Abstract
Bakgrunn
KIAA0101 er et prolifererende cell nuclear antigen-forbundet faktor som er overuttrykt i noen menneskelige kreftformer. Adrenokortikal svulst er en av de mest vanlige humane neoplasmaer hvor de molekylære årsaker er dårlig forstått. Dessuten er det vanskelig å skille mellom lokalisert benigne og maligne tumorer binyrebark. Av disse grunner, studerte vi uttrykket, funksjon og mulig mekanisme for feilregulering av KIAA0101 i menneskelig adrenocortical svulst.
Metodikk /hovedfunnene
KIAA0101 mRNA og protein uttrykk nivåer ble bestemt i 112 adrenokortikal vev prøvene (21 normal adrenal cortex, 80 benigne binyrebark svulster, og 11 adrenokortikal karsinom (ACC). siRNA knockdown ble anvendt for å bestemme den funksjonelle rollen til KIAA0101 på celleproliferasjon, cellesyklus, apoptose, bløt agar forankringsuavhengig vekst og invasjon i ACC . cellelinje NCI-H295R i tillegg utforsket vi mekanismen for KIAA0101 dysregulering ved å undersøke den mutasjonsstatus KIAA0101 mRNA (9,7 ganger) og protein ekspresjon var signifikant høyere i ACC (p 0,0001).. KIAA0101 hadde sparsom protein ekspresjon i bare noen normale binyrebarken prøver, som ble begrenset til binyrebark stamceller. KIAA0101 uttrykk nivåer var 84% nøyaktig for å skille mellom ACC og normale og godartede binyrebark tumorprøver. Knockdown av KIAA0101 genekspresjon betydelig redusert forankringsuavhengig vekst med 80% og invasjon med 60% (p = 0,001; p = 0,006). Vi fant ingen mutasjoner i KIAA0101 i ACC.
Konklusjon /Betydning
KIAA0101 er overuttrykt i ACC. Våre data støtter at KIAA0101 er en markør for celleproliferasjon, fremmer vekst og invasjon, og er en god diagnostisk markør for å skille benign fra ondartet adrenocortical svulst
Citation. Jain M, Zhang L, Patterson EE, Kebebew E (2011) KIAA0101 Er uttrykt, og fremmer vekst og invasjon i Adrenal Cancer. PLoS ONE 6 (11): e26866. doi: 10,1371 /journal.pone.0026866
Redaktør: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., USA
mottatt: 10 juni 2011; Godkjent: 05.10.2011; Publisert: 11.11.2011
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av egenutført Research Program, Senter for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Adrenal svulster er en av de vanligste menneskelige svulster, ofte oppdaget forresten [1]. De fleste adrenal svulster er godartede, men det er ofte vanskelig å utelukke en ondartet svulst som adrenokortikal karsinom. Adrenocortical karsinom (ACC) er en sjelden kreft av binyrebarken med en dårlig forstått mekanisme for utvikling, og en forferdelig kamp pasient utfall på grunn av mangel på effektiv behandling [2]. Den årlige Forekomsten av ACC er omtrent 1-2 tilfeller pr million [3], [4], [5]. Komplett kirurgisk fjerning er den eneste mulige kurative terapi, men over to tredjedeler av pasientene stede med metastatisk sykdom og til og med de pasienter som har komplett reseksjon utvikle tilbakevendende sykdom i over 50% av tilfellene [2], [6]. Pasienter med metastatisk sykdom har en fem-års overlevelse på mindre enn 10%, og de med tilbakevendende sykdom har en fem-års overlevelse på bare 50% [2], [6].
ACC kan være forbundet med arvelige kreftsyndromer som Beckwith-Wiedemann syndrom (assosiert med kimcellelinje 11p15 kromosom endringer som fører til
IGF2
overekspresjon, OMIM # 130650), Li-Fraumeni syndrom (
TP53
mutasjon, OMIM # 151623) , multippel endokrin neoplasi type 1 (mutasjoner i menin tumorsuppressorgenet, OMIM # 131100), og Gardner syndrom (
APC
mutasjon, OMIM # 175100). De genetiske endringer knyttet til arvelige kreftsyndromer har gitt viktig informasjon om mulige molekylære mekanismene som er involvert i ACC. Men de fleste tilfeller av ACC er sporadisk, og de molekylære hendelser som fører til initiering og progresjon av binyrebark svulster fortsatt uklare.
