Abstract
Bakgrunn
Kreft /testis antigener (oppfordringer) ble først oppdaget som immunogene mål normalt uttrykt i germline celler, men forskjellig uttrykt i en rekke av kreft hos mennesker. I denne studien brukte vi en integrerende epigenetisk screening tilnærming for å identifisere coordinately uttrykte gener i menneske ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) hvis transkripsjon er drevet av promoter demetylering.
Metodikk /hovedfunnene
Vår screening tilnærming funnet 290 betydelige gener fra de over 47.000 transkripsjoner innlemmet i Affymetrix human Genome U133 Plus 2.0 uttrykk array. Av de 55 kandidatene, 10 viste både differensial overekspresjon og promoter region hypometylering i NSCLC. Overraskende, 6 av de 10 genene ble oppdaget av denne tilnærmingen var CTAs. Ved hjelp av en separat kohort av primærtumor og normalt vev, validert vi NSCLC promoter hypometylering og økt uttrykk av kvantitativ RT-PCR for alle 10 gener. Vi merket betydelig, koordinert koekspresjon av flere mål gener, samt koordinert promoter demetylering, i et stort sett av individuelle svulster som ble knyttet til SCC subtype av NSCLC. I tillegg har vi identifisert 2 roman målgener som viste vekstfremmende effekter i flere cellelinjer.
Konklusjon /Betydning
Koordinert promoter demetylering i NSCLC er assosiert med avvikende uttrykk for CTAs og potensial, nye kandidat protooncogener som kan identifiseres ved hjelp av integrerende oppdagelse teknikker. Disse funnene har betydelige konsekvenser for oppdagelsen av nye CTAs og CT antigen rettet immunterapi
Citation. Glazer CA, Smith IM, Ochs MF, Begum S, Westra W, Chang SS, et al. (2009) Integrative Funn av epigenetiske Derepressed kreft testis antigener i NSCLC. PLoS ONE 4 (12): e8189. doi: 10,1371 /journal.pone.0008189
Redaktør: Alfons Navarro, Universitetet i Barcelona, Spania
mottatt: 18 september 2009; Godkjent: 16 november 2009; Publisert: 04.12.2009
Copyright: © 2009 Glazer et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dr. Califano er støttet av en klinisk Innovator Award fra Flight Attendant Medical Research Institute, og National Cancer Institute SPORE (5P50CA096784-05) og EDRN U01CA084986. Dr. Glazer er finansiert delvis av en NIH T32 forskerutdanning Grant. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Det er velkjent at CTA er overuttrykt i forskjellige tumortyper, med liten eller ingen ekspresjon i normalt humant vev; imidlertid, er mekanismen av denne differensial uttrykket ikke godt forstått [1]. Epigenetiske endringer, inkludert forandringer i promoteren metylering har blitt forbundet med kreftspesifikke uttrykk forskjeller i humane maligniteter, inkludert ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) [2], [3], [4], [5], [6], [7]. Arrangøren hypermethylation har først og fremst vært ansett som en mekanisme av tumor suppressor genet inaktivering; har imidlertid den globale genomisk hypometylering blitt rapportert i nesten alle tumorer [2], [4], [8], [9]. Det er også kjent at CTA, spesielt de som er kodet av X-kromosomet (CT-X-antigener), blir uttrykt i assosiasjon med promoter demetylering eller hel genomisk hypometylering [10], [11], [12].
lungekreft er den ledende årsak til kreft-relaterte dødsfall i verden, med over 213 000 nye tilfeller og 160.000 dødsfall rapportert i 2007; NSCLC står for ca 75% av disse tilfellene [13]. Den høye dødeligheten i NSCLC skyldes diagnose på et avansert stadium, en høy forekomst av tilbakefall til tross definitive lokoregionalt ledelse, og det faktum at ingen behandling for tilbakevendende lungekreft har vært forbundet med økt langtidsoverlevelse [6].
en tilnærming for å forbedre NSCLC dødeligheten har vært utviklingen av kreftvaksiner som har som mål å indusere en vertens immunrespons mot kreftceller. CTA er attraktive mål for svulst immunterapi på grunn av deres begrensede uttrykk mønstre i normal menneskelig vev. For eksempel er NY-ESO-1 og MAGEA3 tiden gjennomgår kliniske studier i ulike menneskelige maligniteter, inkludert NSCLC. Etterforskerne har antydet at kombinert bruk av coordinately uttrykt CTAs og andre tilknyttede antigener kan hjelpe i utformingen av mer effektive, polyvalente immunterapeutiske protokoller i NSCLC og andre krefttyper; Men det er foreløpig svært lite kjent om koekspresjon mønstre av disse genene [14], [15], [16].
