Abstract
CD44 merker stamcelle-lignende celler i en rekke tumortyper, inkludert kolorektal cancer (CRC), mens avvikende CD44 ekspresjon formidler økt tumorigen, invasive og metastatisk potensiale. Tidligere data indikerer at CD44 er et direkte mål av p53-mediert transcriptional undertrykkelse i brystkreft. Siden inaktivere
p53
mutasjoner er hyppige genetiske hendelser i CRC disse kan utløse uttrykk for CD44. I denne studien har vi utforsket derfor forholdet mellom
p53
mutasjonsstatus og CD44 uttrykk i en kohort av 90 lokaliserte primære CRC og studert effekten av stråling-indusert p53-aktivering på CD44 uttrykk. Interessant, observerte vi at, i motsetning til brystkreft, tap av funksjon
p53
mutasjoner ikke var assosiert med forhøyet CD44 ekspresjon i tykktarmskreft. Videre fant DNA-skader indusert p53-aktivering ikke føre til undertrykkelse av CD44 uttrykk, verken i tykktarm kreft celler og heller ikke i normale tarm epitelceller. Våre data viser at CD44 uttrykk i normale og maligne intestinale epitelceller ikke er regulert av p53, noe som tyder på at reguleringen av denne potensielt viktig terapeutisk mål er vev og kreft-type spesifikke
Citation. Zeilstra J, Joosten SPJ, Vermeulen L, Koster J, Medema JP, Versteeg R, et al. (2013) CD44 uttrykk på tarmepitelet og tykktarmskreft er uavhengig av p53 Status. PLoS ONE åtte (8): e72849. doi: 10,1371 /journal.pone.0072849
Redaktør: Kanaga Sabapathy, National Cancer Centre, Singapore
mottatt: 1 mars 2013, Godkjent: 15 juli 2013; Publisert: 29 august 2013
Copyright: © 2013 Zeilstra et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet har vært finansiert av den nederlandske Cancer Foundation. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
CD44 omfatter en familie av celleadhesjon og signalmolekyler som utøver pleiotropiske virkninger på viktige biologiske prosesser, inkludert proliferasjon, overlevelse, migrasjon, epitelial til mesenchymale overgang (EMT), og kreftmetastase (gjennomgått av Zöller [1]) . I tarmslimhinnen, er CD44 en vesentlig direkte mål av Wnt signalering, og er godt uttrykt på tarm stamceller [2] – [4]. Det er vist at CD44 er involvert i initiering og progresjon av tarmsvulster og utvikling av metastase [1], [3], [5] – [9]. I tillegg er fremtredende uttrykk for CD44 et kjennetegn på høyt tumorer CRC celler [10]. Følgelig ble det nylig vist at
CD44
er en del av en intestinal stamcelle gen signatur som spår sykdommen tilbakefall i CRC pasienter [11]. Denne signaturen er spesielt forbundet med CRC celler begavet med høy tumor initiere potensial samt langsiktig selvfornyelse kapasitet. Derfor representerer CD44 et potensielt terapeutisk mål for behandling av CRC, og det er derfor viktig å forstå de ulike mekanismene som ligger til grunn for reguleringen av CD44. I de fleste tilfeller av CRC, er uttrykk for CD44 økte som følge av feilregulert Wnt /β-catenin signal [2], [12]. Men det er rikelig med bevis for at andre ikke-ennå identifisert trasé og mekanismer bidrar til regulering av Wnt /β-catenin mål genuttrykk i tarmsvulster [13]. Den tumor suppressor protein p53 er en transkripsjonsfaktor som spiller en kritisk rolle i undertrykkelse av kreft. Som svar på onkogene stress, slik som DNA-skade, binder aktivert p53-protein til sekvensspesifikke DNA-områder, og dermed regulerer transkripsjon av et bredt spekter av mål-gener som er involvert i cellesykluskontroll og overlevelse signalering [14]. Mutasjonsinaktivering av
p53
genet er en hyppig genetisk begivenhet i utviklingen av mange typer humane tumorer, inkludert brystkreft og tykktarmskreft (CRC) [15]. Det ble nylig vist at p53 transcriptionally represses
CD44
uttrykk i både normale og tumor-avledet mammary epitelceller ved direkte binding til
CD44
promoter [16]. Dette p53 avhengig regulering av CD44 ble observert i både menneskelige og mus melkekjertler, noe som indikerer en evolusjonær konservert funksjon. Viktigere er nedregulering av CD44 ekspresjon viser seg å være en forutsetning for p53-avhengig vekstregulering og induksjon av apoptose i brystepitel [16]. En lignende funksjonell samspill mellom p53 og CD44 kan også finne sted i intestinale epitelceller og tumorer. For å undersøke om CD44 uttrykk er kontrollert av p53 protein i CRC, analyserte vi en kohort av primær kolon karsinom for
p53
mutasjonsstatus og CD44 uttrykk. Vår studie viser at tap av p53-funksjonen ikke er assosiert med forhøyet CD44 uttrykk i CRC. Videre viser vi at aktivering av villtype p53 er i stand til å undertrykke CD44 uttrykk i menneskelig kolon kreftceller samt i primærkulturer av mus intestinal krypten-villus organoids.