Genome-wide genuttrykk profilering gir viktig innsikt i de molekylære stier som er feilregulert i kreft og kan være involvert i startfasen og progresjon. Siden den molekylære mekanisme av adrenokortikal karsinogenese er dårlig forstått, har cDNA mikroarray-analyse av binyrebark tumorer blitt anvendt for å åpenbare gener hvis misexpression er forbundet med ACC [7], [8], [9], [10], [11]. Blant de genene som ble funnet å være oppregulert i ACC, KIAA0101 (også kjent som L5, PAF, OEATC1, NS5ATP9, OEATC-1, p15) er en roman diagnostisk og prognostisk markør, og målet for ACC terapi. KIAA0101 koder for et voksende cell nuclear antigen (PCNA) -associated faktor med en ukjent funksjon. KIAA0101 er overuttrykt i humane ondartede sykdommer slik som lever og pankreatisk karsinom [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21 ], [22]. Det er imidlertid uklart rolle KIAA0101 i kreft og den mekanisme som fører til feilregulert ekspresjon av KIAA0101.
I denne studien vi opp disse problemene og viste at KIAA0101 er overuttrykt i ACC og en markør av cellulær proliferasjon. Videre reduserer KIAA0101 uttrykk i ACC resultert i vekst undertrykkelse og invasjon som tyder på at KIAA0101 spiller en onkogen rolle i ACC.
Metoder
Vevsprøver
The National Cancer Institute Review Board godkjent dette forskningsprotokoll etter informert skriftlig samtykke ble innhentet fra alle deltakerne. Adrenal vev ble hurtigfrosset ved tidspunktet for kirurgi og lagret ved -80 ° C. I denne studien ble 112 humane binyrebark vevsprøver analysert inkludert 21 normale vev, adrenokortikale 80 godartede tumorer, adrenokortikale og 11 primær binyrebark karsinomer (78 av de godartede svulster binyrebark og 11 av de primære binyrebark karsinomer ble tidligere analysert) [11]. Et uavhengig sett av ACC-metastaser (n = 29) og gjentagelse (n = 2) ble også anvendt for validering. Diagnosen utvetydig ACC og godartet adrenocortical svulst ble bekreftet i alle tilfeller ved histologisk undersøkelse og klinisk oppfølging. Den gjennomsnittlige oppfølgingstiden var 26,3 måneder for pasienter med godartede binyrebark svulster og 44,4 måneder for pasienter med ACC.
Cell kultur
NCI-H295R ACC cellelinje (ATCC, Rockville, MD ) ble dyrket og opprettholdt i DMEM supplert med 1% ITS + Premiks (BD Biosciences, San Jose, CA), 2.5% Nu-serum i (BD Biosciences), og 10.000 U /ml penicillin /streptomycin i en standard fuktet inkubator ved 37 ° C i en 5% CO
2 atmosfære. Tjuefire timer etter at cellene ble sådd ut i 24 og 6-brønners plater (4 x 10
^ 4-celler i 0,5 ml og 1,6 x 10
^ 5-celler i 2 ml), ble celler transfektert med et ikke-spesifikk negativ kontroll siRNA og med en spesifikk KIAA0101 siRNA ved en sluttkonsentrasjon på 40 og 80 nM (AM4636 og AM46235, henholdsvis, Applied Biosystems, Foster City, CA). Transit siQuest reagens (Mirus Bio, LLC) ble brukt til å levere siRNA til cellene i henhold til produsentens instruksjoner. Knockdown effektivitet var lik for 40 og 80 nM. Alle in vitro analyser ble gjort med både 40 og 80 nM konsentrasjon av KIAA0101 spesifikke siRNAs og uspesifikke negativ kontroll.
RNA og protein Forberedelse
RNA ble isolert ved hjelp av TRIzol reagens følge produsentens instruksjoner ( Invitrogen Inc., Carlsbad, California). RNA kvantitet og kvalitet ble vurdert ved hjelp av Nanodrop (Nanodrop Technologies, Inc., Thermo Fischer) og Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA), henholdsvis.
