Abstract
Ondartet mesothelioma (MM) er en aggressiv type svulst som forårsaker høy dødelighet. En årsak til dette paradigmet kan være at det finnes en undergruppe av tumor initiere celler (tics) som gi gave MM med legemiddelresistens og gjentakelse. Målet med denne studien var å identifisere og karakterisere en TIC undergruppe i MM celler, ved hjelp av sfæroide kulturer, mesospheres, som en modell av MM tics. Mesospheres, preget av de stemness markørene CD24, ABCG2 og OCT4, initiert svulster i immunodeficient mus mer effektivt enn heftende celler. CD24 knock-down celler mistet kula dannende kapasitet og inneholdt lavere tumorigenicity. Ved serie transplantasjon, mesospheres ble gradvis mer effektiv tumrigenic med økt nivå av stamcellemarkører. Vi viser også at mesospheres har mitokondrie og metabolske egenskaper som ligner på de av normale og kreftstamceller. Til slutt viser vi at mesothelioma-initiere celler er svært utsatt for mitochondrially målrettet vitamin E succinate. Denne studien dokumenterer at mesospheres kan brukes som en plausibel modell av mesothelioma-initiere celler, og at de kan benyttes i jakten på effektive midler mot MM
Citation:. Pasdar EA, Smits M, Stapelberg M, Bajzikova M, Stantic M, Goodwin J et al. (2015) Karakterisering av Mesothelioma-Initiere celler og deres mottakelighet for kreftlegemidler. PLoS ONE 10 (5): e0119549. doi: 10,1371 /journal.pone.0119549
Academic Redaktør: Lin Zhang, University of Pennsylvania School of Medicine, USA
mottatt: 08.09.2014; Godkjent: 14 januar 2015; Publisert: 01.05.2015
Copyright: © 2015 Pasdar et al. Det er en åpen adgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens støtteinformasjon filer. De opprinnelige rådata er lagret i Griffith University system. https://research-storage.griffith.edu.au/owncloud/index.php/apps/files/?dir=%2Fdocuments%2FPasdar%20et%20al%20PLoS%20One.
Funding: Arbeidet ble støttet delvis med tilskudd fra den australske Forskningsrådet, Cancer Council Queensland, og European Regional Development Fund (BIOCEV prosjektet, CZ.1.05 /1.1.00 /02,0109) til JN. EAP ble støttet av Douglas Francis Grønn PhD-stipend gitt av Queensland asbest-relatert sykdom Society. LFD fikk støtte fra Griffith University Stipendiat. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at det ikke konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Ondartet mesothelioma (MM), den primære svulsten av pleura, er svært aggressiv, med svært lite eller ingen behandlingsalternativer. Vanligvis blir diagnostisert 20 til 40 år etter eksponering for asbest, det viktigste kreftfremkallende av MM, er dette neoplastisk sykdom svært aggressiv og dødeligheten er svært høy med et par måneder overlevelse etter diagnose [1, 2], tilbakefall av svulsten oppstår kort tid etter behandlingsstart [3]. Til tross for den nåværende forbud av asbest bruk i industrialiserte land, og på grunn av mangel på restriktiv lovgivning om behandling og bruk av asbest i utviklingsland [4], fortsetter MM insidens å stige som et resultat av en lang latenstid.
det har vært antydet at tumor heterogenitet, som en følge av genetisk ustabilitet og nisje faktorer i tumoren, er en viktig årsak til resistens mot behandling av cancerpasienter [5, 6]. Genomiske studier av MM svulster også markere inter- og intra-tumor heterogenitet av denne type malignitet [7, 8]. De underliggende mekanismene for svulst heterogenitet er fortsatt under intens debatt og ulike modeller har blitt foreslått å definere dette fenomenet [9]. Den foreslåtte cancer stamcelle (CSC) modell kan plausibly beskrive heterogenitet og hierarkisk organisering av celler i kreftsvulster [10]. Cscs (også referert til som tumor-celler, initiere tics), en liten sub-populasjon av celler i løpet av karsinomer, har evnen til å fornye seg selv og generere differensierte celler med høy proliferativ kapasitet at (re-) danner tumormasse [11 ], så vel som endowing tumorer som er resistente mot behandling [12, 13]. Tilstedeværelsen av tics kan også, delvis forklarer høy motstand av MM til terapi, selv om dette aspektet av patofysiologien MM bare delvis er forstått [14, 15].
