Abstract
Bakgrunn
Regulatory T-lymfocytter (treg) infiltrere menneske glioblastom (GBM); er involvert i tumorprogresjon og korrelerer med svulst klasse. Forbigående eliminering av tregs bruker CD25 reduserende antistoffer (PC61) har vist seg å mekle GBM regresjon i prekliniske modeller av hjernesvulster. Kliniske studier som kombinerer Treg depletion med svulst vaksinasjon er i gang for å finne ut om forbigående Treg uttømming kan forbedre anti-tumor immunresponser og forbedre langsiktig overlevelse hos kreftpasienter.
Funn
Ved hjelp av en syngene intracrabial glioblastom (GBM) musemodellen viser vi at systemisk utarming av tregs 15 dager etter tumor implantering hjelp PC61 resulterte i en nedgang i Tregs stede i tumorer, drenering lymfeknuter og milt og forbedret langsiktig overlevelse (50% av musene overlevde 150 dager). Det ble ikke observert bedring i overlevelse når tregs ble tømt 24 dager etter tumor implantering, noe som tyder på at tumorbelastning er en viktig faktor for å bestemme effekten av treg uttømming i kliniske studier. I et T-celleavhengig modell for hjernesvulst regresjon utløst av intratumoral levering av adenovirus vektorer (Ad) uttrykker Fms-lignende tyrosinkinase 3 ligand (Flt3L) og Herpes Simplex Type 1-tymidinkinase (TK) med ganciklovir (GCV), viser vi at administrering av PC61 24 dager etter tumor-implantering (7 dager etter behandling) inhiberte T-celleavhengig tumor-regresjon og langvarig overlevelse. Videre, nedbrytning med PC61 fullstendig hemmet klonal ekspansjon av tumor antigen-spesifikke T-lymfocytter i respons til behandlingen.
Konklusjoner
Våre data viser for første gang, at selv om Treg uttømming inhiberer progresjon /eliminerer GBM svulster, dens effekt er avhengig av tumorbyrde. Vi konkluderer med at denne fremgangsmåten vil være nyttig i en innstilling av minimal restsykdom. Videre, vi viser også at treg tømming, ved hjelp av PC61 i kombinasjon med immunterapi, hemmer klonal ekspansjon av tumor antigen-spesifikke T-celler, noe som tyder på at nye og mer spesifikke mål å blokkere Tregs vil være nødvendig når det anvendes i kombinasjon med behandlinger som aktiverer anti- svulst immunitet
Citation. Curtin JF, Candolfi M, Fakhouri TM, Liu C, Alden A, Edwards M, et al. (2008) Treg utarming hemmer Effekt av kreft Immunterapi: Konsekvenser for kliniske studier. PLoS ONE 3 (4): e1983. doi: 10,1371 /journal.pone.0001983
Redaktør: Karen S. Aboody, City of Hope Medical Center og Beckman Research Institute, USA
mottatt: 9. januar 2008, Godkjent: 10 mars 2008; Publisert: 23 april 2008
Copyright: © 2008 Curtin et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet er støttet av National Institutes of Health /National Institute of nevrologiske lidelser og amp; Stroke (NIH /ninds) Grant 1R01 NS44556.01, Minority Supplement NS445561.01; 1R21-NSO54143.01; 1UO1 NS052465.01, en RO3 TW006273-01 til M.G.C .; NIH /NINDS Grants en RO1 NS 054193,01; RO1 NS 42893,01, U54 NS045309-01 og 1R21 NS047298-01 til P.R.L. Bram og Elaine Goldsmith og Medaljonger Gruppe begavet stoler i Gene Therapeutics til PRL og MGC, henholdsvis The Linda Tallen David Paul Kane Foundation Annual Fellowship og forstanderskapet ved CSMC. MC støttes av NIH /ninds 1F32 NS058156.01
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
glioblastoma multiforme (GBM) er en dødelig primær hjernesvulst som er meget inngripende med tumorceller infiltrere det omliggende friskt hjernevev [1]. Median overlevelse for pasienter diagnostisert med GBM er ett år (4-6 måneder etter tilbakefall), med mindre enn 5% av pasientene gjenværende i live 5 år etter diagnose [2]. Forbedringer i kirurgi, cellegift og strålebehandling har ikke blitt oversatt til betydelig forbedret prognose for pasienter med GBM; langsiktig overlevelse (5 år etter diagnose) har ikke bedret seg siden 1950 [3]. Tumorresidiv forekommer nesten alltid, selv om operasjonen med hell fjerner det meste av den primære tumormasse. Nye behandlingsformer for å forebygge eller behandle tumorresidiv er sterkt behov for å behandle pasienter diagnostisert med GBM.