Materialer og metoder
Etisk Uttalelse
studiet omfatter mennesker biopsiprøver ble gjennomført i samsvar med Helsinkideklarasjonen og godkjent av lokale etikkutvalg av The University of Amsterdam, AIEC (Algemene Instellingsgebonden Ethische Commissie). Pasientene ga skriftlig informert samtykke til prøvetaking.
Tumor Samples, p53 mutasjon Analyse og Gene Expression analyse
Studiet kohorten besto av 90 AJCC stadium II CRC pasienter som gjennomgikk forsettlig kurativ kirurgi i Academic Medical Center (AMC) i Amsterdam, Nederland, i årene 1997-2006 [17]. Representant Dypfryst svulstvev ble kuttet i 20 mikrometer tykke seksjoner som umiddelbart ble plassert i TRIzol reagens (Invitrogen Livet Technologies, Breda, Nederland), hvoretter total RNA ble utvunnet. Tumor lasten ble undersøkt rutinemessig av en erfaren patolog.
p53
mutasjonsstatus ble bestemt ved hjelp av RT-PCR. Kort sagt, to mikrogram total RNA ble revers-transkribert i 25 ul reaksjonsvolum ved hjelp pdN6 (Amersham Biosciences, Roosendaal, Nederland) og MMLV transkriptase (Gibco BRL, Breda, Nederland). PCR ble utført på 1 mL av cDNA mal ved hjelp av platina Taq polymerase (Invitrogen Life Technologies). Oligo primerne er listet opp i tabell 1. PCR-produkter ble amplifisert ved 35 sykluser på 45 s ved 95 ° C, 45 s ved 60 ° C, og 1 min og 30 s ved 72 ° C, og ble sekvensert direkte ved hjelp av Big Dye Terminator Kit (Amersham) sammen med enten følelse eller anti-sense oligo primer. Sekvensene ble analysert ved hjelp CodonCode Aligner programvare (CodonCode Corp., Dedham, MA). Genuttrykk nivåer i svulstene ble vurdert ved hjelp av Affymetrix Genechip Human Genome U133 Plus 2.0 array plattform (Affymetrix, Santa Clara, CA). Renset RNA ble behandlet, hybridisert, og skannes i henhold til produsentens protokoll. Data ble analysert ved hjelp av programvarepakken R2 (https://r2.amc.nl), en web-basert microarray analyse program utviklet av J.K. Data var MAS5-normalisert og uttrykk verdier ble log2 forvandlet. Statistisk signifikans ble vurdert ved hjelp av en-veis analyse av varians (ANOVA). Probe sett analysert var:
CDKN1A product: (
p21
), ID: 202284_s_at;
MDM2,
229711_s_at; og
CD44, etter 209835_x_at. Andre probe setter analysere
CD44
produsert lignende resultater, for eksempel; 204489_s_at,
P
0,01 og 210916_a_at,
P
. 0,01)
Immunohistochemistry
Parafin-embedded svulstvev var farget ved hjelp av primære mAb mus anti-human p53 (Dako, Glostrup, Danmark) og primær mAb mus anti-human CD44 (VFF18) som gjenkjenner CD44v6 [18]. Antistoffbinding ble visualisert ved hjelp av Powervision poly-HRP deteksjonssystem (ImmunoVision Technologies, Daly City, CA) og DAB + (Dako). Intensiteten (I) av fargingen ble scoret på semikvantitative skalaer som følger: «0», ingen reaksjon; «1», svak reaksjon; «2», moderat reaksjon; og «3», sterk reaksjon. Omfanget av signalet ble scoret som prosentandelen av positive celler (P). Samlet farging poengsum ble beregnet ved å multiplisere intensiteten av prosentandelen av positive celler (Score = P * I, maksimum = 300). Fishers eksakte test ble brukt for statistisk analyse (
P
0,001).
