Abstract
aggressivitet av bukspyttkjertel ductal adenokarsinom (PDA) er preget av sin høye metastatisk potensial og mangel på effektive behandlinger, noe som er et resultat av en mangel på forståelse av de som er involvert i å fremme PDA metastaser mekanismer. Vi identifiserte Annexin A2 (ANXA2), et medlem av familien av Annexin kalsiumavhengige fosfolipid-bindende proteiner, som et nytt molekyl som fremmer PDA-invasjon og metastaser. Vi har funnet ANXA2 å være en PDA-assosiert antigen gjenkjent av etterbehandling sera av pasienter som viste en lengre overlevelse etter behandling med en PDA-spesifikk vaksine. Celleoverflaten ANXA2 øker med PDA utvikling og progresjon. Knockdown av ANXA2 uttrykk av RNA interferens eller blokkerer med anti-ANXA2 antistoffer hemmer
in vitro
invasjon av PDA celler. I tillegg, etter vaksinering pasientsera inhiberer
in vitro
invasjon av PDA-celler, noe som antyder at terapeutiske anti-ANXA2 antistoffer indusert av vaksinen. Videre er celleoverflate lokalisering av ANXA2 tyrosin-fosforylering 23 avhengig; og tyrosin fosforylering 23 er nødvendig for PDA invasjon. Vi demonstrerte at tyrosin 23 fosforylering resulterer i overflate ekspresjon av ANXA2 er nødvendig for TGFfi-indusert, Rho-mediert epitelial-mesenkymale overgang (EMT), som forbinder den cellulære funksjonen til ANXA2 som tidligere ble vist å være forbundet med små GTPase-regulert cytoskeletal rearrangementer , til EMT prosessen i PDA. Til slutt, ved å bruke mus PDA modellene viste vi at shRNA knock-down av
ANXA2
, en mutasjon ved 23 tyrosin, eller anti-ANXA2 antistoffer, inhibere metastaser PDA og forlenge overlevelse mus. Dermed ANXA2 er en del av en roman molekylære pathway underliggende PDA metastaser og et nytt mål for utvikling av PDA therapeutics
Citation. Zheng L, Foley K, Huang L, Leubner A, Mo G, Olino K, et al. (2011) Tyrosin 23 Fosforylering-Dependent Cell-Surface Lokalisering av Annexin A2 er nødvendig for invasjon og metastaser av kreft i bukspyttkjertelen. PLoS ONE 6 (4): e19390. doi: 10,1371 /journal.pone.0019390
Redaktør: Lin Zhang, University of Pennsylvania, USA
mottatt: 04.03.2011; Godkjent: 28 mars 2011; Publisert: 29 april 2011
Copyright: © 2011 Zheng et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av NCI SPORE i Gastrointestinal kreft P50 CA062924-14 (EMJ), Lustgarten Foundation (EMJ), Broad Foundation (EMJ), NCI R01 CA88058 (EMJ), Viragh Foundation, NIH 1K23 CA93566-01A1 (DL), ASCO Young Investigator Award (LZ), NIH 5T32 CA0090701-28 Training Grant (LZ), Sol Goldman bukspyttkjertelen Cancer Center (LZ). Dr. Jaffee er den første mottakeren av Dana og Albert «Cubby» Broccoli gaveprofessorat. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. Jeg har lest journalen politikk og har følgende konflikter: Under en lisensavtale mellom BioSante og Johns Hopkins University, er Universitetet rett til milepælsbetalinger og royalty på salg av vaksinen produktet beskrevet i dette manuskriptet. Vi har ikke noen andre relevante interessekonflikter å bli avslørt. P. Illei har gitt et foredrag sponset av Leica Microsystems. Dette endrer ikke vår tilslutning til alle de PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom (PDA) er fortsatt en dødelig kreft med en samlet 5-års overlevelse av mindre enn 5% [1]. Manglende evne til å diagnostisere tidlig, høy metastatisk potensial, og stoffet motstand konto for sin lav overlevelse. Selv om det er godt etablert at patogenesen av PDA følger trinnvise faser som viser økende mobilnettet atypi og akkumuleres klonale mutasjoner eller avvik uttrykk for onkogener eller tumorsuppressorgener som
K-Ras
,
p16
,
p53
,
og DPC4 /SMAD4 product: [2], har narkotika som er rettet mot disse molekylære forandringer ennå ikke oversatt til forbedret klinisk respons [3]. Den aggressive natur PDA er kjennetegnet ved sin høye forekomsten av metastaser ved tidspunktet for innledende diagnose og høy forekomst av tidlig metastaser etter kirurgisk reseksjon. Men lite er kjent om de molekylære mekanismene bak sin invasjon og metastatiske prosesser. En bedre forståelse av disse mekanismene er viktig for utviklingen av innovative og bedre behandlinger for PDA.