Immunterapi har blitt foreslått som en kraftig tilnærming for å hindre tumor tilbakefall ved å eliminere kreftceller mens sparsom normalt rundt friske celler [4], [5]. Flere kliniske studier er nå i gang for å teste om immunterapi er trygt og effektivt for å behandle GBM [6], [7]. GBMS enn ekspresstumorantigener som MAGE, HER2 /neu, Tyrosinase, Trp-en, Trp-2, gp100, IL13Rα2, Survivin (anmeldt i [8]) og EphA2 [9]. Immunsystemet skulpturer vanligvis tumorer som resulterer i tap av tumor antigen ekspresjon [10], [11], men plasseringen av GBM i hjernen, et område av immun privilegium [12], [13], eller tilstedeværelse av et sterkt immunsuppressive miljø i hjernesvulster [14], [15] kan være grunner til at GBM vanligvis i løpet av ekspresstumorantigener hos pasienter. Autologe dendrittiske celler (DC) lastet med GBM tumor peptider [16] eller autologe tumor lysat [17] er blitt anvendt for å vaksinere pasienter i to siste fase I kliniske studier. Ingen signifikant økning i overlevelse ble observert ved anvendelse av autologe tumor lysater [17]. Men for å median tid progresjon og median overlevelse av pasienter behandlet med peptid basert vaksiner ble økt sammenlignet med pasienter som ble behandlet i samme tidsperiode med konvensjonell terapi [16]. Interessant nok ble en subpopulasjon av respondere til behandling identifisert ved ekspresjon av lave konsentrasjoner av TGFp i hjernen. Intratumoral ekspresjon av TGFp kan undertrykke adaptive immunresponser mot antigen, [4], [5] og var prediktive for klinisk resultat etter vaksinering [16]. Dessuten sirkulerte tumor antigen spesifikk CD8
+ T-lymfocytter er blitt identifisert i GBM-pasienter [18], men det immunsuppressive miljø i tumoren hindrer eliminering av GBM fra disse pasientene.
T-celle responser overfor tumor antigen målt ved tetramers og ELISPOT ikke alltid korrelerer med tumor regresjon i kliniske studier testing immunterapi for menneskelig GBM [19]. Dette tyder på at suppresjon av effektive immunresponser mot tumorantigener kan påvirke immunavhengig tumor regresjon. Nylig har forskere undersøkt om uttømming av en undergruppe av T-lymfocytter kalt regulatoriske T-lymfocytter (tregs) kan forsterke immunterapi mot kreft. Tregs er en undergruppe av CD4
+ T-lymfocytter som konstitutivt uttrykker transkripsjonsfaktoren foxp3, høyaffinitets-IL2-reseptoren CD25 og B7-liganden CTLA4 [20]. Tregs er nødvendige for vedlikehold av toleranse i løpet av levetiden til organismen [21] og mutasjoner i foxp3 er kjent for å forårsake akutt autoimmune sykdommer hos mennesker [22]. Foxp3
+ Tregs akkumuleres i menneske hjernesvulst under tumorprogresjon [23], og har blitt funnet å korrelere med tumor grad [24]. Overlevelse ble forbedret da tregs ble tømt fra GL261 svulst bærende mus ved hjelp av CD25 antistoffer administrert 7 dager etter tumor implantasjon og tre ganger per uke i 3 uker etterpå [25]. Også administrering av CD25 reduserende antistoffer ble også vist å forbedre overlevelse når de administreres i kombinasjon med DC transfektert med tumor mRNA i en GBM modell [26].