Cell Culture, Immunoblotting og Real-time Reverse Transcription-PCR
RKO celler ble dyrket i McCoys 5A medium supplementented med 10% FCS til Subkonfluente. Musetynntarms krypter ble isolert i henhold til protokoller godkjent av den lokale dyreetikk komité av The University of Amsterdam, DEC (Dier Ethische Commissie) og dyrket i en uke som beskrevet av
Sato et al
. [19]. Kulturene ble eksponert for en enkelt dose på 10 Gy fra en
137Cs γ-ray strålingskilde ved en dose hastighet på 0,8 Gy /min eller inkubert med 500 ng /mL neocarzinostatin (NCS), enten i kombinasjon med 10 uM nutlin eller ikke . Cellene ble høstet i lyseringsbuffer på angitte tidspunkter. Antistoffer brukes for immunoblotting var anti-pan CD44 mAb Hermes-3 [20], anti-p21 mAb sx118 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), og anti-p53 mAb DO-en (Santa Cruz Biotechnology). p-aktin ble brukt som lasting kontroll. Parallelt ble totalt RNA isolert med PicoPure RNA Isolation Kit (Arcturus Bioscience, Mountain View, California) og real-time QRT-PCR ble utført som beskrevet tidligere [3], [21]. En måte-analyse av varians (ANOVA) ble anvendt for å bestemme vesentlige endringer (
P
0,05). I tid
Resultater
tap av funksjon Mutasjon av p53 er ikke assosiert med forhøyet CD44 uttrykk i Colon Cancer
Den nylige identifikasjonen av p53 som en transcriptional repressor av
CD44
i brystkreft og melkekjertelepitelet [16], bedt oss om å undersøke om en lignende funksjonell relasjon eksisterer i tykktarmskreft og tarmepitelet. Vi undersøkte derfor sammenhengen mellom p53 mutasjonsstatus og
CD44
mRNA nivåer i en kohort av 90 kolorektal karsinom. Alle svulster inkludert i denne studien var adenokarsinomer med invasjon gjennom muskularis propria, men uten lymfeknute eller fjernmetastaser (Dukes B, AJCC Stage II). Mutasjonsstatus ble bestemt ved cDNA-sekvensering av hele den kodende regionen til
p53
-genet, som strekker seg eksoner 1 til 11. Sekvensanalyse identifiserte 25 tumorer (28%) med en mutasjon, som resulterer i et transkripsjonelt inaktiv p53-protein i henhold til definisjonen av Soussi et al. [22] (tabell 2). Sammenligning mellom gruppene med villtype og mutant
p53
avdekket en betydelig redusert mRNA uttrykk av to kanoniske p53 transkripsjons mål,
CDKN1A product: (
p21
) (
P
0,01) [23] og
MDM2 product: (
P
0,001) [24] i svulstene med
p53
tap av funksjon mutasjoner ( Figur 1A og B). Interessant, i motsetning til brystsvulster der tap av p53-funksjon ble funnet å være signifikant korrelert med forhøyede
CD44
uttrykk [16],
p53
mutasjon i tykktarm karsinomer ble korrelert med redusert
CD44
mRNA uttrykk nivåer (
P
0,01; figur 1C). Disse resultatene antyder at p53 ikke opptrer som en transcriptional repressor av
CD44
uttrykk i CRC.
Relativ genuttrykk nivåer i
p53
mutant og
p53
villtype adenokarsinomer for (A)
CDKN1A product: (
p21
) (**, P 0,01), (B)
MDM2 plakater (***,
P
0,001), (C)
CD44, plakater (**,
P
. 0,01)
CD44 protein uttrykk er ikke økt i Colon kreft med
p53
Mutation
for å bekrefte at
p53
mutasjonsstatus og mRNA nivåer av
CD44
i primære tykktarmskreft prøver reflektere protein nivåer, vi undersøkte p53 og CD44 uttrykk ved immunhistokjemi i en undergruppe av svulstene (n = 15 /gruppe). Mutasjoner i
p53
ofte resultere i en upassende stabilisering av protein og kjernekraft opphopning [25]. I samsvar, mens svulster huser bare villtype
p53
gensekvenser viste enten ingen farging for p53 protein eller kjernefysiske farging i spredte celler, svulster som inneholder en
p53
muterte genet viste en sterk kjernefarging for flertallet av de ondartede cellene (
P
0,001, figur 2A og B). CD44-ekspresjon ble observert på cellemembranen av de aller fleste tumorer med enten ikke-muterte
p53 plakater (14 av 15) eller mutert
p53 plakater (14 av 15) (Fig. 2A). Viktigere var det ingen signifikant forskjell i CD44-farging stillingen mellom tumorer i begge gruppene (
P
0,05; figur 2B). Disse funnene viser at, bortsett fra i brystkreft, er tap av p53-funksjon i tykktarmskreft ikke forbundet med økt CD44-protein ekspresjon.