I denne kommunikasjonen, rapporterer vi at det foreligger tics i mesothelioma etter karakter kuler som stammer fra forskjellige mesothelioma cellelinjer som tidligere etablert modell for dyrking stamceller og tics [16-18]. Vi har også til stede karakterisering av MM tics og deres mottakelighet for kreftlegemidler.
Materialer og metoder
Cell kultur
De etablerte menneske MM cellelinjer IST-Mes-2 (epithelioid histotype) Meso-2 (sarcomatoid histotype), MM-BI (bifasisk histotype) [19], og den murine AE17 cellelinje (epithelioid histotype) [20] ble dyrket i DMEM supplert med 10% FBS og antimykotisk /antibiotika cocktail (Invitrogen). Cellene ble inkubert ved 37 ° C i fuktig atmosfære med en 5% CO
2. For sfære formasjon, adherente celler ble dyrket ved en tetthet på 10
4 til 2×10
4 celler /ml i serumfritt medium (SFM) bestående av DMEM-F12-medium (Invitrogen) supplert med muse NeuroCult sprednings Supplement (Stemcell Technologies), 20 ng /ml human rekombinant EGF og 20 ng /ml FGF2 (R E. For konfokalmikroskopi ble behandlet lysbilder inkubert over natten med anti-mesothelin IgG (Abcam) etterfulgt av HRP konjugert sekundære IgG og avbildes ved hjelp av Olympus FV1000 fluorescens konfokal mikroskop. TEM av kule-celler ble utført ved anvendelse av en etablert protokoll.
Western blot-analyse
Cellene ble høstet og lysert med lyseringsbuffer (Cell Signalling). Prøvene ble løst i SDS-PAGE-geler og overført til PVDF-membraner, som ble blokkert med 5% BSA og inkubert med primære og HRP-konjugerte sekundære IgG, etterfulgt av visualisering ved hjelp av ChemiDoc XRS
+ System (Biorad). Primære antistoffer var som følger: anti-CD24-IgG, anti-EpCAM IgG (Abcam), anti-CD47-IgG (Santa Cruz), anti-Oct3 /4 IgG (Stem Cell Technologies), anti-ABCG2 IgG, anti-fosfo-P44 /42 MAPK (pErk1 /2) (Thr202 /Thr204) IgG, anti-P44 /p42 (ERK1 /2) IgG, anti-p38 MAPK-IgG, anti-fosfo-p38 MAPK (pP38) (Thr180 /Thr182) IgG, anti -EGFR IgG, anti-fosfor-EGFR (pEGFR) (Tyr1068) IgG (alle Cell Signaling). Anti-aktin IgG (Sigma) ble anvendt som en kontroll lasting.