RIPA buffer ble brukt til å forberede vev lysatene og hele cellelysat ble utarbeidet med 1% SDS pluss 10 mM Tris [pH 7,5] buffer. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved anvendelse av BioRad RC DC-proteinanalyse (Hercules, CA).
Sanntids kvantitativ revers-transkripsjon polymerasekjedereaksjon (RT-PCR)
Total-RNA (125 ng) ble reverstranskribert ved å bruke RT-skriptet cDNA syntese kit (USB Corporation, Cleveland, OH). Sanntids kvantitativ PCR ble anvendt for å måle mRNA-ekspresjonsnivåene i forhold til glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) mRNA-ekspresjon. Normalisert genuttrykk nivå = 2
– (Ct
av genet av interesse – Ct
av GAPDH) × 100%, hvor C
t er PCR syklus terskel. PCR-primere og prober for KIAA0101 (Hs00207134_m1) og GAPDH (Hs99999905_m1) ble oppnådd fra Applied Biosystems (analyse-on-Demand Kit®, Foster City, California). Alle PCR-reaksjoner ble utført i et sluttvolum på 20 pl med 1 pl av cDNA templat på en ABI PRISM®7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems). PCR thermal cycler tilstand var 95 ° C i 12 minutter etterfulgt av 40 sykluser av 95 ° C i 15 sekunder og 60 ° C i 1 minutt. Alle forsøk ble utført in triplo og gjentatt tre ganger.
Western blot-analyse
Proteinprøver (40 ug) ble separert i 4% til 20% SDS-PAGE-gel og overført til en nitrocellulosemembran (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Western blotting ble utført etter standard prosedyrer ved hjelp av muse monoklonale antistoffer, anti-KIAA0101 (Abcam, ab56773) på 1:100 fortynning og anti-β-aktin (sc-81178, Santa Cruz Biotechnology Inc, Santa Cruz, CA) på 1: 2000 fortynning. Signal deteksjon ble utført ved hjelp av HRP-konjugert sekundært antistoff og en forbedret kjemiluminescens (Amersham Pharmacia Biotech).
Immunhistokjemisk (IHC) og Immuunofluoroscence flekker
tumorvev ble formalinfiksert, i parafin, og 5 mikron tykke seksjoner ble kuttet for farging. Seksjoner ble inkubert med det primære anti-KIAA0101 mus-monoklonalt antistoff ved fortynning 1:300 over natten ved 4 ° C (Abcam; ab56773) etterfulgt av biotinylert sekundært antistoff i 1 time ved romtemperatur (1:150; Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Snittene ble utviklet ved hjelp av 3,3′-diaminobenzidin DAB som kromogen (ABC elite kit, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) og hematoxylin som counterstain. Seksjonene ble rehydrert og montert med vectamount montering medium (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Glassene ble skannet i Olympus lysmikroskop (Nikon, Tokyo, Japan) og bildene ble tatt på 20X og 40X forstørrelse. En semikvantitativ scoring system ble brukt til å analysere KIAA0101 uttrykk; Ekspresjonsnivået var klassifisert som ingen farging (0), 30% av cellene farging (1), 30-50%-celler (2), og 50% av cellene. To observatører, som ble blindet av tumortype, uavhengig scoret hver prøve. Poengene ble i gjennomsnitt for å få den endelige KIAA0101 uttrykk poengsum
Immuunofluoroscence farging ble gjort ved hjelp av primære anti-KIAA0101mouse monoklonalt antistoff ved 1:300 fortynning over natten. (Abcam; ab 56773) og kanin anti-SF-1 (Millipore ; 07-618, 2 ug /ml) ved 4 ° C. De primære antistoffer ble detektert med fluorofor konjugert med RedTX anti-kanin-IgG (Invitrogen, Carlsbad, CA) og FITC-anti-mus IgG sekundære antistoffer (Vector Laboratories). Platene ble deretter skylt og montert med DAPI (4 «, 6-diamidino-2-fenylindol) monteringsløsning. Bilder ble analysert med et Zeiss Axioskop-2 mikroskop på 20X og 40X forstørrelse.
DNA Purification
Genomisk DNA ble isolert fra 1 mg av tumor og normale prøver ved hjelp av QIAamp DNA Blood Mini Kit ( Qiagen, Hilden, Tyskland), eluert i et totalt volum på 200 ul og lagret ved -20 ° C. DNA-konsentrasjoner ble målt ved UV-absorbans ved hjelp av Nanodrop (Nanodrop Technologies, Inc., Thermo Fischer).