(A) seriesnitt av en colon carcinoma uten og med et p53 tap av funksjon mutasjon (
dvs.
., R175H, tabell 2), farget for p53 og CD44 protein (linjene viser 50 mikrometer). (B). Immunhistokjemi (IHC) score på p53 og CD44 protein uttrykk, henholdsvis (***,
P
0,001, ns = ikke signifikant).
p53 ikke undertrykke
CD44
i Colon kreft celler og Normal tarmepitelet
de ovennevnte funn ikke utelukker muligheten for at villtype p53 kan (delvis) undertrykke CD44 uttrykk i normal og neoplastiske tarmepitelet ved aktivering av gentoksisk spenning . For å møte denne muligheten, bestemt vi effekten av DNA-skader indusert p53-aktivering på CD44 nivåer i menneske RKO tykktarmskreftceller. Disse cellene uttrykker villtype p53 og K-Ras, og er diploid [26]. Av spesiell interesse, RKO celler inneholder også villtype
APC Hotell og
CTNNB1
gener og mangler konstituerende β-catenin /TCF-4-mediert transkripsjon [27]. Dette er av betydning fordi den transkripsjonelle regulering av
CD44
av p53 kan være maskert ved konstitutiv Wnt bane aktivering, fører til p-catenin /TCF-4-mediert
CD44
uttrykk. RKO celler ble eksponert for 10 Gy av γ-stråling etter som uttrykk for
CDKN1A product: (
p21) Hotell og
CD44 Hotell og ble analysert ved real-time QRT-PCR. Ekspresjon av
c-MYC
, en direkte Wnt målgen [28], [29] ble også analysert for å kontrollere for opprettholdelse av en stabil tilstand av β-catenin /TCF-4-drevet transkripsjonen aktivitet. Dessuten ble p53, p21, og CD44 proteinnivåer analysert ved immunblotting. Som forventet, ioniserende stråling-indusert DNA-skade resulterte i stabilisering p53 (figur 3A) og den påfølgende transaktivering av p21 ble observert ved alle tidspunkter (figur 3A og B). Imidlertid slik at
CD44
genuttrykk og CD44 proteinnivåer gjorde ikke avta over tid (figur 3A og B), mens
c-myc
mRNA nivåer vært stabil (figur 3B). Disse data indikerer at p53 ikke er i stand til å undertrykke
CD44
ekspresjon i humane tarmkreftceller.
(A) Immunoblotting analyse av p53, p21 og CD44 proteinnivåer i RKO tykktarmskreftceller behandlet med ioniserende stråling. Actin ble brukt som lasting kontroll. (B) QRT-PCR resultater som viser relativ genekspresjon nivåer for
CDKN1, En (
p21
),
CD44, etter og
c-MYC
. Data representerer gjennomsnitt ± SEM av dupliserte eksperimenter,. (*,
P
0,05 sammenlignet med t = 0).
For å utvide våre observasjoner til normal intestinal epitel, vi neste undersøkte CD44 respons på p53-aktivering i epitel-celler som kler krypten-villus akse mus tynntarmen. For dette formålet, vi ansatt
in vitro
dyrkede mus intestinale epitelceller krypter-Haug organoids [19]. Organoids består av fleire krypten domener (Figur 4A) ble utsatt for 10 Gy av γ-stråling etter som
Cdkn1a
,
CD44
, og
c-myc
mRNA uttrykk nivåer var analysert ved real-time QRT-PCR. I likhet med RKO celler,
Cdkn1a
mRNA nivåer ble økt i de organoids svar på ioniserende stråling (figur 4B). Disse resultatene er i overensstemmelse med tidligere studier på strålings-indusert p53-aktivering i mus krypten rommet [30].
CD44
mRNA uttrykk ble ikke vesentlig endret etter stråling, mens uttrykk nivåer
c-myc
holdt seg stabil (figur 4B). Tilsvarende kjemisk induksjon av p53-aktivering ved hjelp av NCS også ført til økte nivåer av
Cdkn1a
mRNA. Samtidig inkubasjon med p53 stabiliseringsmiddel nutlin ytterligere forhøyet
Cdkn1a
mRNA nivåer. I begge forholdene
CD44
mRNA uttrykk ble ikke vesentlig endret, mens
c-myc
uttrykk nivåer forble stabile (Figur 4C) .Disse Resultatene bekrefter våre funn i den menneskelige RKO celler og i primær tykktarm karsinomer, og vise at
CD44
genuttrykk er ikke regulert av p53 i både normale og transform intestinale epitelceller.
