Abstract
Småcellet lungekreft (SCLC) er en aggressiv kreft med begrensede behandlingsalternativer. Vi har tidligere funnet at PARP er overuttrykt i SCLC og at målretting PARP reduserer cellelinje og tumorvekst i prekliniske modeller. Imidlertid SCLC-cellelinjer med PI3K /mTOR sti-aktivering var forholdsvis mindre følsom for PARP-inhibering. I denne studien har vi undersøkt proteomikk endringer i PI3K /mTOR og andre veier som forekommer følgende PAPR hemming og /eller knockdown
in vitro Hotell og
in vivo
. Ved hjelp av revers-fase protein array, fant vi proteiner mest signifikant oppregulert etter behandling med PARP-hemmere olaparib og rucaparib var i PI3K /mTOR sti (p-mTOR, p-AKT, og PS6) (p≤0.02). Videre blant de mest signifikant nedregulert proteiner var LKB1 og dens mål AMPK og TSC, noe som negativt regulerer PI3K veien (p≤0.042). Etter PARP knockdown i cellelinjer, fosforylert mTOR, ble AKT og S6 forhøyet og LKB1 signale ble redusert. Global ATP konsentrasjoner økte følgende PARP hemming (p≤0.02) fører oss til hypoteser om at den observerte økte PI3K /mTOR sti aktivering følgende PARP hemming resultater fra redusert ATP bruk og en påfølgende reduksjon i stressrespons signalering via LKB1. Basert på disse resultatene, vi deretter undersøkt om co-målretting med en PARP og PI3K inhibitor (BKM-120) ville fungere bedre enn både monoterapi alene. Et flertall av SCLC cellelinjer var følsomme for BKM-120 ved klinisk oppnåelige doser, og cMYC uttrykk var den sterkeste biomarkør respons. Ved klinisk oppnåelige doser av talazoparib (den mest potente PARP hemmer i SCLC klinisk testing) og BKM-120, ble en additiv effekt observeres
in vitro
. Når testet i to SCLC dyremodeller, ble en større enn additiv interaksjon sett (p≤0.008). Dataene som presenteres her tyder på at å kombinere PARP og PI3K hemmere forsterker effekten av begge substansene alene i prekliniske modeller for SCLC, berettiger videre undersøkelser av slike kombinasjoner i SCLC pasienter
Citation. Cardnell RJ, Feng Y, Mukherjee S , Diao L, Tong P, Stewart CA, et al. (2016) Aktivering av PI3K /mTOR Pathway følgende PARP Hemming i småcellet lungekreft. PLoS ONE 11 (4): e0152584. doi: 10,1371 /journal.pone.0152584
Redaktør: Javier S. Castresana, Universitetet i Navarra, SPANIA
mottatt: 09.11.2015; Godkjent: 15 mars 2016; Publisert: 07.04.2016
Copyright: © 2016 Cardnell et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av MD Anderson Cancer Center Support Grant (NIH P30 CA016672); University of Texas-sørvestre og MD Anderson Cancer Center Lung SPORE (5 P50 CA070907); gjennom sjenerøse filantropiske bidrag til The University of Texas MD Anderson Lung Cancer Moon Shot Program; NIH 1R01 CA168484-01 (JVH); David Bruton, Jr., Velsignet Stol (JVH); den Rexanna stiftelse for bekjempelse av lungekreft (https://www.rexannasfoundation.org/) (JVH); MD Anderson Cancer Center Lege Scientist Award (LAB); Lee Clark Fellowship of The University of Texas MD Anderson Cancer Center, støttet av Jeane F. Shelby Scholarship Fund (LAB); en NCI Cancer Clinical Investigator teamet Leadership Award (P30 CA016672) (LAB); Den Sheikh Khalifa Bin Zayed Al Nahyan Institutt for personlig Cancer Therapy tallet (IPCT s) for profesjonell utdanning og opplæring (LAB); National Lung Cancer Research Partnership, gjort mulig ved North Carolina Lung Cancer Partnership (https://www.freetobreathe.org/) (LAB); Lung Cancer Research Foundation (https://www.lungcancerresearchfoundation.org/) (LAB); LUNGevity Foundation (https://www.lungevity.org/) (LAB); og The Sidney Kimmel Foundation for Cancer Research (https://kimmel.org/) (LAB). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. YF og YS er ansatt i Biomarin Pharmaceutical Inc. JVH sitter i rådgivende styrene AstraZenica, AbbVie, Novartis og Genentech. Dette endrer ikke vår tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Småcellet lungekreft (SCLC) er den mest aggressive formen for lungekreft, med en 5-årig overlevelse på bare 6% [1]. Det er ca 30 000 dødsfall fra SCLC årlig i USA (som utgjør 13% av lungekrefttilfellene), noe som gjør SCLC alene 8
th største årsaken til kreftdød i USA i 2011 [2, 3]. De fleste tilfeller av SCLC svare på kjemoterapi og strålebehandling i utgangspunktet. Men tilbakefall nesten universell, og i et flertall av pasientene ytterligere systemisk behandling gir ingen respons. I motsetning til ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), SCLC har for tiden ingen godkjente målrettet terapi med påvist nytte for pasientene. Derfor er utviklingen av nye, aktive og potensielt målrettede medikamenter for behandling av SCLC representerer et stort udekket medisinsk behov.
