av lymfeknutemetastase, hals og lyske fettvev ble også fjernet og fiksert; Alle vev ble undersøkt histologisk. Vi brukte 8 mus i hver gruppe.
Å belyse kapasitet på fibroblaster for å forbedre tumordannelse, serielle fortynninger av Caco-2 eller DLD-1 kreftceller ble lignende co-injisert med enten 1 × 10
6 SMFs eller solkrem. Svulstdannelse ble bedømt 4 uker etter injeksjonen. Vi brukte 4 mus for hver gruppe.
Statistical Analysis
X
2 test og Student
t
test ble brukt i vevet microarray analyse, celleproliferasjonsanalyse, xenograft transplantasjon, og tumordannelse assay. En
P
0,05 ble definert som statistisk signifikant. I microarray analyse, ble genuttrykk data analysert ved hjelp GeneSpring GX12 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Row data ble oppsummert ved hjelp MAS5 og normalisert ved log transformasjon og median sentrering for numeriske analyser for genet valg. For prinsipal komponent analyse (PCA), brukte vi probe sett som pålitelig ble målt og variert med tre ganger over det globale median i minst 2 prøver (ca 10%); Analysene ble utført ved hjelp av GeneSpring GX12. De forskjellig uttrykt probe sett som brukes i veiledet hierarkisk clustering ble valgt basert på
P
0,05 og fold endring (FC) 2.0.
P
verdier ble beregnet ved hjelp av en vei ANOVA med Benjamini og Hochberg FDR multippel testing korreksjon. Hierarkisk clustering med vekt gjennomsnittet kobling clustering ble utført ved hjelp Cluster og Utforsker programmer (Michael Eisen, Stanford University, genome-www.stanford.edu). Den funksjonelle annotering clustering av Gene ontologi berikelse analyse ble utført ved hjelp av DAVID programvare, med klassifiseringen stringens satt til «High», og de betydelige klynger ble valgt på grunnlag av en berikelse poengsum 2,0 og
P
0.01 (Fishers eksakte test etter Benjamini og Hochberg FDR multippel testing korreksjon) [14], [15].
Resultater
Histologiske Funksjoner av ELI
Ikke bare kreftceller, men også varianter av stromale celler som utgjør en tydelig kreft mikromiljøet, og noen fremme tumormetastase [9]. Først belyst vi betydelige histologiske trekk ved CMPI å belyse fenomener som forekommer i dette miljøet ved å benytte områdespesifikke microarray. De clinicopathological funksjonene i de 149 sakene som brukes er vist i tabell S1. På H.E farging, fant vi omfattende fibrose (over 50%) hyppigere hos CMPI enn det som ble sett i CMSI (figur 1B). Forholdet mellom α-SMA positive område i CMPI var også høyere enn det som sees i CMSI (figur 1C). Andelene av T-lymfocytter, makrofager, eller microvessels evaluert ved hjelp av CD3, CD68, eller CD31, henholdsvis, var ikke signifikant forskjellig mellom CMPI og CMSI (figur 1D-F). Både i CMPI og CMSI, lubben spindel-formet fibroblaster var viktig kilde til α-SMA uttrykk, og forholdet ble vellykket analysert ved hjelp morfometrisk programvare (figur 2A-D). Tatt i betraktning våre tidligere resultater, noe som indikerte at peritoneal invasjon definert ved ELI var nært knyttet til fjernmetastaser, hypotese vi at fibroblaster i subperitoneal lag kan være innblandet ikke bare i fremtredende fibrose og aktivering, men også i den tumor progresjon og metastasering. Vi bestemte oss for å isolere fibroblaster fra subperitoneal lag som histologisk samsvarer peritoneal invasjon. Fibroblaster fra submucosal lag ble anvendt som kontroller.
(A) Histologiske trekk ved stromal komponent av CMPI. Både i CMPI og kreft mikromiljøet dannet av submucosal invasjon (CMSI), lubben spindel-formet fibroblaster var viktige kilder til stroma. (B) Merket α-SMA uttrykk ble funnet i fibroblaster. (C) Høyere forstørrelse mer tydelig avslørt lubben spindel-formet fibroblaster. (D) Ved hjelp morfometrisk programvare, vi får registrert og analysert α-SMA uttrykk.