kreft immunterapi behandlingsmetoder er under utvikling for PDA. Vi har utviklet en allogen, granulocytt-makrofag-kolonistimulerende faktor (GM-CSF) sekrete PDA vaksine for pasienter med PDA [4], [5], [6]. Fase I og II studier som evaluerte denne vaksinen hos pasienter med resected PDA demonstrert både kliniske og immunologiske reaksjoner [4], [5]. Denne immunterapi tilnærmingen gitt immunisert lymfocytt reagenser for å identifisere nye PDA antigener som nå testes som mål for PDA terapi [7], [8]. De potensielle terapeutiske mål identifisert så langt har også gitt viktige ledetråder for studiet av molekylære mekanismene bak PDA utvikling og metastaser. Her kan vi rapportere anvendelsen av en funksjonell proteomikk tilnærming som er identifisert Annexin A2 (ANXA2) som en ny kandidat PDA mål av immunresponsen. I tillegg viser vi at tyrosin 23 fosforylering avhengig celleoverflate lokalisering av Annexin A2 er nødvendig for epitelial til mesenchymale overgang, invasjon, og metastaser dannelsen av PDAer.
Resultater
Identifikasjon av ANXA2 som en ny kandidat PDA tumorassosiert antigen og biomarkør
Vi brukte vaksinert sera fra to personer som demonstrerte både tegn på post-vaksinasjon cellulære immunresponser og forlenget sykdomsfri overlevelse (DFS) og total overlevelse (OS) i en fase II-studie av en GM-CSF sekresjon helcelle PDA-vaksine [4] for å screene hele celle utdrag fra PDA-vaksine cellelinjer som fungerte som proteomet. Proteinekstrakter ble separert ved to-dimensjonal elektroforese (2-DE); og immunoblot analyse ble utført for å sammenligne antigen anerkjennelse av før og etter vaksinering sera. Proteiner som gjenkjennes av post-vaksinasjon sera i forhold til pre-vaksinering sera ble identifisert ved massespektrometri. ANXA2 var et protein identifisert på post-vaksinasjon sera immunoblotter av både pasienter evaluert. For ytterligere å vurdere forekomsten av postvaksinasjons humorale responser til ANXA2 ble renset rekombinant ANXA2 brukes til skjermen før vaksinering og etter vaksinering sera fra 16 flere pasienter behandlet i denne fase II studie av både ELISA og Western blot (figur S1). Vaksineinduserte anti-ANXA2 antistoffer, målt ved en sandwich ELISA ble påvist i seks av syv pasienter som demonstrerte en DFS større enn 36 måneder [4], og bare i ett av de andre 9 pasienter som ikke viser langsiktig DFS ( tabell 1). Disse dataene gir det første bevis på at ANXA2 er et antistoff som mål for immunresponser mot PDA.