Sekvense KIAA0101 kode omegn
KIAA0101 eksoner 1, 2, 3 og 4 ble sekvensert. PCR-primere ble utformet for kodende region ved hjelp UCSC genom nettleser, Primer 3 integrert programvare. Primersekvensene er oppført i Tabell 1. Primere ble gjort av IDT, Inc. (Coralville, IA). Eksoner 1, 2, 3 og 4 ble amplifisert som tre separate reaksjoner på 50 ul ved hjelp av PCR masterblanding (Fermentas Inc. USA). Standard PCR-betingelsene var innledende denaturering ved 95 ° C i 5 minutter etterfulgt av 30 sykluser med denaturering ved 95 ° C i 5 minutter, annealing ved 50 ° C i 1 min, forlengelse ved 72 ° C i 1 minutt og endelig forlengelse ved 72 ° C i 10 min. PCR-produkter ble visualisert på 2% agarose-gel. Produktene ble renset ved anvendelse av standard ekso-nuklease I og FastAP (Fermentas Inc.). Purified PCR produktene ble sekvensert ved hjelp av ABI sequencer 3730xl med stor fargestoff metode (DNA Sekvense kit, stor dye terminator syklus-sekvensering, Applied Biosystems). Mutasjoner ble analysert av Mutation Surveyor V 3.3 Programme (Soft Genetics, www.softgenetics.com). Alle de sekvense data har blitt deponert i GenBank.
Celleproliferasjon
Cellene ble sådd i en 96-brønns plate ved en konsentrasjon på 5 x 10
^ 3 cellene per 100 mL kulturmedium i seks paralleller. Ved hver endepunktet ble mediet aspirert fra brønnen, og cellene ble umiddelbart frosset ved -80 ° C i 24 timer. Platene ble tint ved romtemperatur, og forberedt for celle nummer kvantifisering ved hjelp av CyQUANT ™ analysesettet (Invitrogen, Carlsbad, CA). Den CyQuant Analysen ble utført i henhold til produsentens anvisninger, og analysert på en fluorometrisk mikroplateleser (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) ved 480 nm /520 nm.
Flowcytometri og apoptose analyser
KIAA0101 og negativ kontroll siRNA behandlede celler ble høstet, etanol-fiksert over natten ved 4 ° C og resuspendert i 1 x PBS til en konsentrasjon på 1 x 10
^ 6 celler /ml. Celler ble behandlet med DNase-fri RNase (100 ug /ml) i 20 minutter ved 37 ° C. Cellene ble farget med propidiumjodid ved konsentrasjon på 50 ug /ml og prøver ble lagret ved 4 ° C. Flowcytometrisk analyse ble utført på en Becton Dickinson FACScan (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Datafiler ble generert for 20.000 hendelser (celler) ved hjelp av Cellquest programvare. Den fraksjon av den totale cellepopulasjon er tilstede i hver av G1, S og G2 /M-celle syklusfaser ble oppnådd fra ModFit LT-programvare (Verity Software House, Inc.). Apoptose analyse ble utført ved hjelp av Annexin V farging (ApoAlert® Annexin V apoptose Kit) i henhold til produsentens instruksjoner (Clontech, Mountain View, California).
Soft agar forankringsuavhengig vekst analysen
To- lagdelte mykagar ble utført i seks-brønns plater. Den nederste laget av agar (2 ml /brønn) inneholdt 0,5% agar (Difco Noble Agar, Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD) i vedlikehold medium. Fem dager etter siRNA transfeksjon ble cellene trypsinert, telles og 50.000 celler ble blandet med 1,3 ml av toppagar løsning supplert med 10% Nu-serum (0,3% agar i kulturmedium). Størknet agar ble overlagt med 1 ml kulturmedium som inneholdt 10% Nu-serum. Platene ble dyrket ved 37 ° C i 5% CO
2, og mediet ble skiftet to ganger i uken. Etter 16 dagers dyrking, ble cellekolonier farget med 0,2% krystallfiolett-løsning og undersøkt ved mikroskopi. Kolonier ble talt i 5 forskjellige felt per brønn og bekreftet av TotalLab Quant v11 programvare (https://www.totallab.com/).