Vi har nylig utviklet en kombinert gen terapeutisk tilnærming rettet mot engineering tumor mikromiljøet for å indusere migrering inn i tumormassen av APC og utløse tumorcelledød [27]. Vår fremgangsmåte består av å uttrykke Fms-lignende tyrosinkinase-3-ligand (Flt3L) som induserer dendrittisk celle (DC) infiltrasjon inn i hjernen parenchyma [28] i kombinasjon med det betingede cytotoksiske genet tymidinkinase (TK) [27], [29], som i nærvær av GCV induserer tumor celledød. Denne kombinerte metode induserer T-celleavhengig tumor regresjon [27]. Vi ønsket å vurdere virkningene fremkalt av uttømming av Tregs; på tumorprogresjon hos ubehandlede GBM bærende mus og på T-celleavhengig hjernesvulst regresjon utløst av Ad-Flt3L og Ad-TK behandling. Våre data vist at uttømming av Tregs ved hjelp av CD25-spesifikke hybridomet PC61 indusert tumorregresjon og langvarig overlevelse når de administreres 15 dager etter tumor-implantering, uavhengig av tumor antigen-spesifikk T-lymfocytter. I kombinasjon med intratumoral levering av Ad-Flt3L og Ad-TK, men vi fant at PC61 administrasjon 24 dager etter tumor implantasjon (7 dager etter behandling) helt undertrykt adaptive immunresponser mot GL26 tumorantigener. I tillegg til Tregs, blir CD25 også uttrykkes på celleoverflaten av forløper B og T-lymfocytter og en moden subpopulasjon av DC [30] og er også oppregulert på celleoverflaten av aktiverte T-lymfocytter og B-lymfocytter [31]. I vår modell, administrasjon av CD25-antistoffer elimineres aktivert, CD25
+ T-lymfocytter og hindret klonal ekspansjon av tumor antigen spesifikke T-celler. Våre data tyder på at bruk av PC61 sikte på treg tømming kan redusere effekten av immunterapeutiske regimer ved å undertrykke aktivering og klonal ekspansjon av tumor antigen spesifikke T-lymfocytter.
Resultater
syngene intrakranielle GBM svulster er tett infiltrert med immunceller, inkludert Tregs
Opphopning av foxp3
+ Tregs i menneskelige hjernesvulst korrelerer med karakteren av svulsten og pasient overlevelse [24]. Akkumulering av foxp3
+ Tregs i syngene mus gliomer er også blitt beskrevet og uttømming av Tregs med CD25-spesifikke immunglobuliner kan indusere tumor-regresjon og forbedre overlevelse i disse prekliniske modeller [25], [32], [33]. For å undersøke hvorvidt Treg uttømming kan forbedre terapeutisk resultat i kombinasjon med immunterapi /genterapi, vi først fastslått hvor Tregs infiltrert inn i syngeniske mus glioma som oppstår ved intrakranial implantasjon av GL26 celler i hjernen striatum. Implantasjon av syngene GL26 celler reproduserbart førte til den lineære veksten av svulster (R
2 0,99) med en gjennomsnittlig tumorvolum på ca 0,5 mm
3 på dag 15 og 30 ganger større (15mm
3) på dag 24 (fig. 1A). Disse svulstene stille rikelig infiltrasjon av CD45
+ og F4 /80
+ celler, som er tydelig i hele tumormasse og også ved grensen (figur 1B). Immun celleinfiltrasjon inn i tumorene ble også vurdert ved hjelp av strømningscytometri 24 dager etter tumor-implantasjon (fig. 1 C). Vi oppdaget tumor infiltrerer MDC (CD11c
+ CD45
+ IA
b +, fig. 1Ci) og Mii (CD11b
+ CD45
+ IA
b +, fig. 1Cii) som utgjorde 3,5% og 19% av det totale antall CD45 + immunceller tilstede i tumoren respektivt. -Lymfocytter ble også identifisert og utgjorde ~80% av det totale antall CD45 + immunceller infiltrerer tumorene (fig. 1 C iii-vi). Disse inkluderte CD4
+ T-celler (CD3ε
+ CD4
+ CD8a
-, 26%), CD8a
+ T-celler (CD3ε
+ CD4
– CD8a
+ 18%), foxp3
+ Tregs (CD3ε
+ CD4
+ foxp3
+, 8,4%), NK-celler (CD3ε
– NK1.1
+ CD45
+ 18%), NK-T-celler (CD3ε
+ NK1.1
+ CD45
+, 7%) og B-celler (CD3ε
– CD19
+ CD45
+, 5%). Tilstedeværelsen av CD4
+, CD8a
+, CD19