Til dags dato, en omfattende, genom-wide tilnærming til å identifisere coordinately uttrykt CTAs og andre differensielt uttrykte gener aktiveres av arrangøren demetylering i NSCLC er ikke utført. I denne studien ble det benyttet en roman, integrerende epigenetisk screening metode som kombinerer 5-aza-deoksycytidin og trichostatin A (5-aza /TSA) behandling av normale lungeceller og mRNA microarray ekspresjon analyse av primær vev for å identifisere gener som begge aktiveres av DNA hypometylering og forskjellig oppregulert på en koordinert måte i NSCLC. Vi var i stand til å definere et sett med coordinately uttrykt CTAs og romanen, vekstfremmende gener som aktiveres i forbindelse med samordnet promoter demetylering. Disse dataene har implikasjoner for mekanismen for aktivering av CTA, design av immunterapeutiske strategier, samt identifisering av potensielle protooncogener og nye biologiske mål for gen-rettet terapi for NSCLC.
Materialer og metoder
histopatologi
Alle prøvene ble analysert ved patologi avdeling ved Johns Hopkins Hospital. Vev ble innhentet via Johns Hopkins Institutional Review Board godkjent protokollen NA_00001911. Skriftlig informert samtykke ble oppnådd fra hvert individ før bruken av deres vev for vitenskapelig forskning. Tumor og normalt lungevev fra kirurgiske prøver ble frosset i flytende nitrogen umiddelbart etter kirurgisk reseksjon og lagret ved -80 ° C inntil bruk. Normale prøver ble microdissected og DNA forberedt fra normal lungeparenkym. Tumorprøver ble bekreftet å være NSCLC og deretter microdissected til å gi minst 80% tumorceller. Tissue DNA og RNA ble ekstrahert som beskrevet nedenfor.
5Aza-DC og TSA Behandling av celler
Vi behandlet normale humane lungecellelinjer (NHBE og SAEC, Lonza, Walkers, MD) i tre eksemplarer med 5-aza-deoksycytidin (cytosin en analog som ikke kan være metylert) og trichostatin A (en histondeacetylase-inhibitor) som tidligere beskrevet [17]. I korthet ble cellene splittet til lav tetthet (2,5 × 10
5 celler og 6 × 10
5/100 mm fatet for SAEC og NHBE henholdsvis) 24 timer før behandling. Stamløsninger av 5Aza-dC (Sigma, St. Louis, MO) og TSA (Sigma) ble oppløst i 50% eddiksyre og 100% etanol, respektivt. Celler ble behandlet med 5 uM 5Aza-deoksycytidin i 72 timer og 300 nmol /L TSA for de siste 24 timer. Baseline ekspresjon ble etablert av mock-behandlede celler med samme volum av eddiksyre eller etanol i tre eksemplarer.
RNA ekstraksjon og Oligonukleotid Microarray analyse
Total cellulær RNA ble isolert ved anvendelse av Trizol (Life Technologies, Gaithersburg, MD) og RNeasy kit (Qiagen, Valencia, CA) i henhold til produsentens instruksjoner. Vi gjennomførte oligonukleotid microarray analyse ved bruk av Genechip U133 Plus 2.0 Affymetrix uttrykk mikromatriser (Affymetrix, Santa Clara, CA). Prøvene ble omdannet til merket, fragmentert, cRNA pr den Affymetrix protokollen for bruk på uttrykket microarray. Signalintensitet og statistisk signifikans ble etablert for hver transkripsjon hjelp dChip versjon 2005 å først analysere og normaltabelldata og deretter Betydningen Analyse av mikromatriser (SAM) [18]. SAM produksjonen ble beregnet til en d-verdi på 1,126 som gir en falsk funnrate og d-poengsum cutoff på 5,065% og 1,885. Dette identifisert totalt 12,132 oppregulert kandidat gener etter 5Aza-dC /TSA behandling. All microarray data er MIAME kompatibel, og rådata har blitt deponert i en MIAME kompatibel database, GEO, som beskrevet av MGED Society.