Vi har tidligere rapportert at poly-ADP ribose polymerase 1 (PARP1) er overuttrykt i SCLC, identifisere PARP som en potensiell terapeutisk mål i denne kreft [4]. Videre arbeid av vår gruppe har vist at PARP1 /2-hemmere talazoparib (BMN 673), olaparib (AZD2281), og rucaparib (CO-338, AG 014 699) har mono aktivitet i prekliniske modeller [4, 5]. Mens PARP-inhibitorer er i sent stadium utvikling for behandling av ovariekreft (olaparib godkjent, rucaparib fase 3), Basert på disse prekliniske data, blir flere kliniske studier av PARP-inhibitorer blir utført i SCLC for å undersøke effekten av disse stoffene som enkle midler eller i kombinasjon med kjemoterapi (fase i-talazoparib, fase II olaparib og veliparib) [6]. I fase I studier av mono talazoparib, observerte vi partielle responser i en undergruppe av pasienter med residiverende SCLC [7]. Men som med andre målrettede medikamenter, identifisere mekanismer forbundet med medfødt og ervervet narkotika motstand og rasjonelle kombinasjoner for å øke svarprosenten og /eller varighet er avgjørende for å optimalisere klinisk anvendelse av disse stoffene [7, 8].
i tidligere pre-klinisk arbeid, ved hjelp av et panel på 8 SCLC-cellelinjer vi korrelert cellelinje følsomhet for PARP-inhibering til hver cellelinje er proteomikk profil [5]. Cellelinjer med størst aktivering av PI3K /mTOR sti var den minst følsomme for talazoparib; med fosforylert (p) -AKT (T308) og p-AKT (S473) som de beste merkene av motstand [5]. Genetiske endringer i PI3K /mTOR sti er ikke uvanlig i SCLC [9, 10], med typisk gjensidig utelukkende endringer i
PIK3CA
,
PTEN
,
akt2
,
akt3
,
RICTOR
, eller
mTOR
funnet i 36% av pasientene [10]. Prekliniske rapporter har vist PI3K hemmere som PIK75 og PF-4989216 å ha aktivitet i SCLC modeller med
PIK3CA
mutasjoner, men ikke
PTEN
mangel, noe som indikerer en mulig rolle for PI3K /mTOR-målrettet terapi i SCLC [11, 12]. Relatert til dette funnet, har tidligere rapporter i brystkreft vist at behandling med en PI3K inhibitor forsinket tumorvekst, men økt indikatorer på DNA-skader som poly-ADP ribose (PAR) [13, 14]. Mens PARP-inhibering alene i disse brystkreft modellene bare moderat dempet vekst, kombinasjonen av PARP og PI3K-inhibering var spesielt potent til å undertrykke vekst [13, 14].
proteomikk analyse viste en invers korrelasjon mellom aktiviteten av PI3K /mTOR vei og som reaksjon på talazoparib
in vitro product: [5], hypotese vi at tilsetningen av PI3K /mTOR-inhibering kan videre sensitiv SCLC til PARP-inhibitorer. Vi først undersøkt i SCLC cellelinjer den intracellulære respons til PARP hemming, observere økt PI3K /mTOR signal følgende PARP-hemming.