Kvantitativ sanntids-polymerase kjedereaksjon (qPCR)
Total mRNA ble utvunnet ved bruk av RNeasy Kit (Qiagen) og cDNA syntetisert ved hjelp av RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific) og iCycler iQ real-Time PCR Detection System. qPCR ble utført ved hjelp av Platinum SYBR Grønn qPCR SuperMix-UDG (Invitrogen). Vanligvis ble 200 ng av templat totalt RNA og 0,2 uM av genspesifikke PCR-primere anvendt per reaksjon, og den Eco Real-Time PCR System instrument (Illumina) for forsterkning. GAPDH ble anvendt for å normalisere de relative nivåene av mål-gener ble kvantifisert med ΔΔCt metode. Individuelle primere er som følger. CD24: fremover, AGC GGT TCT CCA AGC ACC CA, reverse-TAG GAG CAG TGC CAG CAG CA; OCT4: fremtids CCC CAG GTT GGA GTG GGG CT, reverse-GGA GGC CCC ATC GGA GTT GC, ABCG2: fremtids ACG AAC GGA TTA ACA GGG TCA, reverse-CTC CAG ACA CAC CAC GGA T; SOX4: sende GAT TCC GCC CAC AGA GAG TC, omvendt GGT AGC TCA GGA AAG CGA CA; KLF4: CTG GGT CTT GAG GAA GTG CT, reverse-GGC ATG AGC TCT TGG TAA TGG; c-myc: fremtids GGA CTT GTT GCG GAA ACG AC, reverse-CTC AGC CAA GGT TGT GAG GT; ABCB5: fremtids ACT GAG AAA GGA AGC AGT TGG A, reverse-TAA AGG AAG GCA GGC TCC AT; GAPDH: fremtids TGC ACC ACC AAC TGC TTA GC, reverse-GGC ATG GAC TGT GGT CAT GAG
Transfeksjon med liten hårnål RNA (shRNA)
Menneske CD24-spesifikk shRNA konstruerer i. pRS ryggraden under styring av U6-promoteren og den relevante tom vektor ble oppnådd fra OriGene Technologies (Rockville). Den Fugene HD transfeksjon reagens (Promega) ble brukt til å stabilt transfektere IST-Mes-2 celler med shRNA CD24 og tom vektor (mock-transfektert celler) i henhold til produsentens instruksjoner. De stabile enkelt celle-avledede kloner ble utvalgt ved tilsetning av 4 ug /ml puromycin til kulturmediet og overvåkes for transfeksjon ved hjelp av qPCR eller Western blotting.
Vurdering av superoksyd-generering, mitokondriemembranpotensialet, mitokondriell masse , cellesyklus, apoptose og cellestørrelse
Intracellulær superoksydanion nivåer ble evaluert ved hjelp av fluorescerende probe MitoSOX. 10
5-celler ble dyrket i 24-brønners plater og ved 70% konfluens, ble behandlet med 20 uM MitoSOX i 30 minutter, vasket på nytt oppslemmet i PBS og analysert ved strømningscytometri (FACS Fortessa, Becton Dickinson). Superoksyd nivåer ble uttrykt som midlere fluorescensintensitet (MFI). Mitokondriell massen ble evaluert ved å behandle cellene med 50 uM MitoTracker grønn FM 30 minutter og analyse ved strømningscytometri. For vurdering av cellesyklusen, 10
6 levedyktige celler ble vasket og fiksert i 70% EtOH natten over og farget med 100 ug /ml propidiumjodid (PI), og analysert ved hjelp av en FACS Calibur flowcytometer (Becton-Dickinson). Signaler som sendes ut fra en enkelt kjerne og aggregerte celler ble utelukket ved hjelp av en dobbel-gating modul. Apoptose ble evaluert ved standard annexin V /PI-metoden. Cellestørrelsen ble estimert ved hjelp av Scepter håndholdt automatisert celleteller (Millipore) i henhold til produsentens instruksjoner.
CS, SDH og SQR aktivitet
CS aktivitet ble evaluert ved reduksjon av DTNB [5,5 « ditiobis- (2-nitrobenzosyre)] ved hjelp av enzymet og dets kombinert reaksjon med oksaloacetat og acetyl-CoA. I korthet ble 10 ug av protein lysatet ble tilsatt til en blanding av 10 mM DTNB og 30 mM acetyl-koenzym A. endringen i absorbans av DTNB ble målt i Tecan Infinite 200 PRO leser i 90 s ved 412 nm etter tilsetning av 10 mM oksaloacetat i en 200 ul reaksjonsvolum. SDH-aktiviteten ble bestemt som tidligere beskrevet (Dong et al., 2011). For SQR aktivitet, ble 40 ug av protein lysatet tilsatt til 1 ml av den sqr analysebuffer (10 mM KH2PO4, pH 7,8, 2 mM EDTA, 1 mg /ml BSA), 80 uM diklorfenolindofenol, 0,2 mM ATP, 4 uM rotenon, og 10 mM succinat, og inkubert ved 30 ° C i 10 min. Absorbansen ble målt hvert minutt i 30 minutter etter oppstart av reaksjonen ved decylubiquinone (80 mm) [23].