ANXA2 er rapportert å være overuttrykt i en rekke kreftformer, inkludert PDA sammenlignet med normalt vev [9]. Imidlertid er ANXA2 normalt en cytoplasma og lumenal bosatt protein i bukspyttkjertelen vev, og tidligere studier [9] ikke har bestemt om celleoverflaten ANXA2 uttrykk er en dominerende mønster i PDA vev. Derfor analyserte vi plasseringen av ANXA2 uttrykk ved immunhistokjemi (IHC) i resected svulster fra 52 av de 60 pasientene som ble behandlet i vår fase II studie for hvem prøver var tilgjengelig for farging. Vi fant ut at normal bukspyttkjertelen duktale epitelceller viser svak cytoplasma og lumenal farging av IHC, mens celleoverflate lokaliserte ANXA2 øker med progresjon fra Panin lesjoner til invasiv PDA (figur S2). Nærmere bestemt har 39 (75%) av 52 friske pankreas tumorvev prøvene som ble testet øket celleoverflate-ekspresjon av ANXA2 (figur S2). Disse dataene gir ytterligere støtte som ANXA2 overflate uttrykk er assosiert med PDA utvikling og kan derfor tjene som en immunologisk mål.
Hemming av ANXA2 undertrykker
in vitro
invasjon av PDA-celler
Vi neste undersøkt om celleoverflaten lokalisering av ANXA2 spiller en biologisk rolle i å tilrettelegge PDA invasjon. ANXA2 har blitt rapportert å binde membran-assosiert fosfolipider og har forskjellige cellulære funksjoner inkludert plasminogenaktivering, fibrinolyse, membrantransport, cytoskjelettet omleiring, angiogenese, celle adhesjon og migrasjon. ANXA2 fungerer også som en høyaffinitets-reseptor for flere ekstracellulære ligander som har vært implisert i utviklingen av kreft, invasjon og metastaser [10], [11], [12], [13]. For å direkte teste om ANXA2 er involvert i PDA invasjonen, ble ANXA2 uttrykk slått ned i PDA-celler ved RNA interferens (figur 1A). Knock-down av
ANXA2
trykt
in vitro
invasjon av PDA-celler i en Boyden kammer analysen (Figur 1B og figur S3). Induksjon av antistoffer mot ANXA2 som er observert hos vaksinerte pasienter med langvarig DFS (tabell 1) tyder på at anti-ANXA2 antistoffer kan ha en direkte anti-tumor effekt. Vi testet derfor både kanin polyklonale og mus monoklonalt anti-ANXA2 antistoffer og funnet ut at de kan spesifikt hemme
in vitro
invasjon av PDA-celler (figur 1C, D). Videre sera fra immuniserte pasienter som viste en post-vaksinasjon svar på ANXA2 tilsvar hemmet
in vitro
invasjon av PDA-celler (figur 1E). Dataene presentert hittil koblingen øker celleoverflate-ekspresjon av ANXA2 med PDA invasjon evne og antyder at vaksineinduserte antistoffresponser kan hemme dette aspektet av PDA progresjon. Men den mekanismen som ANXA2 mediert PDA invasjon skjer har ennå å bli utforsket. Interessant er det invasiv kapasitet på PDA-celler som ikke er korrelert med deres proliferative hastighet som tyder på en uavhengig mekanisme (fig S3). For å avdekke andre reguleringsmekanismer som står for invasjonen kapasitet på PDA-celler, vi videre undersøkt sub-cellulær lokalisering av ANXA2 i ulike PDA cellelinjer med fluorescerende farging med anti-ANXA2 antistoffer (figur S4). ANXA2 hovedsakelig er lokalisert til cellemembranen i alle åtte PDA-cellelinjer ble funnet å ha høy kapasitet invasjon, mens ANXA2 er til stede hovedsakelig i cytoplasma av cellelinjer med lav kapasitet invasjon (figur S4 og tabell S1). Disse dataene støtter videre en rolle for ANXA2 translokasjon fra cytosol til celleoverflaten /membran i styrke PDA celle invasjon.