I denne studien viser vi for første gang at PI3K /mTOR signal øker etter hemming av PARP i SCLC og at dette kan bli kjørt gjennom en reduksjon i lever kinase B1 (LKB1) signale-endringer godkjennes av PARP1 knockdown. Derfor undersøkte vi de antitumor effekten av å kombinere en PARP hemmer med PI3K-spesifikk hemmer i prekliniske modeller av SCLC. Kombinasjonsstudier rettet mot PARP og PI3K
in vitro
viste en additiv interaksjon mellom disse to hemmere i spredningsanalyser. Dyrestudier viser at denne kombinasjonen har større effekt enn enten stoffet alene redusere tumorvolum, noe som gir en sterk begrunnelse for fremme av denne kombinasjonen i kliniske studier i SCLC pasienter.
Materialer og metoder
cellelinjer
Menneske SCLC cellelinjer COR-L88, DMS1114, DMS 153, DMS 53, DMS 79, H1048, H1092, H1105, H128, H1341, H1417, H1436, H146, H1672, H1836, H187, H1876 , H1930, H196, H1963, H2081, H209, H211, H2141, H2171, H2195, H2227, H2330, H250, H345, H378, H446, H510, H524, H526, H69, H719, H748, H774, H82, H841, H847 , H865, H889, og SHP-77 ble oppnådd fra ATCC (Manassas, VA) eller Sigma-Aldrich (St. Louis, MO); GEMM-avledede cellelinjer KP1, KP3, Kp11, og Kp12 [15] og human pasient-avledet xenograft (PDX) avledet cellelinje NJH29 ble alle generøst tilveiebragt av dr Julien Sage (Stanford University, Stanford CA). Alle celler ble dyrket i slått medium supplert med føtalt bovint serum og penicillin /streptomycin. Celler ble passert for mindre enn 6 måneder etter mottak.
Protein analyse
For RPPA og western blot analyse ble cellene behandlet i to eksemplarer med 1 um olaparib (Selleck Chemicals, Houston TX), rucaparib ( Selleck Chemicals, Houston TX), eller talazoparib (Biomarin Pharmaceutical Inc, Novato CA). Western blot ble analysert for PARP1 (cs9542), mTOR pS2448 (cs2971), mTOR (cs2983), AKT pT308 (cs9271), AKT (cs9272) S6 pS240,244 (cs2215), S6 (cs2217), LKB1 (cs3050), AMPKα pT172 (cs2532), AMPKα (cs2532) (Cell Signa technlogy, Danvers MA), og aktin (sc1616, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX).
Omvendt fase protein array-
protein lysates var samles i en buffer inneholdende 1% Triton X-100, 50 mmol /l HEPES (pH 7,4), 150 mmol /l NaCl, 1,5 mmol /l MgCl
2, 1 mmol /liter EGTA, 100 mmol /l NaF, 10 mmol /l Nappis, 10% glycerol, 1 mmol /l PMSF, 1 mmol /l Na
3VO
4, og 10 mg /ml aprotinin. Prøvene ble kvantifisert og protein arrays ble skrevet ut fra lysatene og farget som tidligere beskrevet [4, 16]. Kort fortalt ble de lysbildene kvantifisert ved hjelp MicroVigene 4,0 (VigeneTech, Carlisle, MA). Spotnivå rådata ble behandlet ved hjelp av R-pakken SuperCurve [17-19], som returnerer den estimerte proteinkonsentrasjonen (rå konsentrasjon) og en kvalitetskontroll (QC) score for hvert lysbilde. Bare glir med en QC poengsum 0,8 ble anvendt for genetisk analyse. Den rå konsentrasjonsdata ble normalisert ved median-sentre hver prøve på tvers av alle proteiner for å korrigere lasting skjevhet.