Isolering og karakterisering av dyrkede humane solkrem og SMFs
Ved første, vi evaluert den morfologiske og biologiske karakteristikker av solkrem og SMFs i en normal tilstand. Både dyrkede humane solkrem og SMFs viste lignende spindel-formet morfologiske egenskaper (figur S1 A-B). Solkrem og SMFs fra 3 pasienter kan dyrkes over 10 passasjer, med unntak av en SPF saken (data ikke vist). Immunocytokjemi og flowcytometri avslørte innhentet solkrem og SMFs var i samsvar med fibroblaster (Figur S1C-D). Vi fant svak α-SMA uttrykk i noen solkrem og SMFs. Doblings tid for solkrem og SMFs var 79,9 timer og 36,3 timer, henholdsvis, og veksten av SMFs var raskere enn for solkrem (
P
0,05), som foreslo en biologisk forskjell mellom solkrem og SMFs ( Figur S1E).
Gene Expression Profilering Sammenligning mellom solkrem og SMFs
å vurdere fenotypiske forskjeller mellom solkrem og SMFs, de genuttrykk profiler av fibroblaster med eller uten CCCM stimulering ble sammenlignet. PCA avslørt 4 forskjellige klynger, avhengig av deres opprinnelse og CCCM stimulering, som overvant individuell variasjon (figur 3A og B). Overvåket klyngeanalyse avslørte også 4 forskjellige klynger (Figur 3C). Dette indikerte den fenotypiske forskjellen i fibroblaster i colonic veggen. Og denne forskjell er avhengig av den histoanatomical sted. Videre reaksjonen til CCCM stimulering var også annerledes.
(A) Rød er microarray profil i SMFs med CCCM stimulering, er blå SMFs uten CCCM stimulering, grønn er solkrem med CCCM stimulering, og sølv er solkrem uten CCCM stimulering. Tre-dimensjonal representasjon av hovedkomponentanalyse (PCA) komponent 1, 2, og 3. (B) To-dimensjonal representasjon av PCA-komponenter 1 og 2 (øvre), og komponentene PCA 1 og 3 (nedre). Fibroblaster dannet uavhengige grupper, avhengig av histoanatomical stedet og tilstedeværelsen av CCCM stimulering. (C) tilsyn klyngeanalyse i fibroblaster også vist atskilte klynger avhengig histoanatomical stedet og tilstedeværelsen av CCCM stimulering. (D) Gene ontologi analyse av oppregulert gener i solkrem sammenlignet med SMFs. (E) Gene ontologi analyse av gener oppregulert i solkrem med CCCM stimulering, sammenlignet med SMFs med CCCM stimulering. De fleste av gener med økt uttrykk i solkrem ble beholdt etter CCCM stimulering; Men var det noen forskjeller, og rekkefølgen på merknads klynger ble endret etter CCCM stimulering.
Deretter sammenlignet vi genuttrykk profiler i disse fibroblaster med og uten CCCM stimulering, separat (Figur 3D-E ). Data fra solkrem uten CCCM stimulering ble beriket av genet ontologi (GO) begrepene «ekstracellulære matrix» og «protein ekstracellulære matrix», som dannet annotering klynge 1. Major expracellular matrix (ECM) komponenter av kollagen (COL1A1, COL4A1, COL4A2, COL5A1 og COL16A1), laminin eller fibronectin ble inkludert i denne klyngen. Videre genuttrykk relatert til komponenter som binder seg til ECM ble også oppregulert i solkrem og dannet merknad klynge 2. Kommentar klynge 3 ble beriket for GO vilkår knyttet til «granulater» eller «blemmer» (Figur 3D og Tabell S3). Dette resultatet foreslo genuttrykk profilen forbundet med grunnleggende funksjon i fibroblaster er forskjellig mellom solkrem og SMFs innenfor colonic veggen. De 20 beste genene sterkt uttrykt i solkrem også inkluderte flere ECM-komponenter. Gener assosiert med fibrogenese eller myofibroblastic differensiering av FLI1 og NOX4 ble også funnet i de 20 beste gener (tabell S4). Blant andre sterkt uttrykte gener i solkrem uten CCCM stimulering, har vi funnet pos.-, SPARC-, eller COL4A1, som er kjent for å være sterkt uttrykt i kreft stroma; og mange av disse er prognostiske faktorer [11], [16], [17]
De fleste av de gener med økte uttrykk i solkrem uten CCCM stimulering ble også beholdt i nærvær av CCCM stimulering.; Men var det noen forskjeller (figur 3D-E, tabell S5-6). I GO analyse av solkrem med CCCM stimulering, ble rekkefølgen på merknads klynger endret i forhold til det man ser i solkrem uten CCCM stimulering. Blant de 20 beste genene, ble 13 gener bevares og 7 genene ble erstattet. Disse resultatene tyder på en forskjell i reaksjonen til CCCM stimulering mellom solkrem og SMFs. Eksistensen av solkrem-spesifikke gener som er oppregulert etter CCCM stimulering ble anslått.