Cell invasjon analysen
Omfanget av celle invasjon var vurderes bruk av BD BioCoat ™ Matrigel ™ Invasion Chamber (BD Biosciences, Bedford, MA), i henhold til produsentens protokoll. Totalt 1 x 10
^ 5-celler ble sådd ut på innsatsene (8-um pore størrelse polykarbonatmembran) belagt med et tynt lag av Matrigel basalmembran Matrix (BD Biosciences). Innsatsene ble plassert i en 24-brønners plate med 10% serum-inneholdende kulturmedium eller medium uten serum. Platene ble inkubert i 48 timer ved 37 ° C. Celler som invaderte Matrigel matrise til den nedre overflate av membranen ble fiksert og farget med Diff Quik Stain (Dade Behring, Newark, DE, USA) og tellet under et lysmikroskop. Fire felt i fire separate kvadranter av hver membran ble talt og i gjennomsnitt.
Statistiske analyser
Den kontinuerlige data ble representert som gjennomsnitt ± standardavvik (S.D.). To-tailed ANOVA multi-sammenligning
t
-test ble brukt for å vurdere forskjellen mellom gjennomsnittlig uttrykk blant vanlige, godartede og ondartede prøver. Pearson korrelasjon test ble anvendt for kontinuerlige data. En
p
-verdi 0,05 ble betraktet som signifikant. Analysen ble utført av Stat Vis 5.0 (Cary, NC) og SPSS v 16,0 (Chicago, Illinois) statistiske programvare.
Resultater
KIAA0101 mRNA og protein er sterkt uttrykt i adrenocortical svulst
uttrykk for KIAA0101 mRNA var signifikant høyere i ACC i forhold til normal adrenocortical vev og godartede binyrebark svulster (12 ganger høyere enn normalt og ni ganger høyere enn i godartede svulster, p 0,0001) (Figur 1a). I tillegg KIAA0101 mRNA uttrykk Nivået var lavere i metastatiske og tilbakevendende svulster i forhold til primær ACC (p 0,001)
A) KIAA0101 mRNA uttrykk i normal binyrebarken (n = 21), godartede binyrebark svulster (N = 80), ACC (N = 10), metastatisk og tilbakevendende ACC (n = 30), og NCI-H295R cellelinje. KIAA0101 mRNA-ekspresjon nivå ble bestemt ved kvantitativ RT-PCR og normalisert til GAPDH mRNA-ekspresjon. Kolonner representerer gjennomsnitt ± standardavvik på replikere bestemmelser. Statistisk signifikant forskjell er angitt med en stjerne (*) (s 0,05, Kruskal Wallis test). Primær ACC vs. normal (p 0,0001), primær ACC vs. godartede binyrebark svulster (p 0,0001) og primær ACC vs. metastaser (p 0,0001). B) ROC kurve analyse for KIAA0101 mRNA uttrykk. Mottakeren drift karakteristikk (ROC) er avbildet på grafen ved hjelp av RT PCR ekspresjonsdata av KIAA0101 normalisert til GAPDH i normal binyrebarken (n = 21), godartet adrenokortiske tumorer (n = 80), ACC (n = 10). Arealet under kurven (AUC) var 0,78. En perfekt diagnostisk markør uten falske-negative eller falske-positive ville ha en AUC på 1. C) KIAA0101 protein uttrykk i ACC. KIAA0101 protein uttrykk nivåer i normal adrenal cortex (n = 5), benigne (n = 13), og maligne tumorer binyrebark (n = 3), som vist i representativ Western blot med KIAA0101 spesifikke og p-aktin kontrollantistoffer. p-aktin-signalet ble brukt som en kontroll for protein lasting. C = ACC, B = godartet adrenocortical svulst, og N = normal binyrebarken. D) Scatter tomt på KIAA0101 mRNA og protein uttrykk nivå i normale, godartede og ondartede binyrebark vevsprøver. Y-aksen viser normalisert mRNA ekspresjon ved kvantitativ RT-PCR og X-aksen viser proteinekspresjon nivå i den samme prøven basert på båndet densitometri måling normalisert til p aktin ekspresjonsnivå. Spearmen korrelasjonskoeffisient (r) = 0,61, p 0,001. E) Immunhistokjemi for KIAA0101 protein uttrykk i normal adrenocortical vev, godartede svulster og ACC. Representative bilder vises for hver kategori på 20X forstørrelse. Pilen angir det positive nukleær farging for KIAA0101. I normale vevsprøver, var bare subcupsular regionen positive. F) KIAA0101 cellulær lokalisering ble analysert ved immunoflouroscence. Kjerner ble farget med DAPI (blå), indikerer rød farge KIAA0101 uttrykk. Representative bilder fra ondartet ACC og normale prøver er vist på 20X forstørrelse.