A. Western blot analyse viser at
ANXA2
siRNA hemmer uttrykk for ANXA2 i en PDA cellelinje. Hele celleekstrakter fra Panc10.05 behandlet med kontroll siRNA og
ANXA2
siRNA henholdsvis ble utslettet av kanin polyklonale anti-ANXA2 antistoff (øvre panel) og av kanin polyklonale anti-GAPDH antistoff (nedre panel). B.
In vitro
invasjon analysen viser at
ANXA2
siRNA hemmer invasjonen kapasiteten på 10,05 PDA cellelinje. Invaderte celler ble målt ved hjelp av MTT-analyser og normalisert til total celle tall. C. Polyklonale anti-ANXA2 antistoffer hemme invasjonen kapasitet på Panc10.05 celler. D. mus anti-ANXA2 monoklonale antistoffer (mAb) hemme invasjonen kapasitet på mus Panc02 og menneske Panc10.5 celler. For C og D, kanin anti-ANXA2 antistoff, kanin kontroll-Ig, mus anti-ANXA2 mAb (klon: ZO14) eller mus isotype kontroll lgG1 ble tilsatt til kulturmediet til en sluttkonsentrasjon på 25 ug /ml i løpet av
in vitro
invasjon analyser, henholdsvis. E. Kun etter vaksinering sera fra pasienter (3.009 og 3.028) som demonstrerte anti-ANXA2 antistoffresponser, men ikke fra pasienter (3.037 og 3,039) som ikke viser anti ANXA2 antistoffresponser, hemmer invasjon av Panc10.05 celler. Pre- og post-vaksinasjon sera ble tilsatt til kulturmediet i et forhold på 1:50. Tredoble eksperimenter ble gjort for B-E.
Fosforylering av ANXA2 på Tyr23 fremmer celleoverflaten lokalisering av ANXA2 og invasjonen kapasitet på PDA-celler
ANXA2 er et substrat for Src kinase, som fosforylerer ANXA2 på Tyr23 både
in vivo Hotell og
in vitro product: [10], [11], [12], [13], og Tyr23 fosforylering har blitt foreslått å være viktig for normal celle-spredning og forgrening morfogenese [14], [15]. ANXA2 er også rapportert å være tyrosin-fosforylert når det lokaliserer til celleoverflaten under stress [16]. Siden ondartede celler ofte etterligner normale celler som har vært utsatt for en rekke av spennings stimuli, postulerer vi at ANXA2 blir translokert til celleoverflaten som en tyrosin-phophorylated protein i løpet av tumorgenese i tillegg. For å teste dette, elueres vi celleoverflaten brøkdel av ANXA2 fra Panc10.05 PDA celler, som har celleoverflaten lokalisering av ANXA2 (figur S4 og tabell S1), og fant celleoverflaten brøkdel av ANXA2 protein er faktisk en tyrosine- fosforylert protein (figur 2A). I motsetning til dette kunne ANXA2 ikke elueres fra celleoverflaten til Panc 3.11-celler, en PDA cellelinje som vist cytoplasmisk lokalisering av ANXA2 (figur S4). For å teste om fosforylering av ANXA2 på Tyr23 er viktig for sin lokalisering til PDA celleoverflaten, genererte vi et panel av plasmider uttrykker enten villtype ANXA2 (ANXA2
WT), den ANXA2 mutant protein (ANXA2
Y23A) hvori Tyr23 ble forandret til en alaninrest fremstilling av en ikke-phosphorylatable mutant, eller den ANXA2 mutante proteinet (ANXA2
Y23E) hvori Tyr23 ble endret til en glutaminsyrerest ligne konstitutiv fosforylering. Når Panc10.05-celler ble transfektert med disse plasmider uttrykker ANXA2 tagget av GFP [17], ANXA2
WT-GFP og ANXA2
Y23E-GFP som hovedsakelig er lokalisert til celleoverflaten til PDA-celler. I motsetning til dette, ANXA2
Y23A-GFP lokalisert til cytoplasmaet (figur 2B). Disse resultatene ble ytterligere bekreftet ved hjelp av et lentivirus til konstitutivt uttrykte ANXA2
WT, ANXA2
Y23A, eller ANXA2
Y23E i PDA-celler (figur S4). Samlet utgjør disse dataene viser at fosforylering på Tyr23 resultater i lokalisering av ANXA2 på celleoverflaten.