proliferasjonsanalyser
Cellene ble sådd ut i 96-brønners plater ved 2000 celler per brønn i triplikat for hver cellelinje. Etter 24 timer ble cellene i hver brønn behandlet i 24 timer med en PARP hemmer (talazoparib) og /eller PI3K hemmer (BKM-120, Selleck Kjemikalier, Houston TX) eller med kjøretøy kontroll. Fire dager senere, proliferasjon ble analysert ved Cell Titer Glo (Promega, Fitchburg, WI). For enkelt-medikamentbehandlinger, midlere inhiberende konsentrasjon (IC
50)-verdier ble beregnet ved den drexplorer programvare [20]. Nærmere bestemt, for hver legemiddelkombinasjon (ved hvert dosenivå), ble effekten observert (eller eksperimentelt) av kombinasjonen sammenlignet med den forutsagte additive effekt. Dataene ble deretter presentert som en prosentandel av den eksperimentelle effekt i forhold til den forutsagte additiv effekt (1,1 = + 10%; 1 = 0%, 0,9 = -10%). For eksempel, hvis legemiddel A reduseres i forhold proliferasjon til 0,8 og medikament B til 0,7, og deretter den forutsagte additive effekt ville være 1 – ((1-0,8) + (1-0,7)) = 0,5. Dersom den observerte (eksperimentelt) Effekten av kombinasjonen på relative spredning er da 0,3, da den observerte effekten er større enn den antatte effekten av kombinasjonen [(1-0.3) /(1-0.5) = 1,4]. Ved hjelp av 10% over eller under den forventede additiv effekt som en cut-off, vi deretter tildelt følgende grupper: Observert /spådd 1,1 = større enn additiv; Observert /spådd 0,9 = mindre enn additiv; Observert /spådd ≤1.1 og ≥0.9 = additiv. For medikamentkombinasjoner, den MacSynergy II tilnærming [21] basert på Bliss Independence modell [22] ble gjennomført for å beregne ulike beregninger, inkludert synergistisk volum, antagonistisk volum, samlet volum, og ekstra kill prosent [23].
Gene knockdown
for stabil protein knockdown, lentiviral partikler som koder to forskjellige kort hårnål RNA (shRNAs) rettet mot PARP1 og rykke kontroll shRNA (pGIPZ lentiviral vektor, Open Biosystems en avdeling av Dharmacon /GE Healthcare, Lafayette CO) ble valgt og utpekt som PARP1-shRNA-en, PARP1-shRNA2, og SCR-shRNA, henholdsvis. De PARP1 shRNA sekvenser var som følger:
PARP1
-shRNA1: 5′-TAGTTGAACACACTTTCTT-3 «; PARP1-shRNA2: 5»-TGATGTTCCAGATCAGGTC-3 «.
STK11
(LKB1) shRNA sekvenser var som følger LKB1-shRNA1: 5′-GCATTAAAGCAGCGTATC-3 «; LKB1-shRNA2: 5 «ATTTATTGCCAAATTTGGG-3». De shRNA lentiviral Partiklene ble inkubert med målceller i 24 timer, og cellene ble deretter valgt i passende kulturmedium som inneholdt puromycin (2 ug /ml) i 3 uker. De resistente kolonier ble utvidet, og knockdown effektivitet ble validert ved QRT-PCR og Western blotting.
ATP kvantifisering
For å vurdere tilgjengeligheten av ATP, globale ATP konsentrasjoner ble målt i cellene behandlet eller ikke behandlet med en PARP-inhibitor. ATP-konsentrasjoner ble analysert ved ATPlite Luminescence System per produsentens instruksjoner (PerkinElmer, Inc., Waltham MA).
Poly ADP-Ribose (PAR) assay
For å evaluere effekten av PARP /PI3K inhibering på PARP1 aktivitet
in vivo
, lysater ble fremstilt fra xenotransplantater 2 timer etter medikamentavgivelse på dag 3 av behandlingen. Xenotransplantater ble fremstilt ved fremgangsmåten som er beskrevet i det neste ledd. PAR nivåer ble analysert ved ELISA per produsentens instruksjoner (Trevigen, Inc., Gaithersburg, MD).
Dyremodeller
Kvinne Balb /c nakne mus ble hentet fra Shanghai Lingchang Bioteknologi Co LTD (Shanghai, Kina) eller Harlan Laboratories (Houston, Texas). Denne studien ble utført i henhold til anbefalingene i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. Alle prosedyrer knyttet til dyr behandling, omsorg og behandling i denne studien ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) Shanghai Chempartner (protokoll nummer A998HL0001) eller ved University of Texas MD Anderson Cancer Center IACUC (protokoll nummer RM00001191-RN01). Alle forsøk ble gjennomført for å redusere dyrs lidelser. Humane NCI-H209-SCLC-celler (5 x 10
6-celler) eller NCI-H1048 tumorceller (3 x 10
6 celler) i 0,2 ml av en 1: 1 blanding av medium og matrigel ble injisert subkutant i høyre flanke av hver mus (36 dyr pr cellelinje). Når tumorer nådde ~ 150 mm
3 gjennomsnittlig volum, dyr (6 pr gruppe) ble behandlet oralt med bærer, talazoparib (0,25 mg /kg), eller BKM-120 (25 mg /kg) daglig i 28 dager. Tumorvolumet og dyr vekt ble målt hver 2 til 3 dager. En ytterligere 3 dyr i hver gruppe ble behandlet i 3 dager; xenografttumorer ble høstet fra og hurtigfrosset 2-3 timer etter behandling på dag 3 for videre analyse. Behandling Effektiviteten ble bestemt ved å sammenligne tumorvolumet fra medikamentbehandlede mus (At) med den fra mus behandlet med bærer (A C) ved å bruke forholdet (AT /A C) ved dag 19 for NCI-H1048 og dag 25 for NCI-H209 [ ,,,0],24] (siste måling av kjøretøy behandlede tumorer).