Vi deretter analysert disse genene til å etablere de biologiske egenskapene til solkrem etter eksponering for CCCM. En Venn-diagram avdekket 193 oppregulert gener i solkrem og 59 i SMFs etter CCCM stimulering. Av disse ble 51 vanligvis oppregulert både i solkrem og SMFs, 142 var solkrem bestemt, og bare 8 var SMFs spesifikke (Figur 4A). Vi så også fokusert på downregulated gener, og oppdaget 215 i solkrem og 146 i SMFs. Av disse ble 138 ofte nedregulert både i solkrem og SMFs, 77 var solkrem bestemt, og bare 8 var SMFs bestemt (figur 4B). Disse resultatene antydet at solkrem viste mer variabel endring i genekspresjon etter CCCM stimulering. GO sikt analyse av SPF-spesifikke gener nedregulert etter CCCM stimulering ikke avdekket noen merknad klynge løpet 3.0 av berikelse score (data ikke vist). I motsetning til dette, GO sikt analyse av solkrem-spesifikke gener oppregulert etter CCCM stimulering viste at begreper som «aktinbinding», «cytoskeletal bindende protein», «kontraktile fiber», «LIM domene», «kontraktile fiber del», «sarcomere» og «myofibril» dannet merknad klynge 1-3 (figur 4C). De fleste av disse genene var kjent for å være relatert til celle sammentrekning. Blant de 20 beste genene var mange cytoskeletal eller kontraktilitet forbundet gener. Overraskende, ACTA2 som koder for α-SMA ble oppregulert spesielt i solkrem etter CCCM stimulering (figur 4D). Dette resultatet ble bekreftet ved immunocytokjemi (figur 4E-F). Morfometrisk analyse i immunocytokjemisk uttrykk avslørte at α-SMA uttrykk ble oppregulert spesielt og betydelig i solkrem etter CCCM stimulering i proteinnivå (Figur S2,
P
0,05). Variabel oppregulering og nedregulering av gener etter CCCM stimulering var et vesentlig trekk i solkrem. ACTA2 koding α-SMA ble inkludert i denne solkrem spesifikke oppregulert gen sett. Kreft assosiert fibroblaster (kafeer) og består av α-SMA-positive aktivert myofibroblasts. Sammen med resultatet av områdespesifikke microarray, merket α-SMA-ekspresjon i CMPI er avhengig av det følsomme karakteren av solkrem som kan være forbundet med forskjellen i kreft mikromiljøet.
(A) Genes oppregulert ved CCCM stimulering . (B) Gener nedregulert ved CCCM stimulering. (C) Topp 3 merknads klynger i genet ontologi analyse av solkrem-spesifikke gener oppregulert ved CCCM stimulering. (D) Topp 20 gener oppregulert spesielt i solkrem etter CCCM stimulering. (E) immunocytokjemisk α-SMA uttrykk i SMFs etter CCCM stimulering. (F) immunocytokjemisk α-SMA uttrykk i solkrem etter CCCM stimulering. α-SMA uttrykk ble oppregulert spesielt i solkrem etter CCCM stimulering (se også figur S2).