Høy oppløsning respirometri
Oksygenforbruket ble vurdert ved hjelp av Oxygraph-2k høy- oppløsning respirometer og data analysert ved anvendelse av programvaren Datlab (begge Oroboros), i hovedsak som beskrevet [24]. Alle målinger ble utført ved 37 ° C i 2 ml kamre. For evaluering av intakte celler, ble serumfritt DMEM media som brukes, mens digitonin-permeabilised celler ble suspendert i MiR05 mitokondriell respirasjon medium. For alle forsøk ble 10
6 celler pr kammer. Hastigheten av oksygenforbruk (oksygenfluks) ble beregnet som den negative helling av oksygenkonsentrasjonen. Cellulær oksygenfluksen ble korrigert for instrumentell bakgrunn, som resulterer fra den ikke-spesifikk sensor oksygenforbruk. Betingelsene for respirasjonen var som følger: GM_L-glutamat (2 mM) /malat (10 mM); GM_P-som før plus ADP (2,5 mM); GMS_P-som før plus suksinat (10 mM); GMS_E-som før pluss CCCP (5 mm); S (Rot) _E-som før pluss rotenon (0,5 mm). Symbolene står for: GM_L-lekkasje (oksygen forbruk ikke er koblet til ATP produksjon), GM_P-åndedrett via CI; GMS_P-åndedrett via CI + CII; GMS_E-frikoblet åndedrett; S (Rot) _E-frikoblet åndedrett via CII.
glukoseopptak, ATP nivå og laktat analyser
For glukoseopptak ble cellene inkubert i lavt blodsukker (1g /l) DMEM overnatter på 5% CO
2 og 37 ° C. De ble deretter inkubert i 30 minutter med 50 uM 2-nitrobenzodeoxyglucose (2-NBDG) i lav glukose DMEM. Nivået av fluorescerende glukoseanalogenen i cellene ble evaluert ved flow-cytometri og uttrykt som MFI. For estimering ATP, ble cellene sådd ut i 96-brønners plater ved 10
4 celler per brønn og intracellulære ATP-nivåer analysert ved hjelp av et luciferase-baserte kit (CellTiter-Glo Luminescent Assay, Promega). Resultatene ble normalisert til total-protein. For laktat analysen ble cellene sådd ut på 10
4 per brønn i 96-brønners plater. Etter 24 timers inkubasjon ble cellekulturmediet anvendt for evaluering av laktat ved anvendelse av en fluorometrisk sett (Cayman Chemicals). Resultatene ble normalisert til total protein
Statistisk analyse
paret t-test ble brukt for å vurdere forskjellene mellom forsøksresultater med forskjeller med
p
0,05 ansett som statistisk signifikant.
Resultater
Dannelse av mesospheres fra MM cellelinjer med ulike fenotyper
En viktig egenskap ved tics er deres evne til å fornye seg selv via asymmetrisk celle inndeling. For å kontrollere at MM celler omfatter et sub-populasjon med karakteristiske selvfornyelse kapasitet, etablerte MM cellelinjer inkludert Ist-Mes-2 (epithelial histotype), Meso-2 (sarcomatoid histotype) og MM-BI celler (bifasisk histotype), som samt murine AE17 MM celler ble dyrket under betingelser som er etablert for berikende cellepopulasjoner i tics. For anrikning i tics, ble cellene dyrket i et serumfritt medium (SFM) [25], en tilstand opprettholde celler i en udifferensiert tilstand som tidligere er blitt brukt for å isolere forskjellige typer av stamceller og tics [26]. I SFM, alle MM cellene vokste i kuleformede kolonier, betegnet som mesospheres, med diameter 30-100 pm etter 3-5 dager i kultur (figur 1A). For alle MM cellelinjer undersøkt, adherente celler prolifererte mindre effektivt enn de tilsvarende sfæriske cellene når plassert i fullstendig medium, og IST-Mes-2-cellene var mer enn proliferativ MM-BI og Meso-2-celler (figur 1B). Mesospheres opprettholdt evnen til å danne nye kuler etter mekanisk dissosiasjon og re-såing i frisk SFM. Hyppigheten av kule-dannende celler som representerer tics ble evaluert ved begrensende fortynningsanalyse som tidligere beskrevet [16, 21, 22]. Det kan beregnes fra plottene, basert på skjærings på 37% verdi med bakkene i de enkelte cellelinjer som antall celler som kreves for dannelsen av en sfære var 1,81 ± 0,24 for IST-Mes-2, 4,54 ± 0,39 for MM-BI og 7,53 ± 0,89 for Meso-2 celler (tabell 1). At en enkelt celle kan danne en sfære når den plasseres i SFM er dokumentert i figur 1C, som viser tidsavhengig sfære dannelse og starter med et enkelt IST-Mes-2 celle.