Resultater
PARP hemming
in vitro
øker PI3K signalisering i SCLC
å identifisere trasé modulert av PARP-hemming, utførte vi omvendt fase protein array (RPPA) som målte endringer i 137 totalt og fosforylerte proteiner i viktige onkogene trasé inkludert PI3K, MEK og DNA reparasjon i et panel av SCLC cellelinjer som ble behandlet med enten bil eller en PARP-hemmere olaparib ( AZD2281), rucaparib (CO-338, AG 014 699), eller talazoparib (BMN 673) i 24 timer. Analyse av cellelysater som samles før og etter behandling viste at fosforylering (aktivering) av proteiner i PI3K /mTOR-reaksjonsveien ble øket i de behandlede cellelinjer. RPPA analyse viste at av 137 totalt og fosforylerte proteiner målt, seks av de åtte proteiner som var mest signifikant oppregulert i respons til PARP hemming (FDR ≤0.1) var i PI3K /mTOR pathway (inkludert p-mTOR, p-AKT, og p-S6 [p≤0.02] (fig 1A og 1B) totale proteinnivået uendret etter RPPA (p≥0.27)). Talazoparib, som har en tilnærmet 10 ganger lavere IC
50 i SCLC enn olaparib eller rucaparib, induseres en tilsvarende reaksjon i H69-celler, som vist ved øket p-AKT T673 og p-S6 S240,244 etter behandling (fig S1 ).
(A) Hierarkisk clustering av proteiner identifisert i lysatene fra SCLC cellelinjer (H69, H82, H841) behandlet med kjøretøy eller olaparib i 24 timer avslørt økt aktivitet av PI3K /mTOR sti følgende PARP hemming ( FDR≤0.1, tilsvarende p-value≤0.037). (B) Individuelle fosforylerte proteiner i PI3K /mTOR sti (p-mTOR, p-AKT og p-S6 kinase) er økt etter behandling med enten olaparib eller rucaparib (p≤0.02). (C) Lysates fra cellelinjer som ble behandlet med olaparib eller rucaparib versus kjøretøy i 24 timer viser inaktivering av LKB1 pathway (LKB1, pAMPKα, og pTSC2, p≤0.042).
PARP hemming driver PI3K /mTOR aktivisering gjennom ATP /LKB1
Våre tidligere studier viste at i tillegg til PARP, SCLC cellelinjer overuttrykker også leveren kinase B1 (LKB1) [4]. Den LBK1 pathway er en stress-respons-mekanisme som aktiveres som reaksjon på metabolske påkjenninger slik som ATP uttømming for å beskytte cellen [25]. En konsekvens av LKB1 aktivitet er undertrykking av mTOR veien [25]. RPPA analyse av SCLC celler behandlet med olaparib viste en reduksjon i aktivitet av LKB1 veien (figur 1A). Videre analyser (fig 1C) viste at behandling med enten olaparib eller rucaparib betydelig redusert LKB1 uttrykk (p 0,001). Fosforylering av LKB1 nedstrøms mål, pAMPKα og pTSC2, ble også betydelig redusert etter behandling med PARP-hemmere (p = 0,022 og p = 0,042 med olaparib; p = 0,013 og p = 0,034 med rucaparib for pAMPKα og henholdsvis pTSC2,, total AMPK og TSC proteinnivået uendret målt ved RPPA, p≥0.81).