(A) Crypt-villus organoid etter en uke med kultur. Pilene viser krypten lignende seksjoner (B) QRT-PCR resultater som viser relative genuttrykk nivåer etter strålebehandling for
Cdkn1a
,
CD44, etter og
c-myc.
Data representerer gjennomsnitt ± SEM av dupliserte eksperimenter; (*,
P
0,05 sammenlignet med t = 0). (C) QRT-PCR resultater som viser relative genuttrykk nivåer etter behandling med NCS alene eller NCS pluss nutlin for
Cdkn1a
,
CD44 Hotell og
c-myc plakater (*,
P
0,05, **,
P
. 0,01 sammenlignet med t = 0)
Diskusjoner
identifisering av p53 som en transcriptional repressor av CD44 uttrykk i brystkreft [16] bedt oss om å undersøke forholdet mellom
p53
mutasjonsstatus og CD44 uttrykk i tykktarmskreft. Vi viser at, annet enn i brystkreft,
CD44
mRNA og proteinnivåer er ikke økt i tykktarm karsinomer med tap av funksjonell p53, sammenlignet med svulster uten
p53
mutasjoner (figur 1C, 2B ). I tillegg
CD44
ekspresjon i både normale og neoplastiske tarmepitelet ble ikke påvirket av kjemisk eller strålings-mediert aktivering av p53, noe som indikerer at p53 ikke fungerer som en transkripsjonen repressor av
CD44
i intestinale epitelceller.
den observerte vevsspesifikk forskjell mellom bryst og kolon i transkripsjonsregulering av
CD44
kan forklares med kompleksiteten av p53-funksjon. Minst to funksjoner av p53 protein er nødvendig for sin gen regulerende funksjon: p53 trenger å gjenkjenne og binde en bestemt DNA-sekvenser i arrangøren av målet genet og p53 må rekruttere flere transkripsjons co-regulatorer (gjennomgått av Laptenko og přívěs [14 ]).
CD44
promotor inneholder en ikke-kanonisk p53-bindingssekvens [16], men flere interaksjoner med ko-aktivatorer og ko-repressorer, så vel som med komponentene i den generelle transkripsjonelle maskiner diktere dens evne til å styre promoter aktiverings~~POS=TRUNC [14]. For eksempel, interaksjoner med ASPP1, BRCA1 eller PTEN, eller koordinert aktivitet av både p63 og p73, har blitt identifisert som determinanter som direkte konkrete svar [14], [31]. Forskjeller i uttrykket og aktiviteten til disse co-regulatorer mellom bryst og tarmepitelet derfor kunne bidra til en avvikende rolle for p53 i transkripsjonen kontroll av
CD44
genet i bryst og tykktarm epitel og kreftceller. I tillegg kan p53 gjennomgå flere typer post-translasjonell modifikasjon, inkludert fosforylering, acetylering og ubiquitinering [32], som kan lede promoter utvalg [33]. Derfor avhenger p53-funksjon på en kompleks og stram regulering, og celle-spesifikke endringer eller interaksjoner kan forklare sin manglende evne til å undertrykke CD44 i intestinale epitelceller. Vår finne at CD44 ekspresjon i normale intestinale epitel og tykktarm karsinomer er uavhengig av p53-ekspresjon og p53-mutasjonsstatus er av betydning for forståelsen av patogenesen av CRC og kan ha viktige terapeutiske implikasjoner. Avvikende CD44 ekspresjon er fordelaktig for vekst, overlevelse, og spredning av tumorceller [1]. I CRC disse biologiske funksjoner av CD44 strekke seg utover dens evne til å antagonisere de pro-apoptotiske og cytostatiske funksjon av p53 [16], [34]. Dette kan i det minste delvis forklarer den begrensede rollen til p53 ved modulering av den umiddelbare fenotypen av nydannede tarm adenomer [35]. Videre har flere studier vist at CD44 er en robust markør med funksjonell betydning for tykktarmskreft stamceller [10], [11], [36] – [38]. Disse cellene antas å være relativt resistente mot terapi og ansvarlig for tumor-formering, noe som gjør CD44 et attraktivt mål for kreft stamcelle rettet behandling, uavhengig av p53.