Gitt den betydelige uttrykk forskjell i mRNA mellom godartede og ondartede svulster, var vi interessert i å vurdere om KIAA0101 var en nøyaktig diagnose prediktor for svulst type. KIAA0101 uttrykk var 84% nøyaktig for å skille mellom ACC og normale og godartede binyrebark tumorprøver (antall sanne positive og negative resultater dividert med det totale utvalget ved å dra et cutoff nivå på 1,5). Arealet under mottageroperatøren karakteristikk (ROC) kurve (AUC) var 0,78 for KIAA0101 mRNA ekspresjon (figur 1B), 0,79 til tumorstørrelse, og 0,85 for kombinasjonen av KIAA0101 ekspresjon og tumorstørrelse.
I tillegg til høy mRNA uttrykk, KIAA0101 protein uttrykk ble også forhøyet i ACC i forhold til normal binyrebarken og godartede binyrebark tumorprøver. Ved Western blot, fant vi høyere ekspresjon i ACC (n = 3) enn benigne adrenokortikale tumorer (n = 13), og i normale adrenal cortex prøver (n = 5) (figur 1C). Det var god korrelasjon mellom KIAA0101 mRNA og protein uttrykk nivåer (Figur 1D, r = 0,61, p 0,001). For å vurdere KIAA0101 uttrykk videre, utførte vi semikvantitativ analyse av en vev array som inneholder små deler av godartede og ondartede svulster ved immunhistokjemi for KIAA0101 protein. Denne analysen fant ingen signifikant forskjell i KIAA0101 proteinekspresjon mellom benigne og maligne tumorer (p = 0,31). Dette er ikke overraskende som immunhistokjemi er en semikvantitativ metode og kan ikke oppdage mindre forskjeller i proteinuttrykk. Men når KIAA0101 protein-ekspresjon ble evaluert i enkelte benigne og maligne eksempler på matrisen, ble signifikant overekspresjon observert sammenlignet med normale prøver (figur 1E). KIAA0101 protein var til stede i cytoplasma og cellekjernen, som også ble bekreftet ved immunofluorescens (figur 1F).
Vi har observert bare sparsom KIAA0101 farging i noen normale adrenal cortex prøver, som var begrenset til subkapsulær cortex region ( Figur 2A). For å finne ut om dette fokusområdet positivt for KIAA0101 representert binyrene stamceller, vi co-farget de samme normale binyrebarken prøver med steroidogenic faktor 1 (SF-1) antistoff, en markør for binyrene stamceller [23]. Interessant, normale binyrebarken prøvene viste co-farging av KIAA0101 og SF-en sammen i subcapsular eller stamfar region av binyrebarken (figur 2B).
A) Immunohistochemistry farging av normal binyrebarken for SF-1 og KIAA0101. I det første panelet, er sonene i binyrebarken indikert på 10X, 1: Zona glomerulosa inneholder stamceller, 2: Zona fasciculata, 3: Zona reticularis. Andre og tredje panel indikere SF-1 (20X med 40X innfelt) og KIAA0101 positiv farging i Zona glomerulosa på 20X forstørrelse. Røde piler indikerer positive områder for SF-1 og KIAA0101 farging. B) Immunofluoroscence for SF-1 og KIAA0101 i normal binyrebarken. Kjerner ble farget med DAPI (blå), indikerer rød farge KIAA0101 uttrykk og grønn farge indikerer SF-1 uttrykk. Sammenslåtte Images (gul farge) på 40X viser colocalization av de to proteinene, SF-1 og KIAA0101 i stamceller av normal binyrebarken.