(A) fasekontrast bilder av mesospheres fra etablerte MM cellelinjer. (B) spredningshastighet encellete-avledet kuler gjen dyrket i normal differensiering medium i forhold til foreldre mesothelioma celler. For dette eksperimentet, ble cellene sådd ut ved det samme nummer i vedheftende medium og proliferasjon av de innledningsvis adherente og kule celler som evaluert ved hjelp av MTT-analysen. Forholdet mellom formeringshastigheten i sfæren-avledede adherente celler inkubert i 72 timer er 3,37 til IST-Mes-2, 1,72 for Meso-2 og 4,25 for MM-BI-celler. (C) En enkelt Ist-Mes-2 celle ble opprettholdt i SFM og sfære dannelse på dag 1, 3, 5 og 7 dokumentert. Dataene i panel B er middelverdier ± S.D. avledet fra tre uavhengige eksperimenter. Bilder i panelene A og C er representative for tre individuelle eksperimenter. Målestokken i paneler A og C representerer 100 mikrometer.
Mesospheres uttrykke stamcellemarkører og effektivt generere svulster
Vi har nylig utført global genekspresjon analyse av sfære og tilhenger IST-Mes-2 celler som dokumenterte en «stemness signatur» av IST-Mes-2 mesospheres [27]. For å kontrollere resultatene av microarray data og for ytterligere å etablere egenskapene til de kule celler, analyserte vi både kuler og heft monolagcellene for uttrykket av markører som ofte forbinder med tics [10] og som ble også funnet økt i microarray analyse av IST-Mes-2 kuler [27]. Høyere uttrykk for
CD24
,
OCT4 Hotell og
ABCG2
mRNA (1,5 til 4 ganger økning) ble funnet i områder sammenlignet med tilsvarende heftende celler. For å teste for plastisitet MM celler, ble encellete-avledet kuler utsatt for normale heftdyrkningsforhold etter forming mesospheres å tillate deres re-vedlegg. Resultatene indikerer at ved differensiering, adherente celler avledet fra sfærer viser tilsvarende nivå av ekspresjon av stamcelle markører til at i den opprinnelige adherente celler (figur 2A). Mesospheres viste også økt uttrykk av flere andre markører for stemness, dvs.
SOX4
,
C-MYC
,
ABCB5 Hotell og
KLF4 plakater (fig 2B) .
(A) IST-Mes-2, Meso-2, og MM-bi-celler fikk lov til å danne kuler, hvoretter disse ble plassert i fullstendig medium for å forårsake differensiering og re-adhesjon av cellene. Relative nivåer
CD24
,
ABCG2 Hotell og
OCT4
mRNA ble vurdert i den opprinnelige heftende celler (angitt som 1), kulene og re-tilhenger celler. (B) IST-Mes-2, Meso-2 og MM-BIs celler kuler ble testet for nivået på
SOX4
,
C-MYC
,
ABCB5 Hotell og
KLF4
mRNA og deres nivå uttrykt i forhold til at de heftende celler. Dataene er middelverdier ± S.D. utledet fra tre uavhengige eksperimenter, symbolet «*» betyr vesentlig forskjellige data med
p
0,05, «**» for de med
p
. 0.005
for å undersøke hvorvidt mesospheres og adherente monolagsceller varierer i deres evne til å danne svulster hos immunkompromitterte mus, IST-Mes-2 mesosfæren og adherente celler ble injisert subkutant i Balb-c /hårløse mus på 10
4, 10
fem og 10
6 celler per mus, og tumor initiering og progresjon ble overvåket av ultralyd imaging (USI). Kule-avledede celler var mer effektiv i tumordannelse enn sine motstykker adherente, særlig for de lavere celle tall (fig 3A-3C). Inspeksjon av tumor bilder ervervet ved USI avslørt multilobular natur kule-avledet svulster, som ikke er tydelig i de adherente celle-stammer karsinom (Fig 3D).