+ lymfocytter samt CD205 MDC ble også observert av immunfluorescens (Fig. 1 D). I tillegg ble det observert et stort antall lymfocytter som var immunreaktive for CD25 innen tumoren ved hjelp av konfokal mikroskopi (fig. 1 D) og strømnings-cytometri (CD3ε
+ CD25
+ CD45
+) (fig. 1 E, F). Videre er prosentandelen av CD3ε
+ T-celler som uttrykte celleoverflate-CD25 var ~40% av det totale antall tumor infiltrerende T-celler og var sterkt forhøyet i tømme- (cervikal) lymfeknute (DLN) (p 0,05) og tumor (p 0,01) (Fig. 1 E). sammenlignet med milten hos tumorbærende mus
(A) GL26 tumorvolum 7, 14 og 21 dager etter implantion inn i hjerne striatum fra C57BL /6 mus ble bestemt. Reaktiv astrocytic farging (GFAP +) ble brukt til å definere grensen av tumoren med ikke-ondartet hjernevev. Representative deler av mus hjerner som har svulster implantert 7, 14 og 21 dager tidligere, og farget med GFAP vises til venstre. Tumorvekstkinetikk ble vesentlig eksponensiell over tidsperioden analysert med en doblingstid på omtrent 1.8 dager. 5 mus ble brukt for å bestemme tumorvolumet ved hvert tidspunkt. (B) infiltrasjon av immunceller i intrakranielle GL26 svulster. Hjerne seksjoner fra tumorbærende mus ble farget med antistoffer mot CD45 (leukocytter) eller F4 /80 (makrofager /aktivert microglia). Representative Confocal bildene viser immunceller (grønt) i tumormassen og i kreft grenser. DAPI (blå) ble anvendt for å farge kjerner. Gule piler indikerer immunreaktive celler. T: svulst. (C) Tumor infiltrerende immunceller ble isolert fra tumorer 24 dager etter tumor-implantasjon og analysert ved hjelp av strømningscytometri. (I) Dot tomt på CD11c mot I-Ab som først ble inngjerdet for live CD45 + leukocytter. DC (CD11c + CD45 + I-Ab +) er vist i den røde boksen. (Ii) Makrofager (Mii) ble vurdert av gating levende leukocytter med CD45, deretter plotte CD11b mot I-Ab. Den røde boksen skisserer befolkningen i tumor infiltrerer makrofager (CD11b + CD45 + I-Ab +). (Iii) T-celler ble farget med CD3ε-PE, CD4-PerCP og CD8a-FITC. Plottet viser CD4 mot CD8a når cellene først ble inngjerdet for CD3ε + live-leukocytter. CD4 + T-celler og CD8a + T-celler er vist i røde boksene. (Iv) Tumor infiltrerer tregs ble observert ved farging med CD3ε-PE, CD4-PerCP og foxp3-FITC. CD3ε + live-leukocytter ble inngjerdet og prikkplotter vise foxp3 mot CD4 farging. Befolkningen i Tregs (CD4 + foxp3 + CD3ε +) er vist i den røde boksen. (V) NK og NK-T-celler ble visualisert ved gating levende CD45 + leukocytter, så viser NK1.1 mot CD3ε. Befolkningen av tumor infiltrerende NK-celler (CD3ε- CD45 + NK1.1 +) og NK-T-celler (CD3ε + CD45 + NK1.1 +) er vist i røde bokser. (Vi) Tumor infiltrerer B-celler er visualisert ved gating for live leukocytter, deretter plotte CD45 mot CD19. Befolkningen i B-celler (CD19 + CD45 +) er vist i en rød boks. Prosentandelene av hver immuncellepopulasjon infiltrerer tumoren i forhold til det totale antall tumor CD45 + celler er angitt i representative dot plots. (D) Nissl-farging ble anvendt for å visualisere tumorer i hjernen. Svulster er tett i Nissl substans, så flekken mørkere enn normalt hjernevev. Representative Confocal bildene viser tumor-infiltrerende CD4 + T-celler, CD8 + -T-celler, CD205 + mDCs, CD19 + B-celler og CD25 + immunceller (sett i grønn) og DAPI (blå) ble anvendt for å visualisere kjerner. Gule piler indikerer immunreaktive celler. (E) flowcytometrisk analyse av prosentandelen av T-celler som uttrykker CD25 i milten, DLN og svulster i mus med intrakranielle GL26 hjernesvulster 24 dager etter tumor implantasjon. (F) Representative prikkplotter av CD25 vs CD3ε i immunceller isolert fra milten, LN og tumor. Prosentandelene av CD25 + -celler befolkningen med hensyn til det totale antall CD3ε + celler i tumoren, drenering lymfeknuter eller milt er angitt i representative dot plots.