A. Panc10.05 og Panc3.11 celler ble enten inkubert med EGTA inneholdende buffer eller EGTA-fri buffer. To forskjellige elueringer fra to forskjellige PDA cellelinjer, som angitt, ble immunopresipitert med anti-ANXA2 antistoff (sporene 1-4) eller anti-fosfotyrosin (anti-pTyr) antistoff (kolonnene 9-12). Etter eluering, ble de to PDA-cellelinjer lyserte og lysatene ble immunoprecipated av anti-Ptyr-antistoff (sporene 5-8). B. GFP-merket ANXA2 i Panc10.05 celler. Øvre paneler: GFP signaler; nedre paneler: overlappet bilder av GFP signaler og DAPI farging av atomkjerner. C. FLAG-merket ANXA2 uttrykk i Panc10.05 celler transfektert med pcDNA-basert plasmid vektor alene (baner 1,5,9,13), plasmidet bærer ANXA2
WT-Flag (baner 2,6,10, 14), plasmidet bærer ANXA2
Y23A-Flag (baner 3,7,11,15), eller plasmidet bærer ANXA2
Y23E-Flag (baner 4,8,12,16). Hele celleekstrakter (WCE) (banene 1-4), cellemembranfraksjoner (banene 5-8, 13-16), eller cytoplasmiske fraksjoner (sporene 9-12) ble isolert ved biokjemiske fraksjonering fra den Panc10.05 PDA-celler, respektivt og immunopresipitert ved hjelp av enten anti-FLAG M2 antistoff (sporene 1-12) eller anti-fosfotyrosin antistoffer (anti-Ptyr) (sporene 13-16). Immunpresipitatene ble utslettet ved hjelp av anti-FLAG M2 antistoffer. D.
In vitro
invasjon av Panc10.05 celler. E.
In vitro
invasjon av Panc3.11 celler. For både D og E, ble celler transfektert med den tomme pcDNA-basert plasmid vektor (kolonnene 1,2), det plasmid som bærer ANXA2
WT-FLAG (spor 3), det plasmid som bærer ANXA2
Y23A-FLAG ( lane 4), eller plasmidet bærer ANXA2
Y23E-FLAG (kolonne 5). Lane 1 ble også transfektert med krafse siRNA kontroll. Lanes 2-5 ble også transfektert med
ANXA2
siRNA duplex. Resultater av dupliserte eksperimenter er vist.
For å finne ut om endringen i ANXA2 lokalisering som oppstår som følge av Tyr23 fosforylering påvirker invasjonen kapasitet på PDA-celler, et sett med plasmider som uttrykker eksogent FLAG-merket ANXA2 inkludert ANXA2
WT-FLAG, ANXA2
Y23A-FLAG, og ANXA2
Y23E-FLAG ble utviklet. Disse vektorene er RNA interferens motstandsdyktig på grunn av tause mutasjoner innenfor siRNA målområde. Panc10.05 PDA-celler transfektert med disse plasmider ble fraksjonert i cytoplasma og cellemembranfraksjoner (fig S4). Vi først bekreftet at bare ANXA2
WT-FLAG og ANXA2
Y23E-FLAG, men ikke ANXA2
Y23A-FLAG, lokalisere til cellemembranen fraksjonen (Figur 2C). Som forventet, er ANXA2
WT-FLAG protein tyrosin fosforylert i cellemembranen fraksjonen. Deretter fant vi at co-transfeksjon av pcDNA plasmid som uttrykker ANXA2
WT-FLAG eller ANXA2
Y23E-FLAG, men ikke ANXA2
Y23A-FLAG, med siRNA (for å hemme endogen ANXA2), reversert siRNA-mediert hemming av invasjonen av Panc10.05 celler (figur 2D). Men i celler med lav invasjon kapasitet og bare cytoplasma lokalisering av ANXA2, som Panc3.11 (tabell S1), co-transfeksjon med ANXA2
Y23E-FLAG omgår fosforylering reguleringsmekanisme ved å etterligne konstituerende fosforylering og fremmer invasjonen av Panc3.11 celler (figur 2E). Disse dataene antyder at Tyr23 fosforylert ANXA2 overfører PDA invasjon kapasitet.