Offentlige datasett
De offentlige databasene som brukes i denne studien var University of California Santa Cruz (UCSC) human Genome referansesekvens og merknaden databasen fra mars 2006 fryse (hg18). Vi fikk 40 normal lunge og 111 NSCLC uttrykk mikromatriser fra Expo datasett (alt utført på Affymetrix U133 Plus 2.0 mRNA uttrykk plattform) er tilgjengelig på nettet som en del av Gene Expression Omnibus (GEO /NCBI). Deponeringsnummer for disse matriser er henholdsvis GSE1643 og GSE3141. De mikromatriser fra normalt vev og svulsten var først normalisert for COPA analyse ved hjelp dChip versjon 2005.
Kreft avvikende Profil Analyse (COPA)
Vi søkte COPA til vår kohort av 151 vev (111 svulster, 40 normaler), med hver genuttrykk datasett som inneholder 54,613 probe sett fra Affymetrix U133 Plus 2.0 mRNA uttrykk plattform. Kort, genekspresjon verdier ble median sentrert, sette hvert gen median uttrykk verdi til null. Median absolutte avvik (MAD) ble beregnet og skalert til en ved å dele hver genuttrykk verdien av sin MAD. Av notatet, ble median og MAD brukes for transformasjon i motsetning til gjennomsnitt og standardavvik, slik at avvikende uttrykk verdier ikke urimelig påvirke fordelingen estimater, og blir dermed bevart etter normalisering. Endelig er de 75, 90, og 95. persentilene av de transformerte uttrykk verdiene beregnet for hvert gen og deretter genene ble rang bestilt av sine persentil score, noe som gir en prioritert liste over uteligger profiler. Ved anvendelsen av våre rang-liste, ble den 90-persentilen for svulster valgt basert på utvalgsstørrelse analyse (111 svulster, 40 normaler). Normal vev som hadde en 95-persentilen 2 ble eliminert fra vår rang listen. Totalt 35,764 transkripsjoner møtte kriteriene ovenfor og ble rangert. For detaljer om metoden viser til Tomlins et. al [19].
Integrative epigenetikk
Vi rangert målgener fra Affymetrix U133 Plus 2.0 mRNA uttrykk plattformen ved COPA oppregulering på 90
th persentil (fra 111 svulster og 40 normal vev). Den U133 Plus 2.0 mRNA uttrykk plattform (Affymetrix, Santa Clara California) har ca 55.000 probe sett. En annen rang listen ble produsert ved å rangere gener i synkende rekkefølge av deres d-poengsum beregnet ved SAM følgende 5-aza /TSA behandling av normale lungecellelinjer (NHBE og SAEC). En tredje rang listen ble beregnet ved hjelp av 111 NSCLC og en ekstra expo datasett med 79 flere NSCLC primære tumorvev også kjøre på Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 mRNA uttrykk plattform. I disse 190 primær NSCLC prøvene, korrelert vi BORIS uttrykk mønstre innenfor hver svulst med uttrykk av alle transkripsjoner innlemmet i U133 Plus 2.0 matrise ved å beregne en korrelasjonskoeffisient ved hjelp av Excel. Alle genene ble deretter rangert basert på styrken av korrelasjonen mellom deres ekspresjon og at BORIS uttrykk for alle 190 prøver. Disse tre kilder til informasjon (genet sett demonstrerer oppregulering med 5-aza, COPA score, og BORIS korrelasjon) ble kombinert ved hjelp av en rang produkt (x * y * z). Disse tre rangeringene ble kombinert til å rangere alle mål og permutasjon av de data ble brukt for å etablere betydning med en terskel av α = 0,005, hvilket ga 290 betydelige gener. Genomiske sekvenser ble oppnådd for 122 av disse genene ved hjelp av UCSC genomet leseren, og tilstedeværelsen av CpG øyer i promotorene eller det første intron av disse genene ble bestemt ved MethPrimer som er avhengig av GC-innholdet i 50%, +, 100 bp, 0,6 observert å forventede CG s [20]
DNA ekstraksjon
prøver ble sentrifugert og spaltet i en oppløsning av detergent (natriumdodecylsulfat) og proteinase K, for fjerning av proteiner bundet til. DNA. DNA ble renset ved hjelp av fenol-kloroform ekstraksjon og etanol utfelling. DNA ble deretter resuspendert i 500 pl Lote (EDTA 2,5 mmol /L og Tris-HCl 10 mmol /L) og lagret ved -80 ° C inntil bruk.