IST-Mes-2 heft og sfære celler ble injisert subkutant inn i Balb-c /nakne mus ved 10
4 (A), 10
5 (B) og 10
6 celler per mus (C). Tumor volum ble evaluert ved bruk av USI og er uttrykt i forhold til den innledningsvis detektert tumor (~ 20 mm
3). (D) Tre ulike representative bilder tatt av ultralyd fra Sphere og tilhenger celle-stammer svulster er vist for svulster dyrket fra 10
6 celler per mus. Den stiplede linjen viser konturene av de USI-visualisert tumorer. På høyre side, et fotografi av en representant svulst vokst fra 10
6 sfære (øvre bilde) og tilhenger celler (nedre bilde) vises. Dataene i panelene A-C er hentet fra eksperimenter som omfatter 4-5 mus per gruppe, og er middelverdier ± SEM Symbolet «* «indikerer signifikant forskjellige verdier med
p
. 0.05
Mesospheres forplante serie svulster med stadig mer aggressive natur
For å verifisere om mesosfæren celler kan danner svulster sekvensielt på grunn av selvfornyelse kapasitet på tics, har vi utsatt dem til serie xenografting inn Balb-c /nakne mus. IST-Mes-2 sfæriske cellene ble tillatt å danne en tumor, og MM-celler avledet fra tumor ble deretter plassert i kulturen resulterer i en cellelinje (1
st generasjon, G1). Disse celler ble anvendt på nytt for å danne kuler som ble podet i nakne mus for å gi andre generasjonen av svulster fra hvilken to
nd generasjon cellelinje (G2) ble avledet. Denne prosedyren ble gjentatt to ganger for å oppnå G3 og G4 cellelinjer. Med hver generasjon lag tid til startfasen forkortet slik at det var 52 dager for G1 og 15 dager for G2, 7 dager for G3 og 5 dager for G4 (fig 4a). Interessant, har vi funnet at nivåene av stamcelle markør (CD24, ABCG2, OCT4) mRNA økt gradvis i de enkelte sfære generasjoner (Fig 4B). Vi har også observert generasjon avhengig økning i CD24, CD47, EpCAM og Oct3 /4 protein, noe som ytterligere støtter forestillingen om at stemness øker for hver generasjon (fig 4C og 4D). For å teste mitokondriefunksjon i individet generasjon, studerte vi aktiviteten til CS, en komponent av trikarboksylsyre (TCA) syklus og en surrogat måling av mitokondriell masse. Figur 4E viser en gradvis økning i aktiviteten av enzymet. For å dokumentere kreft morfologi av tumorer avledet fra hver kule generasjon, farget vi tumorsnitt for tilstedeværelse av en markør av MM, mesothelin, og med H E (figur 4F)
(A) Ist-Message. 2 sfære celler (generasjon 1, G1) ble subkutant podet inn Balb-c /hårløse mus 10
6 celler per dyr. Når tumorer nådde omtrent 2000 mm
3 ble musene avlivet, tumorene skåret ut og ondartede celler vokste
in vitro
som en cellelinje. De adherente celler ble omdannet til kuler (G1), og disse ble podet inn Balb-c /nakne mus for å danne svulster som ble brukt for generering 2 (G2) kuler. Denne prosedyren ble gjentatt ytterligere to ganger for å utlede G3- og G4-sfærer. Den innfelt i panel A viser lag til tumor utseende følgende celle pode for individuelle sfære cellegenerasjoner. Celler av individuelle generasjoner ble evaluert for stemness markører som vist ved hjelp av qPCR (B) og WB (panel C viser blotter, panel D sine densitometriske evalueringer) og for CS aktivitet (E). (F) Svulster avledet fra adherente celler og kuler av individuelle generasjoner ble skåret ut, parafin-innleiret og farget for MM markør mesothelin (vre bildene viser farging med utelukkelse av den primære IgG) og med H E. Data som vises i panel A er avledet fra 5 dyr og er gjennomsnittsverdier verdier ± S.E.M., data i panelene B og E er middelverdier fra tre uavhengige eksperimenter ± S.D. Bilder i panel C representative for to individuelle eksperimenter og deres densitometriske vurderinger i panelet D representerer gjennomsnittsverdier med forskjeller lavere enn 10%. Bilder i panel F ble oppnådd ved hjelp av en svulst for hver tilstand (generasjon). Symbolet «*» angir statistisk signifikante forskjeller med
p
0,05. Bilder er representative for tre forskjellige tumorer.