PARP-inhibitorer arbeide gjennom både den katalytiske hemming av PARP og et fenomen som kalles PARP-DNA fangst hvor PARP er fanget på stedet av en dobbel strandet pause (DSB) som forhindrer at DSB blir reparert og forårsaker direkte cytotoksisitet [26]. Derfor, for å se på effekten av PARP katalytisk hemming spesielt, vi slått ned
PARP1
genet ved lentiviral shRNA transduksjon i et panel av SCLC cellelinjer, inkludert en representant cellelinje fra in vitro-farmakokinetisk analyse og cellelinjer anvendt i dyrestudier (beskrevet nedenfor). PARP knockdown tillatt oss å ikke bare se direkte på den katalytiske hemming av PARP1, men også unngå potensielle off-target effekter av farmakologiske hemmere. Som vist i figur 2A, det knockdown betydelig redusert PARP1 ekspresjon sammenlignet med krafse shRNA (kontroll). Videre western blot analyse av
PARP1
shRNA knockdown cellelinjer viste økt mTOR, AKT, og S6 aktivitet i forhold til å rykke shRNA kontroll i alle cellelinjene som ble testet, til tross for H69 og H1048 ha aktive mutasjoner i
PIK3CA
. Vi bekreftet våre observasjoner i H69 knockdown celler ved hjelp av et begrenset RPPA panel analysere utvalgte proteiner (S2 Fig). I denne analysen, andre og tredje mest signifikante forskjeller mellom scramble- og
PARP1
shRNA-transduced celler ble redusert PARP1 og økt p-S6 (av 35 treff i
PARP1
KD1 og 52 i KD2 på FDR≤0.05). Den observerte økte i PI3K /mTOR signaliserer med kortsiktig farmakologiske og langsiktig genetisk tap av PARP1 funksjon forsterker oppfatningen at PI3K /mTOR aktivering er en effekt som er knyttet til den katalytiske hemming av PARP snarere enn PARP-DNA fangst. Romanen observasjon at PARP hemming eller knockdown aktiverer PI3K /mTOR sti i SCLC (figur 1) er i tråd med vår tidligere utgitt rapport at denne veien er den sterkeste markør av baseline resistens overfor PARP hemming [5].
(A) Lysates fra PARP1 knockdown av shRNA i SCLC cellelinjer (H69, H1048, H209) fører til økt aktivitet av PI3K /mTOR vei i forhold til å rykke ut (SCR) shRNA som bestemmes av western blot. (B)
PARP1
knockdown shRNA celler (KD1 og KD2) hadde lavere LKB1 og pAMPKα uttrykk enn krafse shRNA celler. (C) H69 og H1048 celler behandlet med olaparib viste økt [ATP], målt ved ATPlite assay. Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM; ** P 0,02, *** p 0,01. (D) En foreslått modell av PI3K veien aktivering følgende PARP-hemming.
Videre analyser av PARP1 aktivitet på LKB1 sti i SCLC cellelinjer viste at LKB1 uttrykk og fosforylering av AMPKα var både lavere i
PARP1
knockdown celler enn i celler behandlet med rykke shRNA (fig 2B).
PARP katalyserer polymeriseringen av ADP-ribose fra NAD + til å feste poly ADP-ribose (PAR) til giver proteiner i en prosess kalt PARylation [27]. Som PARylation av PARP er en ATP-intensive hendelse, hypotese vi at PARP hemming resultater i økning av tilgjengelig ATP, som igjen resulterer i redusert LKB1 pathway aktivitet og derfor et tap av PI3K /mTOR undertrykkelse. Ved hjelp av en luminescens-baserte assay, målte vi globale ATP-nivåer i SCLC-celler før og etter behandling med en PARP-inhibitor. Som vist i figur 2C, ble ATP-konsentrasjonen øket etter behandling med olaparib (1 uM, s 0,001 til 1 time). Den foreslåtte mekanismen for hvordan PARP hemming kan stimulere PI3K /mTOR vei via økt ATP tilgjengelighet og undertrykkelse av LKB1 veien er vist som figur 2D. Disse observasjonene stemmer overens med en fersk rapport som PARP1-mediert ioniserende stråling-indusert autofagi skjer gjennom aktivering av LKB1 /AMPK /mTOR vei [28] samt rapporter som viser at aktiveringen av PARP1 følgende alkylerende DNA-skader aktiverer LKB1 veien for å undertrykke PI3K signalering via uttømming av ATP-en effekt som er tapt etter PARP1 hemming [29, 30].