Bisulfite Behandling og sekvense
2 ug av DNA fra 28 NSCLCs og 11 normale lungevev ble utsatt for sulfitt behandling med EpiTect® bisulfite Kit (Qiagen, Valencia, CA) i henhold til produsentens instruksjoner. Dette sulfitt-modifiserte DNA ble så lagret ved -80 ° C. Deretter ble sulfitt-behandlet DNA forsterket ved hjelp av primere designet av MethPrimer å spenne områder av CpG øyer i promoter eller første intron [20]. Primer sekvenser ble designet for å ikke inneholde CG dinukleotider. Primersekvenser er tilgjengelige i tabell S1. Trykk ned PCR ble utført og produktene ble gel-renset ved hjelp av QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Valencia, CA), i henhold til produsentens instruksjoner. Hver forsterket DNA-prøve ble påført med nestede primere til Applied Biosystems 3700 DNA analysator bruker BD terminator fargestoff (Applied Biosystems, Foster City, CA).
Kvantitativ RT-PCR
Total RNA ekstrahert som beskrevet ovenfor, og konsentrasjonen for hver prøve ble målt. 1 ug av RNA ble deretter anvendt for cDNA-syntese utført ved anvendelse av oligo-dt med Superscript First-Strand Synthesis Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA). De endelige cDNA produkter ble brukt som maler for påfølgende RT-PCR med primere designet spesielt for hver kandidat genet. 18s rRNA ble undersøkt for å sikre nøyaktig relativ kvantifisering i kvantitativ RT-PCR. Hvert forsøk ble utført i tre eksemplarer med TaqMan 7900 (ABI) real-time PCR maskinen og QuantiFast SYBR Grønn PCR Kit (Qiagen, Valencia, CA) i henhold til produsentens instruksjoner. Primer sekvenser er tilgjengelig i tabell S1.
Kvantitativ Unmethylation Spesifikke PCR (QUMSP)
For å selektivt forsterke demetylerte promoter regioner i gener av interesse, primere ble utformet ved hjelp av data fra bisulfite sekvensering av primære svulster som er inkludert bare for bisulfitt-konvertert sekvenser kjent for å demetyleres i tumorer. Primer kombinasjoner ble validert ved hjelp av
in vitro
metylert og demetylerte kontroller. Disse forsøkene ble utført in triplo ved bruk av TaqMan® 7900 (ABI) real-time PCR maskin med standardkurver og normalisering overfor beta-aktin-primere som ikke inneholder CpG er i sekvensen for kvantifisering. Primer sekvenser er tilgjengelig i tabell S1.
Transfeksjon av menneskelig uttrykk vektorer og AD Vekst analysen
En full-lengde ORF cDNA av SBSN og NY-ESO-1 ble oppnådd for forbigående trans fra Origene i en pCMV6-Entry vektor (Rockville, Maryland). Cellelinjer ble sådd ut i 5 x 10
5-celler /brønn ved anvendelse av 6-brønns plater og transfektert med enten tom vektor eller en vektor inneholdende genet av interesse ved hjelp av Fugene 6 Transfection Reagent (Roche, Basel, Sveits) i henhold til produsentens protokoll. Celletelling leder-8 (CCK-8) (Dojindo, Rockville, Maryland) absorbans ble målt ved Spectramax M2E 96-brønners fluorescens plateleser Molecular Devices (Sunnyvale, California). Alle AD vekstforsøk ble utført i tre eksemplarer for alle cellelinjer og vektorer.