Siden kule kulturer avledet fra forskjellige generasjonen av svulster viste økende CS aktivitet, vurderte vi disse cellene for deres mitokondriell funksjon i mer detalj. Vi testet først de enkelte generasjon sfære celler for åndedrett. Analyse av respirasjon av intakte samt permeabilised celler ved hjelp av Oxygraph høy oppløsning respirometer avslørte at G1 generasjon celler respirerer mer (både via rutine respirasjonen samt via respirasjonen bruke komplekse I, CI og CII) enn G0-celler (sfærer fremstilt fra den opprinnelige adherente IST-Mes-2 celler). Åndedrett i G2-G4 celler litt redusert, men var fortsatt mye høyere enn i foreldre sfære celler (figur 5A og 5B). Denne trenden var ganske lik for mitokondrie masse (figur 5C), superoksid generasjon (figur 5D), glukoseopptak (Fig 5E) og mitokondrielle potensial (Fig 5G). På den annen side nivået av ATP falt i de enkelte sfæren generasjoner (figur 5F), og en liknende tendens ble funnet for laktatproduksjon (figur 5H). Vi har også testet de to aktivitetene CII, SDH og succinate kinon reduktase (SQR) aktivitet. Fig 5I dokumenterer ingen endring i SDH og figur 5J en nedgang i G1 cellene SQR aktivitet. Vi har observert en liten gradvis økning i størrelsen av celler av forskjellige generasjoner (fig 5K). Transmisjonselektronmikroskopi (TEM) bilder viste morfologiske forskjeller i mitokondriene av individuelle generasjon celler (Fig 5L). Første generasjon celler har rund eller oval formet mitokondrier med cristae anordnet parallelt med hverandre og noen mitokondrier omgitt med ru endoplasmatisk retikulum. G2 celler har to typer mitokondrier med lik frekvens: mitokondrier med løsnede matrise, og mitokondrier med tett matrise og dilaterte cristae samt delvis lokalisering av grov ER i nærheten av mitokondriene, i likhet med G1-celler. G3 celler viser tette mitokondrier med plate men mindre rett cristae, og G4 celler har forgrenede mitokondrier med dilatert (vesikulært) cristae og tett matrise.
Sphere celler som representerer individuelle generasjoner ble evaluert for åndedrett ved hjelp av rutinen protokollen (A) og protokollen for permeabilised-celler (B) ved hjelp av det Oxygraph 2k høy oppløsning respirometer. Symbolene GM_L, GM_P, GMS_P, GMS_E og S (Rot) _E representerer rutine åndedrett, åndedrett via kompleks I, åndedrett via kompleks I + II, frikoblet åndedrett og frikoblet åndedrett via CII, henholdsvis. (C) mitokondrie massen ble evaluert med MitoTracker Grønn som beskrevet i metodedelen. Superoksyd ble evaluert ved bruk av det fluorescerende probe MitoSOX (D), glukoseopptak ved hjelp av det fluorescerende glukose analoge 2-NBDG (E), ATP-nivåer ved en luciferase-baserte analysen (F), ΔΨ
m ved bruk av det fluorescerende probe TMRM (G ), laktatnivåer ved bruk av et kommersielt sett (H), for SDH (i) og sQR (J) aktiviteter ved hjelp av enzymatiske analyser, og håndholdte celler motvirke for cellestørrelse (K). (L) TEM ble utført på individuelle generasjon sfære celler som beskrevet i metodedelen. Dataene i paneler A-K er gjennomsnittsverdier ± S.D., Og er avledet fra tre individuelle eksperimenter. Symbolet «*» angir statistisk signifikante forskjeller med
p
0,05. Bilder i panelet L er representative for tre uavhengige eksperimenter. Den hvite linjen i panel K i de øvre bildene representerer 500 nm i de lavere bilder 200 nm.