Nedbryting av Tregs ved hjelp av PC61 induserer hjerne tumorregresjon men også reduserer T-celler i svulsten og DLN
med tanke på at vi har oppdaget omfattende infiltrasjon av T regs innenfor intrakranielle GL26 svulster, rettet vi å utarme denne immuncellepopulasjonen for å bestemme deres virkning på tumorceller progresjon og på anti-tumor immunrespons indusert av en T-celleavhengig immunterapeutisk tilnærming, dvs. Ad-Flt3L /TK. Rotten IgG1 hybridom PC61 ble funnet å binde med høy affinitet mus IL-2-reseptoren (CD25) [34] og
in vivo
administrering av PC61 til mus forårsaker uttømming av Tregs i mer enn en uke [33] , [35]. Derfor brukte vi dette antistoffet å indusere T reg uttømming
in vivo
i en syngene mus intrakranielle glioma modell. Vi først avgjøres om PC61 vil påvirke svulst celle levedyktighet og vekst
in vitro Hotell og
in vivo
. Inkubasjon av GL26 celler med PC61 påvirket ikke GL26 celleviabilitet (Fig. 2A) eller spredning
in vitro plakater (Fig. 2B). Vi deretter administrert PC61 eller isotype kontroll IgG til tumorbærende athymiske nu /nu mus, som har vist seg å være mangelfull i T-reg [26], [36]. Tallying med andre rapporter [26], fant vi at tumorvekst i T reg mangel
nu /nu
immunmangelfull mus ble ikke påvirket av PC61; begge isotypekontroll eller PC61-injiserte mus falt på grunn av tumorbyrden 18-22 dager etter tumorimplantering.
(A) GL26 cellene ble inkubert i 48 timer med 100 ug /ml PC61 eller 100 ug /ml rotte IgG1 isotypekontroll. Cellene ble deretter høstet og farget med Annexin V-FITC og propidium jodid for å identifisere apoptotiske celler. Ingen signifikant økning i apoptose ble observert når cellene ble inkubert med PC61 eller isotype kontroll immunoglobuliner er sammenlignet med ubehandlede kontroller (p 0,05). Det ble observert en stor økning i apoptose når celler ble inkubert i 4 timer med H2O2 (p 0,001). Feilstolpene representerer standardavviket av 3 replikater og analysen ble gjentatt 3 ganger. One Way ANOVA med Tukey innlegg test ble brukt til å beregne signifikante forskjeller (*** p 0,001). (B) proliferasjon av GL26 celler ble målt ved å registrere BrdU-inkorporering i DNA. Det ble ikke observert noen signifikant forskjell i spredning (p 0,05) når cellene ble inkubert med PC61 (rotte IgG1αCD25) sammenlignet med isotype kontroller (rotte IgG1) eller ubehandlede celler (*** p 0,001 sammenlignet med negativ (ingen celler) kontroll, ns = ikke signifikant). (C) atymisk nu /nu mus (Balb /c bakgrunn) ble utfordret med en enkelt intrakranial injeksjon av GL26 celler og behandlet 15 dager senere med 1 mg enten PC61 eller isotype kontroll-immunoglobuliner injisert i.p. Overlevelse ble overvåket og mus ble avlivet når døende. Det ble ikke observert noen signifikant forskjell i overlevelse ved hjelp av en log rank test (p 0,05) (n = 5)
Etter utelukker noen direkte effekt av PC61 på tumorcellevekst studerte vi effekten av T. reg uttømming i villtype C57 /B6 mus med intrakranielle GL26 glioma. Den eksperimentelle paradigmet som brukes er vist i fig. 3A. Nedbryting av tregs 15 dager etter tumorcelle implantasjon økt betydelig antall langsiktige overlevende med 40% av mus var fortsatt i live 150 dager senere (p 0,05, figur 3B.). Dette var mer enn 5 ganger lenger enn den midlere overlevelse av kontroll-tumorbærende mus (Fig. 3B). Det ble ikke observert signifikant økning i langsiktig overlevelse når Tregs ble tømt i større svulster (24 dager) (p 0,05) og bare 10% av musene overlevde lang sikt fra denne gruppen (Fig 3B.). Interessant, vi ikke observere noen DTH reaksjoner når vi injisert bestrålte GL26 celler i fotbladet langsiktige overlevende fra Treg utarmet mus (Fig. 3C). For å vurdere effekten av behandling med PC61