Anchorage-Uavhengig Vekst analysen
soft agar analysene ble utført etter transfeksjon av celler med pattedyr pCMV6-Entry ekspresjonsvektorer som inneholder en G418 motstand kassett (Origene). Cellene ble tellet og omtrent 5000 ble tilsatt til hver 6 brønners plate. Bunnlaget besto av 0,5% agar, RPMI + 10% FBS, mens cellene ble suspendert i et toppsjikt av 0,35% agar, RPMI + 10% FBS og G418 (300 ug /ml). Soft agar assays ble inkubert ved 37 ° i 12 dager. Alle forsøkene ble utført i tre eksemplarer for alle cellelinjer og vektorer.
Statistical Analysis
Vi så etter likheter i metylering mønstre mellom gener ved å utføre en analyse av sammenhenger mellom QUMSP målinger på gener på tvers alle prøvene. Spearmans korrelasjon permutasjon testing ble anvendt sammen med 1000 permutasjoner av prøvene for å etablere betydning, med α = 0,05. For ekspresjon av data, vi log-transformerte data og de normaliserte korrelasjonsanalyse utført på alle prøver mellom hvert av genene i studien. Betydning ble bestemt ved å anta en normalfordeling i logg-transform uttrykk nivåer og bruke Student t-fordeling med en alfa på 0,05. Alle analyser ble utført ved hjelp av Matlab.
Resultater
A Novel Integrative epigenetisk tilnærming til skjerm for CTAs og relaterte epigenetiske regulerte gener
Vi utviklet en integrerende høy gjennomstrømning tilnærming til skjerm for CTA og andre koordinert uttrykte gener basert på tre viktige tidligere publiserte faktorer: (1) CTAs uttrykkes i kimlinje-celler og mange tumorer, men ikke i normale somatiske vev [1], [21], (2) CTAs ha promoter CpG øyer som er metylert og dempede i normal somatiske vev, men, eksperimentelt, kan uttrykkes ved promoter demetylering [1], [10], [11], [12] og (3) en transkripsjonsfaktor BORIS har vist seg å indusere de -repression av flere oppfordringer i NSCLC og andre tumor /vevstyper (figur 1A) [22], [23], [24], [25].
(A) Skjematisk skisse av integrerende epigenetisk screening strategi benyttet i denne studien som kombinert den farmakologiske demetylering av normale cellelinjer, sammen COPA anaylsis i grunnskolen vev og korrelasjon av genekspresjon med epigenetisk regulator BORIS i primær vev. (B) Representant COPA graf av
MAGEA12
demonstrere den statistiske tilnærmingen som brukes for å finne kandidat overexpressed CTAs og beslektede gener. Forskjellen i tumor sammenlignet med normal ekspresjon var signifikant, p-verdi 0,00001 målt ved hjelp av Mann-Whitney U-test. (C) Upfold regulering av mRNA-ekspresjon i behandlede normale lungecellelinjer, NHBE og SAEC, målt ved Affymetrix Human Genome U133 Plus 2,0 mRNA-ekspresjon plattformen.
Den første arm i vår tilnærming screening involverte farmakologisk demetylering av 2 normal lungecellelinjer, Normal menneskelig Bronkial epithelial (NHBE) and human Small Airway epithelial (SAEC) celler (Lonza, Walkers, MD), ved hjelp av en 5-aza /TSA behandlingsprotokoll som tidligere har vært vellykket i å definere kandidat tumorsuppressorgener etter demethylating tumorcellelinjer. Med den forståelse at CTA dempes ved metylering i normalt vev, anvendte vi normale cellelinjer for å identifisere gener som vanligvis er undertrykt i normalt vev, men kan re-uttrykkes ved farmakologisk manipulasjon. To normale lungecellelinjer, NHBE og SAEC, ble behandlet med 5 uM 5-aza deoksycytidin i 72 timer og Trichostatin A i 24 timer før høsting total RNA for ekspresjon rekke analyse ved hjelp av Affymetrix Human Genome U133 Plus 2,0 uttrykk plattform. Disse resultatene ble deretter analysert ved anvendelse dChip og Betydningen Analyse av mikromatriser (SAM) [17], [18]. Gener ble rangert basert på deres SAM poengsum (d). SAM også rapportert ganger endring i bety uttrykk av målgener i 5-aza /TSA behandlingsgruppen versus kontrollgruppen (figur 1B).