Mekanisme KIAA0101 overekspresjon i ACC
Til bestemme hvorvidt overekspresjon KIAA0101 var en konsekvens av gensekvensvariasjoner, utførte vi mutasjonsanalyse i KIAA0101. Vi fant man de
novo
G A overgang mutasjon i posisjon 186 som faller inn i ikke-kodende område av KIAA0101 i en godartet prøve. Vi har også observert en polymorfisme i 5 «UTR i ekson 1-2 (88T C). Omtrent 6,6% av benign var heterozygote og 12,5% i den normale, men ingen i maligne prøver (tabell 2). Gitt disse resultatene er det usannsynlig at KIAA0101 overekspresjon er et resultat av mutasjon.
Den funksjonelle effekten av knockdown av KIAA0101 genet i en ACC cellelinje
Gitt den betydelige overekspresjon av KIAA0101 i ACC (figur 1) og den observasjon at KIAA0101 ekspresjon er begrenset til former adrenal progentitor celler (figur 2B), en hypotese om at vi KIAA0101 spiller en rolle i adrenokortikal cellevekst. For å løse dette, brukte vi siRNA til knockdown KIAA0101 uttrykk i ACC cellelinje, NCI-H295R. Transient transfeksjon av KIAA0101 spesifikke siRNA resulterte i en 10-fold knockdown i løpet av 24 timer, og denne effekten ble opprettholdt for opptil 6 dager på mRNA og 80% reduserte på protein nivåer sammenlignet med en ikke rettet mot siRNA (negativ kontroll siRNA) ( figur 3). KIAA0101 knockdown resulterte i beskjeden økning i cellulær proliferasjon med en økning i celleantall på opp til 25% (p = 0,005) (figur 4A). Også den cellelinjen doblingstiden og veksthastigheten var forskjellig for siRNA knockdown sammenlignet med den negative kontroll (gjennomsnittlig fordoblingstid på 4,7 og vekstrate på 0,14 sammenlignet med gjennomsnitt doblingstid på 3,5 og vekstrate på 0,19 fra dag 1 til 5, , henholdsvis). Cellesyklusanalyse viste en beskjeden økning i antall celler i G1 fase (p = 0,013) (figur 4B). Vurderer disse motstridende resultater, evaluert vi også mRNA uttrykk for G1 cellesyklusregulerende proteiner i G1 fasen etter KIAA0101 knockdown. KIAA0101 knockdown ikke signifikant endrer mRNA-ekspresjon av p21 og syklin D1, cellesyklusregulerende proteiner, i en cellelinje ACC. I tillegg, KIAA0101 genet knockdown hadde ingen signifikant effekt på antallet celler i apoptose (data ikke vist).
A) H295R-celler ble transfektert med KIAA0101 siRNA og negativ kontroll og analysert for KIAA0101 mRNA-ekspresjon etter 48 timer av behandlingen. Kolonnene representerer KIAA0101 mRNA-ekspresjon i prosent i forhold til negativ kontroll ± standardavvik av fire eksperimenter. B) Representative Western blot som viser protein ekspresjon av KIAA0101 etter 6 dager med siRNA og negativ kontroll. C) Relativ intensitet av western blot ved hjelp av Image J programvare. Søylene viser forholdet mellom KIAA0101 og GAPDH intensitetsmålinger. NC40 = Negativ kontroll ved 40 nM; SI40 = siRNA ved 40 nM; NC80 = Negativ kontroll ved 80 nM; SI80 = siRNA ved 80 nM.
A) Antall celler for KIAA0101 siRNA behandlede og negative kontrollbehandlede grupper er vist ved angitte tidspunkter (signifikante verdier er angitt med asterisk (*) (p = 0,005;. forhold til negativ kontroll) feil~~POS=TRUNC representerer ± standard feil av gjennomsnittet og er representativ for fire eksperimenter NC80 = negativ kontroll ved 80 nM;. SI80 = siRNA på 80 nM B) KIAA0101 genet knockdown og cellesyklusanalyse er indikert. ved forskjellige tidspunkter. Representant bilde av cellesyklusen profil fra siRNA og negative kontroll behandlingsgruppene. C) Hver kolonne angir fordelingen av G0 /G1 populasjon av celler i hver gruppe ved forskjellige tidspunkter. Feilstolpene representerer ± standard feil av gjennomsnittet og er representative for fire eksperimenter * Dag 3 og 5, p. 0,05; i forhold til negativ kontroll.