in vivo
, vi analyserte tilstedeværelse av foxp3
+ CD4
+ Tregs infiltrere GBM masse samt i drenering lymfeknuter og milt etter intraperitoneal injeksjon av PC61 (dager 15 og 24) eller rotte-lgG1 isotype kontroll (dag 15 dager) inn i tumorbærende mus. PC61 injeksjon på dag 15 resulterte i en 9 gangers reduksjon (p 0,001) i antall tumor infiltrerende Tregs når det måles ved hjelp av flow cytometri 12 dager senere (dag 27), og injeksjon av PC61 på dag 24 resulterte i nesten fullstendig uttømming av Tregs (p 0,001) i svulsten 3 dager senere (dag 27) (fig. 3D). Som forventet, perifere treg populasjoner i de drenerende lymfeknuter (Fig. 3E) og milt (Fig. 3F) ble også betydelig redusert sammenlignet med isotype behandlet kontroller (p 0,001). Interessant, observerte vi en tre gangers reduksjon i den absolutte prosentandelen av CD4
+ T-celler (fig. 4A) og CD8a
+ T-celler (Fig. 4B) infiltrere inn i svulsten etter administrering av PC61. Videre PC61 betydelig utarmet bestander av CD4
+ T-celler (p. 0,05, fig 4C) og CD8
+ T-celler (p. 0,01, figur 4D) i tumor drenering lymfeknuter. Det var ingen endring bemerket i prosenter av CD4
+ T-celler og CD8a
+ T celler i milten (p . 0.05, figur 4E-F) og Mii og DC forble uendret i tumorer og drenering lymfeknuter men økte noe i milt (fig. 5).
(A) Diagram som viser de ulike behandlinger som 4 årskull av svulst bærende mus. GL26 celler ble implantert i hjernen hos alle mus på dag 0 og ble behandlet ved intratumoral levering av saltvann på dag 17 med uttømming av CD25
+ -celler ved hjelp av PC61 på dag 15 (grønn), eller på dag 24 (rød). Kontrollgrupper av tumorbærende mus mottok rotten lgG1 isotype kontroll på dag 15 (blå), eller ingen systemisk administrering av immunoglobuliner (svart) som angitt. Mus ble benyttet enten for overlevelse studier, eller avlivet på dag 27 etter tumorimplantering for analyse av immuncellepopulasjoner ved strømningscytometri. (B) Kaplan-Meier-kurve som viser overlevelse av de 4 gruppene av mus som er beskrevet i (A). Ti mus ble anvendt i hver gruppe og en log-rank-test ble anvendt for å beregne betydning mellom ubehandlet gruppe og PC61-behandlede grupper. * P 0,05 sammenlignet med ubehandlede mus og isotype kontroll-behandlede mus. (C) DTH testen ble utført på langsiktig overlevende mus 100 d etter svulst implantasjon. Mus hadde opprinnelig blitt behandlet med PC61 på dag 15 (grønne linjer). Bestrålt GL26 celler i PBS i høyre bakre footpad (fylt boks) eller PBS kontroll i bakre venstre fotblad (åpen boks) av mus. Tykkelsen av fotpute ble bestemt 0 timer, 4 timer, 24 timer og 48 timer etter injeksjon av bestrålte celler eller PBS. Two Way ANOVA med Tukey innlegg test ble brukt til å beregne signifikante forskjeller. (D-F) Tregs (CD3ε
+ CD4
+ foxp3
+) infiltrerende tumorer (D), drenerende lymfeknuter (E) eller milten (F) ble kvantifisert i mus administrert rotte lgG1 isotype kontroll ( iso) eller PC61 på dag 15 (15) eller dag 24 (24) som angitt i grafene (til venstre). Prikkplott (til høyre) viser representative data fra 5 mus per gruppe. Prosentandelene av T kjørte med hensyn til det totale antall CD45 + celler i svulster, drenerende lymfeknuter (DLN) eller milt er angitt i representative dot plots. One Way ANOVA med Tukey innlegget til test ble anvendt for å bestemme signifikante forskjeller (*** p 0,001).