Talazoparib og en PI3K inhibitor kombinere additivt i SCLC
Utvidelse på våre tidligere observasjoner som en ) følsomhet for PARP hemming er relatert omvendt til PI3K /mTOR pathway aktivitet [5] og 2) PARP hemming økt PI3K /mTOR signalering, testet vi effekten av en PI3Kα inhibitor (BKM-120) i vårt panel av 50 SCLC anti-spredning cellelinjer. BKM-120 (en pan-klasse-1 P110α /β /γ /δ-hemmer) ble valgt fordi det ble brukt i en studie av en PARP /PI3K inhibitor kombinasjon i bryst /eggstokkreft (ClinicalTrial.gov Identifier: NCT01623349) og fordi en annen P110-spesifikk inhibitor (PIK75) har vist seg å ha mono aktivitet i noen SCLC-cellelinjer [12]. Som vist i figur 3A, IC
50 ble oppnådd i et flertall av cellelinjer testet (44/50), 35 av de på en klinisk dose oppnåelig mindre enn den rapporterte dag 1 C
maks 2.3μM [31 ].
(A) proliferasjonsanalyser viste et utvalg av overfølsomhet for BKM-120 over SCLC cellelinje panel. Cellelinjer med
PTEN
mutasjoner /slettinger er farget rød og de med
PIK3CA
mutasjoner grønne; klinisk C
max er indikert med en stiplet vannrett linje. # Indikerer IC
50 ikke nådd ved doser som ble testet. (B) Oppsummering av
PI3K /mTOR
mutasjon og
MYC
forsterkning status av cellelinjene (se fig S3 for cellelinjenavn). (C) Cellelinjer med enten en mutasjon i PI3K /mTOR-reaksjonsveien (MT) eller en
MYC
forsterkning (AMP) var mer følsomme overfor BKM-120 enn celler uten en mutasjon eller forsterkning (WT og IKKE- AMP; ** p. 0,02). (D) biomarkører ved hjelp av RPPA profiler av 47 SCLC cellelinjer korrelert protein uttrykk med BKM-120 IC
50 til å identifisere markører som predikerer respons. Spredning data er presentert som gjennomsnitt ± SEM.
For å finne ut hvilken rolle PI3K /mTOR pathway mutasjoner kan spille i følsomheten for BKM-120, identifiserte vi cellelinjer med slike mutasjoner. Celler med
PIK3CA
mutasjoner (n = 3, angitt i grønt i figur 3A) var assosiert med lavere IC
50 verdier, indikerer, som ville være forventet, at celler som er mer avhengig av PI3K /mTOR signalering for overlevelse er mer følsomme for et PI3K-inhibitor. Vi identifiserte også
akt2
,
RICTOR
, og
mTOR
mutasjoner i cellelinjer som var følsomme for BKM-120. Celler med
PTEN
endringer (n = 7, angitt i rødt i figur 3A) ble distribuert i hele serien av følsomhet, noe som tyder på at
PTEN
endringer korrelerer ikke med følsomhet. Frekvensene av mutasjoner i disse fem gener (som er oppsummert i figur 3B og S3 figur) er lik de som er publisert i en nylig undersøkelse av SCLC biopsiprøver [10]. Når gruppert sammen, cellelinjer med PI3K /mTOR pathway mutasjoner hadde signifikant lavere IC
50 verdier til BKM-120 enn ikke-muterte celler (figur 3C, p = 0,01).
For å identifisere potensielle proteomikk markører respons til BKM-120, analyserte vi sammenhengen mellom IC
50 til BKM-120 og basale uttrykk nivåer av 146 totalt eller fosforylerte proteiner ved RPPA. Som vist i figur 3D, Spearman korrelasjon identifisert cMyc protein uttrykk som toppen markør av følsomhet for BKM-120 (p 0,001); andre signifikant (p 0,05) markører for følsomhet inkludert p-cMyc, p-AMPKα, og p-ACC1. Videre analyse av BKM-120 følsomhets data viste at cellelinjer med kjent
MYC
forsterkning hadde signifikant lavere IC
50 (p = 0,01, figur 3C), validere proteomikk markør. Blant de sterkeste markører for motstand mot BKM-120 var proteiner implicating MAPK /ERK sti (pErk1 /2 (T202, Y204) Rho = 0,358, p = 0,014; pGSK3α /β (S21,9) Rho = 0,318, p = 0,032 ; pMAPK (T202, Y204) Rho = 0,317, p = 0,032). Aktivering av MAPK /ERK-reaksjonsveien etter hemming av PI3K er blitt observert i en rekke kreftformer [32], inkludert NSCLC [33] og brystkreft [32, 34]; denne effekten kan være mediert gjennom tap av AKT sin hemmende virkning på Raf [35]. Utover MAPK /ERK vei, de sterkeste markører for motstand mot BKM-120 var AKT og p-BAD (p 0,001) Interessant, BKM-120 IC
50-verdier ikke viser en sterk sammenheng med vår tidligere utgitt PI3K poengsum [5] (Rho = 0,101, p = 0,51), som er konsistent med publiserte observasjoner som følsomhet for pictilisib (GDC0941, en PI3Kα /δ-hemmer) viste ingen sammenheng med PI3K score i et panel av 60 hode og hals plateepitelkarsinom cellelinjer [36]. Disse observasjonene tyder på at aktivering av MEK (eller andre kompenserende /rømningsveier) kan være viktigere enn basal PI3K pathway aktivitet i å bestemme sensitiviteten til PI3K hemming.