CD24 knock-down demper evnen til mesothelioma celler til å danne kuler og danne svulster
CD24 er et glycosyl fosfatidyl-inositol-bundne mucin-lignende celleoverflateprotein med en rolle ved celleadhesjon, og er uttrykt i forskjellige cancere [28-30]. Denne markøren er assosiert med dårlig prognose i ulike tumorer og dens nedregule hemmer spredning og induserer apoptose i tumorceller [31], mens økt uttrykk av CD24 fremmer tumorvekst og metastasering [32].
Til ytterligere verifisere rollen til CD24, sterkt uttrykt i IST-Mes-2 kuler, i «stemness» av MM-celler, dets ekspresjon var stabilt nedregulert ved hjelp shRNA. Vi valgte flere kloner av knock-down-celler, hvorav klone to CD24
– celler viste omtrent 80% reduksjon av CD24, som dokumentert både ved western blotting og qPCR (figur 6A og 6B). Vi utførte alle eksperimenter med klonen 2 celler. CD24
– IST-Mes-2 celler kjøpt epitel-lignende morfologi og viste et tap av foreldre cellenes tilbøyelighet til å danne kuler (Fig 6C). Mer spesifikt ble ingen tegn til sfære formasjon observert etter å opprettholde CD24
– celler i SFM i 7 dager, og cellene fortsatte å vedvare i kulturen for noen flere dager som løse tilslag før de døde. CD24 knock-down også undertrykte betydelig spredning av IST-Mes-2-celler, som dokumentert i Fig 6D. Vi vurderte neste rollen til CD24 i den mitogene MAPK-reaksjonsveien, som utløses av den epidermale vekstfaktor-reseptor (EGFR), og som har vist seg å være overuttrykt i MM [trettitre]. Våre data indikerer forholdsvis høyt nivå av fosforylert EGFR i mesospheres, mens reduserte mengder av pEGFR ble observert i CD24
– celler. Av nedstrøms proteiner av MAPK-reaksjonsveien, CD24
– cellene vise lavere fosforylering av p38, men ikke ERK1 /2, mens P38 ble funnet fosforylert i sfæren celler (figur 6E og 6F). Til slutt utførte vi et kontrollforsøk for å utelukke muligheten for at fosforylering av EGFR i kuler er på grunn av tilstedeværelsen av EGF i media. Adherente foreldre, CD24
– og mock-transfektert IST-Mes-2-celler ble holdt i komplett medium i 24 timer i nærvær eller fravær av tilsatt EGF og, sammen med kule celler som ble opprettholdt i EGF-inneholdende SFM , vurderes av WB for EGFR og pEGFR (fig 6G og 6H). Resultatene tyder på at nærværet av EGF i mediet som brukes for kultivering av adherente celler ikke støtter fosforylering av EGFR, som derfor en iboende egenskap av kulen cellene.
(A) Foreldre, mock-transfekterte, klone to, clone3 og «blandet» celler (IST-Mes-2 celler transfektert med CD24 shRNA og utvalgte for flere kloner) ble vurdert for CD24 bruker western blotting med aktin som lasting kontroll. Relative nivået på CD24 i cellene er vist basert på densitometrisk evaluering i panel B, som også dokumenterer CD24 mRNA nivå relatert til
GAPDH
. (C) Foreldre og CD24
– IST-Mes-2 celler (klone 2) ble dyrket enten i serumholdig medium eller SFM.