C57BL /6 mus ble utfordret med tumorceller på dag 0, og behandlet på dag 17 etter intratumoral levering av saltvann. Tregs ble utarmet på hver dag 15 eller dag 24 av ip injeksjon av PC61. Immun-celler ble isolert fra milten, cervical LN og intrakranial tumor på dag 27 etter tumorimplantering for å bestemme prosentandelen av CD4 + T-celler og CD8a + T-celler i hvert vev. Prosentandelen av tumor infiltrerende immunceller som ble CD4 + T-celler (CD3ε + CD4 + CD8a-) (A) og CD8a + T-celler (CD4 + CD3ε CD8a +) (B); prosentandelen av immunceller i de drenerende lymfeknuter som ble CD4 + T-celler (CD3ε + CD4 + CD8a-) (C) og CD8a + T-celler (CD4 + CD3ε CD8a +) (D); og prosentandelen av immunceller i milten som ble CD4 + T-celler (CD3ε + CD4 + CD8a-) (E) og CD8a + T-celler (CD4 + CD3ε CD8a +) (F) er vist i diagrammene (til venstre). Representative prikkplotter for hver behandlingsgruppe vises på høyre side (gated for live leukocytter med FSC vs SSC og CD3ε + T-lymfocytter). Prosentandelene av hver immuncellepopulasjon med hensyn til det totale antall CD45 + celler i svulster, drenerende lymfeknuter (DLN) eller milt er angitt i representative dot plots. One Way ANOVA med Tukey innlegg test ble brukt til å beregne signifikante forskjeller. (* P 0,05, ** p 0,01).
GL26 celler ble implantert i hjernen striatum av C57BL /6 mus. Rat IgG1 isotype kontroll immunglobuliner (-) ble administrert på dag 15 og PC61 ble administrert på dag 15 eller dag 24 som angitt. Prosentandelen av tumor infiltrerende makrofager (Mii; CD11b + CD45 + I-Ab +) (A, C, E) og myeloide Dendrittceller (MDC; CD11c + CD45 + I-Ab +) (B, D, F) ble kvantifisert ved dag 27 etter tumor implantering ved hjelp av flow cytometri i tumoren (A, B) dLN (C, D) og milt (E, F). Prosentandelene av hver immuncellepopulasjon med hensyn til det totale antall CD45 + celler i svulster, drenerende lymfeknuter (DLN) eller milt er angitt i representative dot plots. 5 og 10 mus ble analysert for hver gruppe. One Way ANOVA med Tukey innlegg test ble benyttet for å bestemme statistisk signifikans.
Behandling med PC61 hindrer aktivering av adaptive anti-tumor immunresponser og hemmer tumor regresjon når den brukes i kombinasjon med Ad-Flt3L og Ad- TK
Vi har også som mål å undersøke effekten av utarming av tregs hjelp av en anti-CD25 immunoglobulin på effekten av T-celle-avhengige immunterapi mediert av intratumoral levering av Ad-Flt3L og Ad-TK [27], [37]. Aktiverte CD4
+ og CD8
+ T-lymfocytter oppregulere celleoverflate CD25 etter innledende binding av TCR med antigenet som vises på MHC [30], [31], og dette kan forklare den tilsynelatende reduksjon i T-celler som ble observert hos svulster (fig. 4A-B) og dLN (fig. 4C-D) etter administrasjon av PC61. For å undersøke dette videre, og avgjøre om eliminering av tregs hjelp PC61 kan påvirke T-celleavhengig immunterapi av GBM, vi implantert svulster i striatum på dag 0 og mus ble behandlet med Ad-Flt3L og Ad-TK 17 dager senere, mens PC61 eller isotype kontroll-immunoglobuliner ble administrert til grupper på dag 15 eller dag 24 (fig. 6A). Når vi injisert Ad-Flt3L og Ad-TK inn i tumoren på dag 17 (når svulsten var 1 mm
3 i størrelse (Fig. 1A) vi har observert en sterk økning i overlevelse med 50% av musene i live 150 dager senere ( p 0,01, figur 6B) som ikke ble negativt påvirket av administrasjon av rotte IgG1 isotype kontroll (p .. 0,05) PC61 administrert 2 dager før injeksjon av Ad-Flt3L og Ad-TK redusert overlevelse til 30%, selv om dette ikke var signifikant forskjellig fra isotype behandlet kontroller (p . 0.05, figur 6B). Men når vi behandlet mus med Ad-Flt3L og Ad-TK på dag 17 og utarmet Tregs på dag 24, fant vi at langsiktig overlevelse ble betydelig redusert i forhold med mus som ikke fikk PC61. (p. 0,05, figur 6B) Bare 10% av tumorbærende mus overlevde 150 dager senere, noe som tyder på at administrasjon av PC6 17 d etter intratumoral levering av Ad-Flt3L og Ad-TK negativ innvirkning T det ble ikke observert celle avhengig hjernesvulst regresjon i langtids overlevende etter behandling med Ad-Flt3L og Ad-TK, en DTH respons på bestrålte GL26 celler i fotbladet når musene hadde blitt administrert enten PC61 (p 0,01). eller isotype kontroller (p . 0,001, fig 6D ). Interessant vi ikke observere noen økning i IFNy sekresjon T-lymfocytter som svar på BMDC lastet med GL26 celleekstrakter når PC61 ble injisert enten før (15 dager) eller etter (24 dager) behandling som bruker Ad-Flt3L og Ad-TK (p 0.05, fig. 6D). Antallet tumor infiltrerer tregs ble redusert etter systemisk levering av PC61 (p. 0,001, figur 6E) og andelen av tregs ble også betydelig redusert i DLN og milt, (p. 0,001, figur 6F-G) uavhengig av om musene ble behandlet med saltvann eller med Ad-Flt3L og Ad-TK.