solkrem Forbedre tumorvekst, metastaser og tumordannelse Evne sterkere enn gjør SMFs
Å belyse de funksjonelle forskjeller i fibroblaster i colonic veggen, injisert vi menneskelige tykktarmskreft cellelinjer Caco-2 eller DLD-1 fm, alene, eller sammen med enten solkrem eller SMFs, i SCID-mus. Ved 7 uker etter injeksjonen, alle musene demonstrerte tumordannelse. Veksten av tumorer som oppstår fra kreftceller injisert sammen med solkrem vokste hurtigere enn det som oppstår ved injeksjon av kreftceller alene eller ko-injeksjon med SMFs (figur 5A). De endelige vekter av svulster som oppstår fra kreftceller co-injisert med solkrem var også større enn de som oppstår ved injeksjon av kreftceller alene eller fra co-injeksjon med SMFs (figur 5B). Selv om forskjellen ikke var statistisk signifikant, tumorer som oppstår ved ko-injeksjon av DLD-1-celler med solkrem oftere resulterte i lymfeknutemetastase enn gjorde de som dannes fra den ko-injeksjon av DLD-1 celler med SMFs (figur 5C).
(A, venstre) Xenotransplantat tumorvekst i mus injisert med DLD-1 menneskelige tykktarmskreftceller alene (blå linje, 840.7 ± 112,6 mm
3 i 7 uker), co-injisert med DLD-en celler og submukøse fibroblaster (SMFs, rød linje, 1178.0 ± 177,6 mm
3 i 7 uker), og co-injisert med DLD-1 celler og subperitoneal fibroblaster (solkrem, grønn linje, 1672.8 ± 214,7 mm
3 i 7 uker). Forskjellene i tumorvolumet mellom DLD-1 celler alene og DLD-1 celler med solkrem, og mellom DLD-1 celler alene og DLD-1 celler med SMFs var statistisk signifikant (
P
0,05). (A, høyre) Xenotransplantat tumorvekst i mus injisert med Caco-2 menneskelige tykktarmskreftceller alene (blå linje, 308,6 ± 127,7 mm
3 i 9 uker), co-injisert med Caco-2 celler og SMFs (rød linje , 1363.1 ± 284,3 mm
3 i 9 uker), og co-injisert med Caco-2 og solkrem (grønn linje, 2595.1 ± 349,5 mm
3 i 9 uker). Forskjellene i tumorvolumet mellom Caco-2 celler alene og Caco-2 celler med solkrem (
P
0,01), og mellom Caco-2 celler med SMFs og Caco-2 celler med solkrem (
P
0,05) var statistisk signifikant. Xenografttumorer avledet fra co-injeksjon av kreftceller og solkrem vokste raskere enn de som stammer fra injeksjon av kreftceller alene, eller co-injeksjon av kreftceller og SMFs. (B, venstre) Xenotransplantat tumorvekt hos mus injisert med DLD-1 celler alene var 0,71 ± 0,11 g, co-injisert med DLD-1 celler og SMFs var 1,27 ± 0,19 g, og co-injisert med DLD-1 celler og solkrem var 1,82 ± 0,28 g i 8 uker. Forskjellene i tumorvekt mellom DLD-1 celler alene og DLD-1 celler med solkrem (
P
0,01), og mellom DLD-1 celler alene og DLD-1 celler med SMFs (
P
0,05) var statistisk signifikant. (B, høyre) Xenotransplantat tumorvekt hos mus injisert med Caco-2 celler alene var 0,53 ± 0,24 g, co-injisert med Caco-2 celler og SMFs var 1,91 ± 0,34 g, og co-injisert med Caco-2 celler og solkrem var 3,66 ± 0,45 g i 10 uker. Forskjellene i tumorvekt mellom DLD-1 celler alene og DLD-1 celler med solkrem (
P
0,01), mellom DLD-1 celler alene og DLD-1 celler med SMFs (
P
0,05), og mellom DLD-1 celler med solkrem og DLD-1 celler med SMFs (
P
0,05) var statistisk signifikant. Vekter på xenograft tumorer avledet fra ko-injeksjon av kreftceller med solkrem var høyere enn de i tumorer avledet fra injeksjon av kreftceller alene, eller ko-injeksjon av kreftceller og SMFs (venstre: DLD-1, til høyre: Caco-2) . (C) Selv verdien nådde ikke statistisk signifikans, xenografttumorer avledet fra co-injeksjon av DLD-1 celler og solkrem viste det dobbelte av frekvensen av lymfeknutemetastase (n = 4) sammenlignet med dem som stammer fra co-injeksjon av DLD- 1 celler og SMFs (n = 2).