ANXA2 bidrar til epithelial-Mesenchymale Overgang av PDA-celler
Fosforylert ANXA2 spiller en rolle i celle spredning i normale morphogenesis prosesser [14] [15]. Våre data så langt støtter en rolle for fosforylert ANXA2 i PDA invasjon. Den epitelial til mesenchymale overgang (EMT) regulerer normal morphogenic prosessen under embryonal utvikling og vev omstilling, og den første delen av invasjon og metastaser er foreslått for å etterligne EMT [18]. Derfor, søkte vi å bestemme hvorvidt ANXA2 er nødvendig for EMT i PDA-celler. EMT er karakterisert ved undertrykkelse av transkripsjonen av epitel-markører som E-cadherin og induksjon av mesenchymale markører som slug og vimentin. ANXA2 er blitt rapportert å formidle TGFp-aktivert EMT under prosessen med hjerteventil utvikling [19]. I tillegg er TGFp rapportert å indusere EMT i dyrkede PDA-celler [20], [21]. For å undersøke om ANXA2 har en direkte rolle i EMT ferd med å invadere PDA celler, en lentiviral vektor som inneholder
ANXA2
shRNA ble brukt for å oppnå en langsiktig undertrykkelse av ANXA2 i PDA-celler (Figur S3). Real-time PCR-analyse viste at E-cadherin ble undertrykt, mens slug og vimentin ble indusert under TGFB-indusert EMT i Panc10.05 celler med kontroll shRNA, men ikke i de som er smittet med
ANXA2
shRNA (figur 3A ). I tillegg ble E-cadherin protein uttrykk trykt i TGFB-behandlede celler med kontroll shRNA, men forble uendret i TGFB-behandlede celler som også uttrykte
ANXA2
shRNA (figur 3B, C). Som spådd, PDA celler uten
ANXA2
shRNA mister sin celle-celle adhesjon fenotype og spre rundt kulturen slip følgende TGFfi behandling, som minner om en EMT mønster (Figur 3B). Selv ANXA2 har ennå ikke vist seg å være involvert i SMAD4-mediert EMT, har det vist seg å være involvert i Rho (små GTPases) -mediert celle løsrivelse, en egenskap av EMT [15]. Derfor vurderte vi også om Rho formidler ANXA2-forbundet EMT i PDA og funnet ut at Rho aktiveringen ikke blir oppdaget i PDA celler med shRNA hemming av ANXA2 følgende TGFB behandling (Figur 3C). Disse resultater viser at tapet av ANXA2 ekspresjon fører til tap av TGFp-Rho-mediert EMT i PDA-celler.