Vi samtidig analyserte data fra 40 normal lunge og 111 NSCLC uttrykk mikromatriser fra Expo datasett (alle kjøre på Affymetrix human Genome U133 Plus 2.0 mRNA uttrykk plattform) offentlig tilgjengelig på nettet som en del av Gene Expression Omnibus (GEO /NCBI). For vår analyse av disse 151 primær vev uttrykk rekke datasett, brukte vi en teknikk kjent som Cancer avvikende Profil Analyse (COPA). COPA er en metode for å søke etter markert overekspresjon av bestemte gener som bare oppstår i en undergruppe av tilfellene, mens tradisjonelle analysemetoder basert på standard statistiske tiltak mislykkes i å finne gener med denne typen uttrykk profil [19]. COPA var en spesielt nyttig metode for oss å søke etter CTAs og gener med liknende uttrykk profiler basert på tidligere studier som viser at CTA er heterogent uttrykk både på tvers av et bredt pasientpopulasjon og innen enkelt vevsprøver [26], [27], [28] . Gener med normalt vev COPA uttrykk skalert poengsum 2 på 95-persentilen ble eliminert fra rang listen. Alle gjenværende gener ble så rangert basert på deres COPA poengsum på 90
th persentil; statistisk signifikans av uttrykket forskjeller i Copa diagrammer ble målt ved Mann-Whitney U-test (figur 1C).
For den siste arm av våre screening tilnærming, brukte vi tidligere datasett med 111 NSCLC og en ekstra Expo datasett med 79 flere NSCLC primære tumorvev også kjøre på Affymetrix human Genome U133 Plus 2.0 mRNA uttrykk plattform. I disse 190 primær NSCLC prøvene, korrelert vi BORIS uttrykk mønstre innenfor hver svulst med uttrykk av alle transkripsjoner innlemmet i U133 Plus 2.0 matrise ved å beregne en korrelasjonskoeffisient ved hjelp av Excel. Alle gener ble så rangert basert på styrken av sammenhengen mellom deres uttrykk og at BORIS uttrykk på tvers av alle 190 prøver.
Tre rang listene ble produsert ved å rangere gener ved SAM poengsum (d) etter 5-aza /TSA behandling i normale lungecellelinjer, COPA poengsum i grunnskolen vev, og BORIS korrelasjon i primær vev. Disse 3 rang listene ble kombinert ved hjelp av en rang produkt (x * y * z). Ved hjelp av en betydning terskel (α = 0,005) og påfølgende tilfeldige permutasjoner av våre rang-lister, identifiserte vi 290 gener som var signifikant forskjellig oppregulert basert på epigenetisk screening og vev microarray uttrykk mønstre (Tabell S2) [29].
i utgangspunktet en
i silico
tilnærming utnytte MethPrimer ble brukt til å bekrefte tilstedeværelse av CpG øyer i promotorområdene våre toppkandidater [20]. Toppen 100 av de 290 viktigste genene samt 22 gener valgt basert på biologisk relevans i kreftrelaterte trasé ble valgt ut til å bli vist via denne tilnærmingen, og 101 ble funnet å inneholde 1 eller mer promoter CpG øyer.
Vi brukte en egen kohort av 11 normale lunge vev fra pasienter uten en kreftdiagnose for å bekrefte epigenetisk stanse via promoter metylering i normal lunge slimhinne fra pasienter uten en lunge svulst. Bisulfitt sekvensering av CpG øyer i promotorområdene av 55 utvalgte genet mål med CpG-øyer ble brukt til å bestemme status metylering. Bare 17/55 promoter-regionene viste fullstendig metylering ved alle sekvenserte CpG-stedene i alle eller nesten alle de normale vev (tabell S2). Disse målene ble deretter sekvensert bisulfitt i et separat kohort av 28 primær NSCLC for å søke etter tilstedeværelse av promoteren hypometylering. Av disse gjenværende mål, 10/17 viste arrangøren demetylering i noen brøkdel av tumorer inkludert:
MAGEA3 plakater (13/28, p = 0,0067),
MAGEA12 plakater (19/28, p = 0,0001 ),
MAGEA4 plakater (9/27, p = 0,0378),
MAGEA1 plakater (21/27, p = 0,0001),
SBSN plakater (13/28, p = 0,0067),
TKTL1 plakater (5/27, p = 0,2949),
MAGEA5 plakater (9/23, p = 0,0172),
ZNF711 plakater (21/24, p = 0,0001),
NY-ESO-1 product: (14/20, p = 0,0002),
G6PD plakater (17/18, p = 0,0014), (Fishers eksakte test, tosidig ) (Tabell 1 og Figur 2)
Synlig er bisulfitt sekvense resultatene med tilhørende p-verdier i 28 NSCLC tumorprøver og 11 normale lunge vev for:.