(A) C57BL /6 mus ble utfordret med tumorceller på dag 0, og behandlet på dag 17 av intratumoral levering av Ad-Flt3L og Ad-TK eller saltvann som angitt. Tregs ble utarmet på hver dag 15 (grønn) eller dag 24 (rød) av ip injeksjon av PC61 eller på dag 15 med isotypekontroll (blå). Immun-celler ble isolert fra milten, cervical LN og svulsten. Mus ble enten anvendt for overlevelse studier eller avlivet på dag 27 for analyse av immuncellepopulasjoner ved strømningscytometri og ELISPOT. (B) Kaplan-Meier kurve viser overlevelsesdata fra 10 mus per gruppe. Statistisk signifikante forskjeller til Ad-Flt3L og Ad-TK behandlede mus bare (svart linje, ingen PC61 depletion) ble beregnet ved bruk av log-rank test (* p 0,05, ** p 0,01). Administrasjon av PC61 til mus 24 dager etter tumor implantasjon (7 dager etter behandling med Ad-Flt3L og Ad-TK) betydelig redusert langsiktig overlevelse. (C) Kreft bærende mus ble behandlet med Ad-Flt3L og Ad-TK alene (svarte linjer) eller med Ad-Flt3L og Ad-TK med PC61 uttømming på dag 15 (grønne linjer). Langtids overlevende (60 dager etter tumor-implantering) ble bedømt for en DTH reaksjon på bestrålte GL26 celler injisert inn i den høyre fotpute (sammenlignet med PBS bare i den venstre fotpute). Two Way ANOVA med Tukey innlegg test ble brukt til å beregne signifikante forskjeller mellom gruppene (*** p 0,001 mus behandlet med Ad-Flt3L og Ad-TK ingen utarming, p 0,01 Ad-Flt3L og Ad-TK behandlet mus utarmet med PC61 på dag 15). (D) IFNy ELISPOT som viser det totale antall av IFNy-produserende T-lymfocytter som ble stimulert med DC lastet med GL26 tumorekstrakter. T-lymfocytter ble renset fra mus 10 d etter behandling med enten Ad-Flt3L og Ad-TK (+) eller saltvann (-) som angitt. Svarte striper er T-lymfocytter fra mus som ikke fikk CD25 tappe immunglobuliner. Grønne barer er T-lymfocytter isolert fra mus utarmet med PC61 2 dager før behandling med Ad-Flt3L og Ad-TK (dag 15 etter tumor implantasjon) og røde linjene er T-lymfocytter isolert fra mus utarmet med PC61 7 dager etter behandling med Ad-Flt3l og Ad-TK (dag 24 etter tumor implantasjon). (E-G) Tregs (CD3ε
+ CD4
+ foxp3
+) infiltrerende tumorer (E), drenerende lymfeknuter (F) eller milten (G) ble kvantifisert i mus administrert rotte lgG1 isotype kontroll ( Iso) eller PC61 på dag 15 (15) eller dag 24 (24) som angitt i grafene (til venstre). Administrasjon av PC61 til mus resulterte i lang sikt uttømming av Tregs i perifere områder (milt og lymfeknuter) og ved tumoren. Prikkplott (høyre) display representant betyr ± SEM av foxp3
+ Tregs kvantifiseres fra fem mus per gruppe. Det totale antall T-kjørte i tumorer (E) og prosentandelen av T kjørte med hensyn til det totale antall CD45 + -celler i de drenerende lymfeknuter (DLN) eller milt (F og G) er angitt i representative dot plots. Two Way ANOVA med Tukey innlegg test ble benyttet for å bestemme signifikante forskjeller (*** p 0,001).
Behandling med PC61 hindrer økning i tumor infiltrerer T-celler og Mii men ikke DC etter behandling med Ad