Gitt de paradoksale effekter, en beskjeden økning i mobilnettet spredning og G1 arrest, brukte vi flere funksjonelle analyser for å bedre forstå de fenotypiske endringer knyttet KIAA0101 knockdown. Spesielt tumorogenicity og metastatisk potensial ble evaluert. KIAA0101 knockdown i NCI-H295R celler redusert antall kolonier som var i stand til å vokse i bløt agar med nesten 80% (p = 0,001) ved 16 dagers dyrking (figur 5A og 5B) med en 60% reduksjon i celle invasjon i NCI-H295R cellelinje (p = 0,006) (figurene 5C og 5D).
A) Celler dyrket i 15 dager i nærvær av angitte konsentrasjoner av siRNA og negativ kontroll. Representative Bildene vises på 12 X og 40X forstørrelse. B) Fordelingen og antallet kolonier i gruppen som ble behandlet med KIAA0101 siRNA og negativ kontrollgruppe på 80 nM (p = 0,001, i forhold til negativ kontroll; NC80 = Negativ kontroll ved 80 nM; SI80 = siRNA ved 80 nM). Feilstolpene representerer ± standard feil av gjennomsnittet og er representative for fire eksperimenter. C) Invaderende-celler ble farget med 0,2% krystallfiolett og visualisert ved mikroskopi. Representative bilder på 20X følgende invasjon analysen. D) Fordelingen av antall celler i KIAA0101 siRNA og negativ kontrollgruppe. Kolonnene representerer gjennomsnitt ± standard avvik (SD) av tre uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer. * P 0,05 KIAA0101 siRNA vs. negativ kontroll. H295R celler ble transfektert med negativ kontroll eller KIAA0101 siRNA på 80 nM i 120 timer, etterfulgt av en invasjon analyse i 48 timer.
Diskusjoner
I denne studien undersøkte vi KIAA0101 uttrykk og funksjon i ACC. Våre resultater tyder på at KIAA0101 er overuttrykt i ACC, er en god diagnostisk markør for ACC, og er en markør for celleformering. Undertrykke KIAA0101 uttrykk i binyrebark carcinoma celler resulterte i undertrykkelse av vekst og invasjon, noe som tyder på at det spiller en vekstfremmende rolle i ACC.
Tidligere studier har vist endret uttrykk for KIAA0101 i menneskelige malignitet og fraværende eller lav uttrykk i normal vev [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21], [22]. Imidlertid har motstridende resultater er oppnådd for KIAA0101 uttrykk i leverkreft (HCC). I en studie ble KIAA0101 ekspresjon funnet å bli nedregulert i HCC [13]. Motsatt, i en separat studie i en stor kohort av pasienter med HCC, KIAA0101 ble oppregulert [18]. Vår studie viste også at KIAA0101 overekspresjon i primær ACC men interessant, KIAA0101 mRNA uttrykk var lavere i svulster fra en kohort av pasienter med metastaserende og tilbakevendende ACC som har svart på systemisk kjemoterapi og gjennomgikk reseksjon. Disse resultatene antyder at KIAA0101 ekspresjon kan variere som et resultat av behandling og kunne muligens bli brukt som en biomarkør for behandlingsrespons i ACC og andre kreftformer.
Selv om vi funnet at KIAA0101 protein ekspresjon var høyere i svulster sammenlignet med normale prøver, gjorde vi oppdager KIAA0101 uttrykk i en undergruppe av normale prøver. Dets ekspresjon var begrenset til subcapular regionen av adrenal cortex og overlappet de SF-1-positive flekker celler. I denne regionen, er SF-1-positive celler antatt å være adrenal stamceller [24]. Stamceller har høy proliferativ kapasitet. KIAA0101 og SF-en co-uttrykk i stamfar regionen normal binyrebarken antyder at KIAA0101 kan være en markør for spredning i binyrebark celler. I samsvar med dette, en studie av Simpson et al., Har vist lokalisering av KIAA0101 i basalcellelaget i huden og proliferativ sone i krypter i tykktarmen [15].
Lite er kjent om funksjonen til KIAA0101 genet i tumorcellebiologi. Tidligere studier har antydet at KIAA0101 er involvert i regulering av DNA-replikasjon, cellesyklus, apoptose og cellulær proliferasjon [13], [14], [15], [18], [25], [26].