MAGEA3 plakater (13/28, p = 0,0067),
MAGEA12 plakater (19/28, p = 0,0001),
MAGEA4 plakater (9/27, p = 0,0378),
MAGEA1 plakater (21/27, p = 0,0001),
SBSN plakater (13/28, p = 0,0067),
TKTL1 plakater (5/27, p = 0,2949),
MAGEA5 plakater (9/23 , p = 0,0172),
ZNF711 plakater (21/24, p = 0,0001),
NY-ESO-1 product: (14/20, p = 0,0002),
G6PD
(17/18, p = 0,0014). I parentes er forholdet mellom demetylerte arrangører i svulster og p-verdiene som er beregnet av Fishers eksakte test sammenligne demetylering i tumorer vs normaler. Skraverte boksene representerer metylert arrangører, ND = metylering status bestemmes ikke av bisulfite sekvensering.
Transkripsjonell oppregulering av målgener etter 5-aza /TSA behandling i vår cellelinje systemet ble bekreftet ved hjelp av kvantitativ RT -PCR på 5-aza /TSA-behandlede normale celler sammenlignet med mock-behandlede celler for disse 10 gener (Figur S1). Hvert gen med unntak
MAGEA12
demonstrert betydelig oppregulering av 5-aza /TSA behandling i minst en cellelinje som støtter funksjonelt gen regulering av arrangøren hypometylering.
CTAs og tilknyttede gener er coordinately demetylert og Expression er korrelert med arrangøren Demety
for å bekrefte bisulfitt sekvense resultater i våre mål gener og for å gi et datasett av kontinuerlige variabler å uttrykke status for arrangøren demetylering, utviklet vi en rask, kvantitativ analyse for spesifikt å måle ikke-denaturert arrangører, som vi betegnes Kvantitativ Unmethylation Spesifikke PCR (QUMSP). Vi analysert DNA ekstrahert fra vår kohort av 28 primær NSCLC tumorprøver og 11 normale lungeprøver fra ikke-kreftpasienter (figur 3A). Betydelig tumor-spesifikke demetylering ble funnet i
MAGEA3 product: (p 0,005),
MAGEA12 product: (p 0,025),
MAGEA4 product: (p 0,018),
MAGEA1 product: (p 0,001),
TKTL1 product: (p 0,025) og
MAGEA5 product: (p 0,007). Ytterligere to mål litt savnet betydning ved α 0,05,
SBSN product: (p 0,07) og
NY-ESO-1 product: (p 0,09) (2 tailed t-test forutsatt ulik varians ).
(A) QUMSP ble gjennomført i vår kohort av 28 NSCLC og 11 normale lungevev. Forsøk ble utført in triplo, blir middelverdiene vist som representerer den andelen av unmethylated promotorer på en logaritmisk skala. Statistisk signifikant tumorspesifikt demetylering ble funnet i
MAGEA3
,
MAGEA12 product: (p 0,025),
MAGEA4 product: (p 0,018),
MAGEA1
(p 0,001),
TKTL1 product: (p 0,025) og
MAGEA5 product: (p 0,007). Ytterligere to mål litt savnet betydning ved α 0,05,
SBSN product: (p 0,07) og
NY-ESO-1 product: (p 0,09) (2 tailed t-test forutsatt ulike avvik ). (B) Arrangøren hypometylering (QUMSP) korrelasjon p-verdi matrise for NSCLC (n = 28; Spearmans korrelasjon permutasjon test). Skraverte celler representerer betydelige p-verdier.