Kombinasjonen av PARP og PI3K hemmere er rapportert å være svært aktiv i prekliniske modeller (pasient avledet xenograft og en
BRCA1 /Trp53
knockout spontan genmodifisert mus modell) av brystkreft [13, 14]. Basert på disse resultatene, en klinisk studie teste kombinasjonen av PARP hemmer olaparib og en PI3K inhibitor (pan-P110 BKM-120 eller P110α bestemt BYL719) ble igangsatt for brystkreft og eggstokkreft (NCT01623349). Foreløpige data viser toleranse av kombinasjonen [37] og klinisk nytte ved alle doser i minst olaparib + BKM-120 kohort [38]. Vi testet derfor effekten av en kombinasjon av talazoparib (PARP-inhibitor) og BKM-120 (PI3K-hemmer) ved klinisk oppnåelige doser i et panel av SCLC-cellelinjer med et utvalg av følsomhet (sensitive, mellomliggende og motstandsdyktig) til både BKM-120 og talazoparib (følsomhet for talazoparib vist i S4 figur). Seks doser av talazoparib (range 0,1-30 nm) og tre doser av BKM-120 (område 0,1-1 mm) ble testet i hver cellelinje. For hvert dosenivå, sammenlignet vi effekt på proliferasjonen med den forutsagte additive effekt. Sprednings priser som var innenfor 10% av den anslåtte additiv effekt når det anses «additiv», mens hvis med sprednings prisene mer enn 10% over eller under den forventede additiv effekt ble ansett som «mindre enn additiv» eller «større enn additiv» (fig 4A ). Som et eksempel, viser figur 4A representative cellelinjer med et «additiv» respons (H211, DMS-79) eller en «større enn additiv» respons (H1930). Ved hjelp av denne tilnærmingen, viste vi en additiv interaksjon i 49 av de 50 SCLC cellelinjene som ble testet.
(A) proliferasjonsanalyser bruker klinisk oppnåelige doser av talazoparib (6 doser, rekkevidde 0,1-30 nM) og BKM-120 (3 doseringer, gående 0,1-1 pM) viste en additiv interaksjon i de fleste av de 50 SCLC-cellelinjene som ble testet. Eksempler additiv svar (H211, DMS-79), og en større-enn-additiv respons (H1930). (B) Degree (prosent) av hemming ovenfor (grønn) eller under (rosa) den predikerte additiv effekt (lilla) for hver cellelinje på tvers av alle klinisk oppnåelige doser. (C) Observert spredning i forhold til spådd additiv effekt på individuelle doser av BKM-120.
For å ta et globalt syn på samspillet mellom de to stoffene for hver cellelinje på tvers av alle doser, vi utført en videre analyse som kombinert graden (prosenten) av hemming over eller under den forutsagte additiv virkning fra alle mulige kombinasjoner. Ved hjelp av arealet under kurven (volum), har vi sammenlignet med den observerte og forutsagte additiv-verdier (som en prosentandel i forhold til forutsagt) ved for hver kombinasjon (med en enhet av uM
2%) positive og negative verdier ble deretter hver for seg summeres for hver cellelinje (figur 4B). For alle men tre cellelinjer, den samlede effekten av talazoparib + BKM120 kombinasjonen var innenfor et volum på ± 10% som falt innenfor den anslåtte additiv effekt, ytterligere støtter konklusjonen at disse stoffene var hovedsakelig additiv
in vitro
Drs.