A. Kvantitativ real-time PCR-analyse av E-cadherin, slug, og vimentin mRNA uttrykk i Panc10.05 PDA celler med og uten knockdown av ANXA2 av shRNA. De relative prosenter av mRNA uttrykk med TGFβ1 behandling versus uten TGFβ1 behandling vises. Dataene ble normalisert med β-aktin ekspresjon. B. Den samme par av PDA-celler som anvendes i panel A ble behandlet med TGFβ1 i 0, 36 eller 72 timer, henholdsvis, og deretter høstet for farging med anti-E-cadherin antistoff og PE-konjugerte sekundære antistoffer. DAPI ble brukt til å farge kjerner. C. Den samme par av PDA-celler som anvendes i panel A ble behandlet med TGFβ1 i 0, 36 eller 72 timer, henholdsvis, og deretter høstet. En fraksjon av celleekstrakt ble benyttet for Western blot-analyse, og ble farget med anti-E-caherin, anti-RhoA, B, C, eller anti-p-aktin-antistoffer som henholdsvis den interne kontrollen,. De resterende celleekstrakt gikk en dra ned analysen gjennom en affinitetskolonne som spesifikt binder aktivert, GTP-bundet former Rho. Dette ble etterfulgt av western blot analyse med anti-Rho-antistoffer. Legg merke til at anti-Rho antistoffene gjenkjenner Rho A, B og C, hvis molekylvekter er litt forskjellige, noe som resulterer i to bånd på gelen. Kontroll betegner cellene med kontroll shRNA;
ANXA2
shRNA betegner cellene med
ANXA2
shRNA. D. Kvantitativ real-time PCR-analyse av E-cadherin, slug, og vimentin mRNA uttrykk i et par Panc10.05 PDA cellelinjer infisert med lentivirus uttrykker villtype ANXA2 (ANXA2-WT) eller Y23A mutert ANXA2 (ANXA2-Y23A ), respektivt. De relative prosenter av mRNA uttrykk med TGFβ1 behandling (angitt med +) versus uten TGFβ1 behandling (indikert med -) vises. Dataene ble normalisert med β-aktin uttrykk.
Vi neste undersøkt om Tyr23 fosforylering er viktig for ANXA2-mediert EMT i PDA-celler. Det ble observert at den endogene ANXA2 ikke lenger lokaliserer til celleoverflaten i cellene som uttrykker tyrosin området tap variant ANXA2
Y23A (figur S4). I tillegg transfeksjon med ANXA2
Y23A-FLAG hemmer invasjonen av Panc10.05 celler (figur S4), noe som tyder på at ANXA2
Y23A har en dominant negativ effekt. I samsvar med publiserte data [22], fant vi at ANXA2
Y23A kan fortsatt binde seg til sin partner S100A10 /p11 [23] i cytosol, men ikke i cellemembranen (figur S5). Derfor kan overuttrykt, cytoplasma-lokaliserte ANXA2
Y23A beslaglegge all S100A10 /p11 i cytosol, og dermed overdragelse en dominant negativ effekt. Derfor drar nytte av den dominerende negative effekten av ANXA2
Y23A, og bruke denne ANXA2
Y23A mutant, ytterligere demonstrert vi at EMT er indusert av TGFB i celler som uttrykker ANXA2
WT, men ikke i celler som uttrykker ANXA2
Y23A (figur 3D). Dermed disse data viser videre at Tyr23 fosforylering av ANXA2 fremmer EMT av PDA celler og er en tenkelig mekanismen som ANXA2 lokaliserer til PDA cellemembranen og overfører potensialet for PDA celler til å invadere.
Expression og tyrosinfosforylering av ANXA2 kreves for PDA metastaser dannelsen
in vivo
Lokale invasjon av tumorceller er et kjent skritt i prosessen med metastasering. Våre data viser at ANXA2 muliggjør invasjon av PDA-celler
in vitro
. Vi har derfor anvendt en transplanterbar murin kreft i bukspyttkjertelen modell av metastaser (fig S6) for å vurdere rollen til ANXA2 uttrykk, fosforylering, og celleoverflate lokalisering i PDA metastase prosessen
in vivo
. I denne modellen 100% av musene dør med levermetastaser ved ca. 4-6 uker (figur 4A) etter milt injeksjon av 2 x 10
6 Panc02 murine PDA-celler. Panc02 celler infisert med en GFP uttrykker lentivirus bærer shRNA spesifikt for
ANXA2
knockdown eller kontroll shRNA ble sortert for GFP-positive celler ved FACS.