Gitt tumor-spesifikke demetylering mønster sett for våre mål gener, siden ønsket vi å finne ut om demetylering av promotorområdene av disse genene skjedde i en koordinert måte innenfor tumorprøver. Vi utnyttet Spearmans korrelasjon permutasjon testing for å fastslå betydelig koordinert demetylering hjelp av QUMSP resultatene fra vår kohort av 28 NSCLC (figur 3B). P-verdien matrise av Spearmans korrelasjonskoeffisient viser at for hvilken som helst av målgener, demetylering tendens til å forekomme koordinert med et minimum av seks av de andre gener. Skraverte celler representerer betydelige p-verdier. Dette gir bevis for at demetylering er sterkt assosiert med koordinert regulering av disse CTAs og relaterte målgener i NSCLC, og sterkt antyder en epigenetisk mekanisme for aktivering.
For å bekrefte tumor spesifikke uttrykk for våre mål gener, brukte vi kvantitativ RT-PCR for å bestemme mRNA-ekspresjon i vår kohort av NSCLC og normalt lungevev (figur S2A-J). Seks gener hadde signifikant økt uttrykk i svulster
MAGEA12 product: (p 0,02),
SBSN product: (p 0,002),
TKTL1 product: (p 0,02),
ZNF711 product: (p 0,008),
NY-ESO-1 product: (p 0,001),
G6PD product: (p 0,006). Tre gener litt savnet betydning ved α 0,05 nivå:
MAGEA3 product: (p 0,09),
MAGEA4 product: (p 0,06) og
MAGEA1 product: (p 0,08) (2 tailed t-test forutsatt ulik varians).
siden ønsket å finne ut om demetylering var ansvarlig for derepresjon av CTA og beslektede gener i NSCLC. Fire mål gener viste en signifikant positiv korrelasjon mellom mRNA uttrykk (kvantitativ RT-PCR) og promoter hypometylering (QUMSP):
MAGEA12 product: (p = 0,024),
MAGEA4 product: (p 0,004),
SBSN product: (p = 0,004) og
NY-ESO-1 product: (p 0,004) (figur S3A-D) (Spearmans korrelasjon permutasjon test).
TKTL1 product: (p = 0,1),
MAGEA5 product: (p = 0,104) og
MAGEA3 product: (p = 0,2) viste også en positiv sammenheng mellom demetylering og uttrykk, men tapte betydning (tabell S3). Disse dataene antyder demetylering av promoter regioner er delvis ansvarlig for regulering av de fleste av våre målgener.
oppfordringer og Associated Target gener er coordinately Uttrykt
Gitt resultatene i de tidligere analysene av vår kohort av primære vev som viser at disse målgener er forskjellig uttrykt i tumorer, er deres promoter regioner coordinately demetylert innen svulster og uttrykk er korrelert med demetylering, undersøkte vi vår første kohort av 111 svulster analysert ved hjelp av Affymetrix human Genome U133 Plus 2.0 mRNA uttrykk plattform for å finne ut om våre mål gener ble coordinately uttrykt innenfor tumorprøver i denne store prøvesett. Figur 4A viser et kart over varmetranskript uttrykk som målt ved hjelp av U133 Plus 2,0 array for 40 normale lungeprøver fra ikke-cancerpasienter og 111 sampler NSCLC primære vev. Dette tallet visualiserer forholdet mellom uttrykk mellom 10 målgener i normale og tumorprøver. Dataene ble først normalisert ved å sette den middelverdi og standardavvik for hvert gen til 0 og en på tvers av henholdsvis alle 151 prøver. Dataene ble deretter gruppert i testdomenet ved hjelp av hierarkisk clustering med gjennomsnittlig hydraulikk og et euklidsk avstand beregning. Dette ga tre klynger: 1) alle 40 normale prøver, 2) 43 av de 111 tumorprøver som viser høy uttrykk i de fleste av genene og sterke sammenhenger mellom dem (Tumor 1), og 3) 52 av 111 tumorprøver som viser lavere uttrykk, men med uttrykket fortsatt over normaler (Tumor 2). De gjenværende 16 av 111 tumorprøver ikke virker sammen eller i disse gruppene. Denne analysen ikke bare gitt bekreftelse på at ekspresjon av våre målgener er begrenset til et delsett av tumorer med liten eller ingen ekspresjon i normalt vev, men også at disse mål synes å være koordinert til uttrykk i en stor undergruppe, 38,7%, av disse -tumorer.
(A) Varme kart over transkript uttrykk som målt ved Affymetrix human Genome U133 Plus 2,0 mRNA-ekspresjon plattform.
